劉玉玲，朱新霞，呂新華，孫輝

（1. 石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，綠洲城鎮(zhèn)與山盆系統(tǒng)生態(tài)兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832003；2. 烏魯木齊職業(yè)大學(xué)，新疆 烏魯木齊 830000）

鈣依賴蛋白激酶（calcium-dependent protein kinase， CDPKS）是Ca2+信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的主要感受器和效應(yīng)器，目 前 陸 續(xù) 在 擬 南 芥（Arabidopsis thaliana）[1］、水 稻（Oryza sativa）[2］、毛 果 楊（Populus trichocarpa）[3］、黃 瓜（Cucumis sativus）[4］、番茄（Lycopersicon esculentum）[5］、甜瓜（Cucumis melo）[6］、辣椒（Capsicum annuum）[7］、山核桃（Carya cathayensis）[8］等多種植物中發(fā)現(xiàn)，是植物中研究較多的一類多基因家族蛋白激酶，在植物生長(zhǎng)發(fā)育和逆境響應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。CDPKs在植物多個(gè)器官?gòu)V泛表達(dá)。如擬南芥AtCPK12在根、莖、葉、花和成熟果莢中表達(dá)，在干種子中不表達(dá)[9］，而B(niǎo)dCDPK9、BdCDPK18、BdCDPK3、BdCDPK22和BdCDPK10只在種子中表達(dá)，BdCDPK8和BdCDPK19在 根 和 種 子 中 表達(dá)，BdCDPK2和BdCDPK25在 莖 和 花 中 表達(dá)，BdCDPK7和BdCDPK17在根和莖中表達(dá)[10］。

脫落酸（abscisic acid，ABA）、赤霉素（gibberellin，GA3）、水楊酸（salicylic acid，SA）、H2O2是逆境防御系統(tǒng)中重要的信號(hào)分子，許多植物CDPKS可通過(guò)參與信號(hào)分子介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在植物防御和發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。如擬南芥AtCPK4和AtCPK11可通過(guò)參與Ca2+介導(dǎo)的ABA 信號(hào)通路，調(diào)控種子萌發(fā)、幼苗生長(zhǎng)、氣孔保衛(wèi)細(xì)胞調(diào)節(jié)和植物對(duì)鹽脅迫的耐受性[11］。AtCPK10通過(guò)參與ABA 誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉響應(yīng)干旱脅迫[12］，AtCPK8及其互作蛋白CATALASE3 參與ABA 和H2O2介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，通過(guò)維持H2O2穩(wěn)態(tài)在響應(yīng)干旱脅迫中起重要作用[13］。水稻OsCPK9通過(guò)參與SA 介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在抗病防御中起作用[14］。水稻OsCDPK13基因主要在葉鞘和愈傷組織中表達(dá)，GA3處理后，該基因表達(dá)量和蛋白質(zhì)大量積累[15］。轉(zhuǎn)AtCPK30基因擬南芥被低濃度GA3誘導(dǎo)后，能促進(jìn)植株根系生長(zhǎng)[16］。

蛋白激酶活性是CDPK 發(fā)揮作用的前提，CDPK 激酶區(qū)具有典型的Ser/Thr 蛋白激酶序列，位于此區(qū)中的Lys 殘基極為保守，是ATP 的結(jié)合位點(diǎn)。自抑制區(qū)富含堿性氨基酸殘基，能以底物的形式與激酶域結(jié)合，抑制激酶的活性。調(diào)控區(qū)含有與Ca2+結(jié)合的EF 手型結(jié)構(gòu)域，這是CDPK 僅依賴于Ca2+而不依賴鈣調(diào)素的原因[16］。當(dāng)胞內(nèi)Ca2+濃度較低時(shí)CDPK 激酶區(qū)就和自抑制區(qū)相結(jié)合，形成自抑制，CDPK 激酶活性很低或沒(méi)有；當(dāng)發(fā)育和環(huán)境信號(hào)引發(fā)胞內(nèi)Ca2+濃度升高時(shí)，CDPK 調(diào)控區(qū)EF 手型蛋白就與Ca2+結(jié)合，使調(diào)控區(qū)蛋白結(jié)構(gòu)域構(gòu)象發(fā)生變化，自抑制區(qū)與激酶活性結(jié)構(gòu)域分開(kāi)，自抑制作用解除，恢復(fù)蛋白激酶活性，將Ca2+信號(hào)向下游傳導(dǎo)和級(jí)聯(lián)放大，參與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育、信號(hào)傳遞、逆境響應(yīng)和免疫應(yīng)答等[17］。

天山雪蓮（Saussurea involucrata）能在極端環(huán)境生長(zhǎng)和開(kāi)花，蘊(yùn)含著豐富的抗逆基因資源。本實(shí)驗(yàn)室前期從天山雪蓮中克隆獲得SikCDPK1基因，發(fā)現(xiàn)它可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因煙草（Nicotiana tabacum）的耐低溫、干旱脅迫能力[18］，而有關(guān)SikCDPK1基因的組織表達(dá)、是否參與對(duì)逆境信號(hào)分子的響應(yīng)及蛋白激酶活性等未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究擬通過(guò)對(duì)天山雪蓮SikCDPK1基因在不同組織器官的表達(dá)、對(duì)信號(hào)分子CaCl2、ABA、GA3、SA、H2O2的誘導(dǎo)響應(yīng)模式、SIKCDPK1 激酶活性分析和 SIKCDPK1 亞細(xì)胞定位等研究，揭示SikCDPK1基因的表達(dá)特征和蛋白激酶活性，為深入研究SikCDPK1基因的表達(dá)機(jī)制和功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 植物材料 本試驗(yàn)于2018-2020 年在石河子大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院綠洲城鎮(zhèn)與山盆系統(tǒng)生態(tài)兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展。天山雪蓮種子用1% KMnO4溶液浸泡12 h，蒸餾水沖洗3~4 次。用75%的酒精對(duì)種子表面消毒1 min，0.1% HgCl2（w/v） 溶液消毒7 min。無(wú)菌水沖洗3~4 次，用無(wú)菌濾紙吸去種子表面多余的水分后，將種子均勻散播在1/2 MS 固體培養(yǎng)基（825 mg·L-1NH4NO3、950 mg·L-1KNO3、0.83 mg·L-1KI、27.8 mg·L-1FeSO4·7H2O 和0.5 mg·L-1煙酸等）表面，置于16 ℃光照強(qiáng)度為60 μmol·m-2·s-1，16 h 光照/8 h 黑暗的條件下培養(yǎng)45 d，將長(zhǎng)出幼莖與幼葉的幼苗，煉苗馴化后，移栽至營(yíng)養(yǎng)土中，置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 個(gè)月。分別取生長(zhǎng)45 d 天山雪蓮組培苗的幼莖、幼葉與生長(zhǎng)3 個(gè)月大的栽培苗的根、莖、葉于液氮中速凍后，置于-80 ℃冰箱保存。

1.1.2 主要試劑 普通瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒、RNA 提取試劑盒、Revert-Aid First Strand cDNA Synthesis Kit、qPCR 試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自北京天根生物科技有限公司，T4DNA ligase、限制性內(nèi)切酶KpnⅠ和SalⅠ購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，植物表達(dá)載體pBI121-GFP質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 天山雪蓮不同組織器官SikCDPK1基因的表達(dá) 分別取-80 ℃冰箱保存的生長(zhǎng)45 d 天山雪蓮的幼莖、幼葉與生長(zhǎng)3 個(gè)月后雪蓮植株的根、莖、葉，使用TaKaRa 公司RNA 提取試劑盒，按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的步驟提取天山雪蓮總RNA。按照20 μL 反應(yīng)體系： RNA（3.5 μL）、Oligo-dT18（1 μL）、dNTP（1 μL）、RNase inhibitor （1 μL）、5×Reverse Transcriptase M-MLV Buffer（4 μL）、RNase-free dd H2O（9.5 μL），42 ℃水浴90 min，迅速轉(zhuǎn)移至70 ℃水浴15 min，完成cDNA 第一鏈的合成，-20 ℃保存。以表1 中的雪蓮內(nèi)參基因引物GAPGH-F、GAPGH-R與目的基因引物SikCDPK1-qF、SikCDPK1-qR，進(jìn)行RT-qPCR 反應(yīng)。反應(yīng)體系：cDNA（1 μL）、GAPGH-F/SikCDPK1-qF（0.25 μL）、GAPDH-R/SikCDPK1-qR（0.25 μL）、SYBR Green PCR Master Mix（5 μL）、ddH2O（3.5 μL），反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃ 10 s，62 ℃ 30 s，40 個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。

表1 引物Table 1 The primers

1.2.2 CaCl2、ABA、GA3、SA、H2O2誘導(dǎo)后基因表達(dá)分析 選取生長(zhǎng)3 個(gè)月，長(zhǎng)勢(shì)一致且生長(zhǎng)健康的整株天山雪蓮苗，沖洗表面的營(yíng)養(yǎng)土后，分別置于MS 液體培養(yǎng)基（1650 mg·L-1NH4NO3、1900 mg·L-1KNO3、0.83 mg·L-1KI、27.8 mg·L-1FeSO4·7H2O、0.5 mg·L-1煙酸等）中，生長(zhǎng)48 h，使其根系損傷恢復(fù)。將苗取出后，分別置于含5 mmol·L-1CaCl2、100 μmol·L-1ABA、100 μmol·L-1GA3、1 mmol·L-1SA、100 μmol·L-1H2O2的MS 培養(yǎng)液中，分別處理： 0、1、3、6、12、24 h 后，提取樣品總RNA，反轉(zhuǎn)錄后，使用表1 中的SikCDPK1-qF、SikCDPK1-qR 引物進(jìn)行RT-qPCR 檢測(cè)SikCDPK1基因表達(dá)量，每個(gè)樣品重復(fù)3 次。

1.2.3 SIKCDPK1 蛋白誘導(dǎo)表達(dá)與純化 將含有重組原核表達(dá)載體PET28a-SikCDPK1 的菌液以1∶100（v/v）接種到100 mL 新鮮LB 液體培養(yǎng)基（10 g·L-1胰蛋白胨、5 g·L-1酵母提取物、10 g·L-1氯化鈉）中活化，培養(yǎng)至OD600達(dá)到0.4，加入1 mmol·L-1異丙基硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-thiogalactoside，IPTG），37 ℃分別誘導(dǎo)表達(dá)4、5、6、7、8、9、10 h 后，4 ℃ 6000 r·min-1離心10 min 富集菌體，向沉淀中加入1 mL 0.01 mmol·L-1預(yù)冷的PBS 懸浮后加入1 mL 5×SDS 電泳緩沖液，沸水浴10 min，放至室溫12000 r·min-1離心5 min，取上清液進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。根據(jù)優(yōu)化后的菌株表達(dá)條件擴(kuò)大培養(yǎng)菌液，6000 r·min-1離心10 min，收集菌體，向其中加入5 mL 含有20 mmol·L-1磷酸鈉、500 mmol·L-1NaCl、30 mmol·L-1pH 7.4 咪唑的結(jié)合緩沖液，在室溫下攪拌30 min，超聲破碎10 min。將組氨酸標(biāo)記蛋白純化柱（Histrap FF Column）與層析裝置連接好后，將蒸餾水注入恒流泵的管道，用注射器逐滴地往層析柱中注水，直到蒸餾水從管道的另一個(gè)出口流出來(lái)。將處理好的樣品上柱后，用結(jié)合緩沖液沖洗，此時(shí)恒流泵的流速為1 mL·min-1。再向柱內(nèi)加入含有20 mmol·L-1磷酸鈉、500 mmol·L-1NaCl 與不同濃度的咪唑洗脫液緩沖洗脫純化后，取10 μL 純化蛋白進(jìn)行電泳檢測(cè)。

1.2.4 體外激酶活性測(cè)定 參照Promega 公司Kinase GLOTMLuminescent Kinase Assay 試劑盒說(shuō)明書(shū)，在離心管中加入含有30 mmol·L-1Tris-HCl（pH 7.5）、0.5 mmol·L-1DTT、100 mmol·L-1NaCl、10 μmol·L-1ATP、100 mmol·L-1CaCl2的酶促反應(yīng)緩沖液和底物HisⅢ（50 μg·mL-1），再加入10 μL 純化后的重組蛋白，使反應(yīng)總體積達(dá)到200 μL，置于30 ℃水浴鍋開(kāi)始反應(yīng)。分別取20 μL 反應(yīng)0、5、10、15、20、25、30、40、50 min 的反應(yīng)混合物，沸水浴1 min 終止反應(yīng)。將反應(yīng)物冷卻至室溫后，轉(zhuǎn)移到96 孔酶標(biāo)板中，并向板中加入20 μL 試劑盒中的Kinase-Glo Reagent，使用酶標(biāo)儀（LDSY96A，山東）在Luminescent 狀態(tài)下檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度，每個(gè)數(shù)值重復(fù)讀取3 次。將上述酶促反應(yīng)液中的Ca2+換成2 mmol·L-1EGTA（ethylene glycol tetraacetic acid），相同方法檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度。

使用在線網(wǎng)站http：//maxchelator.stanford.edu/CaEGTA-NIST.htm 計(jì)算反應(yīng)液中的Ca2+濃度，在Ca2+濃度為0、8.4、14.0、34.0、51.0、79.0、135.0 nmol·L-1時(shí)，分別檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度。在底物HisⅢ濃度為0、10、20、50、100、250、500 μg·L-1時(shí)，分別檢測(cè)發(fā)光強(qiáng)度。用不同濃度下樣品的發(fā)光值與對(duì)照的差值來(lái)表示酶活性的改變量，使用GraphPad Prism 9.1 軟件分析底物為HisⅢ時(shí)SIKCDPK1 激酶的米氏常數(shù)（michaelis constant，Km）。

1.2.5 亞細(xì)胞定位 在NCBI 獲得SikCDPK1基因序列，Primer 5.0 設(shè)計(jì)帶有KpnⅠ和SalⅠ為酶切位點(diǎn)的引物（表1）SikCDPK1-GFP-F 與SikCDPK1-GFP-R，擴(kuò)增出目的基因片段后，連接至pMD19T 載體，將測(cè)序成功的質(zhì)粒命名為pMD19T-SikCDPK1。用KpnI 和SalI 限制性內(nèi)切酶酶切重組質(zhì)粒pMD19T-SikCDPK1和PBI121-GFP載體。酶切產(chǎn)物凝膠電泳檢測(cè)后回收純化，連接后從含卡那霉素（kanamycin， kan）50 μg·mL-1抗性的培養(yǎng)基中挑單克隆，進(jìn)行菌液PCR 檢測(cè)。將檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的pBI121-SikCDPK1-GFP質(zhì)粒，采用電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101 感受態(tài)細(xì)胞，在含有利福平（rifampicin， Rif）50 μg·mL-1、kan 50 μg·mL-1、慶大霉素（gentamicin，Gen）50 μg·mL-1的LB 固體培養(yǎng)基上篩選后，將PCR 檢測(cè)為陽(yáng)性的pBI121-SikCDPK1-GFP的農(nóng)桿菌菌液，采用Li 等[19］的方法侵染新鮮洋蔥（Allium cepa）鱗莖表皮細(xì)胞，暗培養(yǎng)2 d 后，制作臨時(shí)裝片，先在光學(xué)顯微鏡（MSD701，廣州）下觀察，后轉(zhuǎn)移至激光共聚焦顯微鏡（LSM510，德國(guó)）下觀察。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用2-??Ct法[20］計(jì)算出天山雪蓮SikCDPK1基因在不同組織器官的表達(dá)量，使用SPSS 18.0 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行LSD 多重方差分析，顯著性測(cè)驗(yàn)設(shè)定為P<0.05（顯著水平）和P<0.01（極顯著水平），使用Excel 和GraphPad Prism 9.1 制作圖表。檢測(cè)蛋白激酶活性過(guò)程中，對(duì)照與樣品在酶標(biāo)儀檢測(cè)到光信號(hào)強(qiáng)度的差值與激酶活性成正比，差值越大酶活性越大。利用GraphPadprism 中的enzyme kinetics Michaelis-Menten 計(jì)算SIKCDPK1 的Km值。

2 結(jié)果與分析

2.1 SikCDPK1 基因組織特異性分析

通過(guò)RT-qPCR 探究SikCDPK1基因在天山雪蓮根、莖、葉、幼葉、幼莖及種子中的表達(dá)情況。SikCDPK1 基因在種子中表達(dá)量最高，其他依次是葉、莖、根、幼葉，幼莖中表達(dá)量最低（圖1）。種子、葉、莖、根中的基因表達(dá)量和幼莖相比差異極顯著，幼葉中的基因表達(dá)量和幼莖中的基因表達(dá)量相比，達(dá)到顯著差異。說(shuō)明SikCDPK1基因在雪蓮種子、葉、莖、根中都存在，但在不同器官表達(dá)有差異。

圖1 SikCDPK1 基因組織特異性表達(dá)Fig.1 Tissue specific expression of SikCDPK1 gene

2.2 CaCl2、ABA、GA3、SA 及H2O2 誘導(dǎo)的基因表達(dá)分析

CaCl2處 理 后，SikCDPK1基 因 表達(dá) 呈 現(xiàn)“上升-快速下降-上升”的趨勢(shì)（圖2），在6 h 達(dá)到峰頂，表達(dá)量為CK 的17.549 倍，與CK 相比達(dá)極顯著差異水平。在12 h 達(dá)到峰底，峰底的表達(dá)量為CK的1.284 倍，24 h 又升高，表達(dá)量 為CK 的1.509 倍，達(dá)顯著差異水平。

圖2 SikCDPK1 基因的表達(dá)特性Fig.2 Expression characteristics of SikCDPK1

ABA 處 理 后，SikCDPK1基 因 表達(dá) 呈 現(xiàn)“上升-下降-慢上升”的趨勢(shì)（圖2），在3 h 達(dá)到峰頂，表達(dá)量為CK 的2.229 倍，與CK 相比達(dá)極顯著差異水平，在12 h 達(dá)到峰底，峰底的表達(dá)量為CK 的1.057 倍，24 h 又升高，表達(dá)量為CK 的1.366 倍。

GA3處理后，SikCDPK1基因表達(dá)呈現(xiàn)“略微上升-下降-上升”趨勢(shì)（圖2），在6 h 達(dá)到峰底，峰底的表達(dá)量為CK 的0.816 倍，后面持續(xù)上升，12 h 表達(dá)量為CK 的1.945 倍，與CK 相比達(dá)極顯著差異水平。在24 h 達(dá)到峰頂，表達(dá)量為CK 的3.936 倍，達(dá)極顯著差異水平。

SA 處理后，基因表達(dá)模式整體呈現(xiàn)“上升-下降”的趨勢(shì)（圖2），在3 h 達(dá)到峰頂，表達(dá)量為CK 的1.414 倍，與CK 相比達(dá)顯著差異水平。后面持續(xù)下降，24 h 表達(dá)量最低，為CK 的0.476 倍，達(dá)顯著差異水平。

H2O2處理后，其基因表達(dá)量呈現(xiàn)出“上升-下降-上升-下降”趨勢(shì)（圖2），分別在1 和12 h 達(dá)到峰頂，表達(dá)量分別為CK 的2.543 和2.719 倍，與CK相比達(dá)到極顯著差異水平。在6 h 達(dá)到第一個(gè)峰底，峰底的表達(dá)量為CK 的1.045 倍。在24 h 達(dá)到第二個(gè)峰底，峰底的表達(dá)量為CK 的0.785 倍。

以上說(shuō)明SikCDPK1基因表達(dá)除受Ca2+影響外，還受ABA、GA3、SA、H2O2的影響。

2.3 SIKCDPK1 蛋白的表達(dá)與純化

將37 ℃誘導(dǎo)8 h 的高表達(dá)蛋白，使用Histrap FF Column 層析柱，進(jìn)行Ni2+親和層析純化，分別用200、500、600 mmol·L-1濃 度 的 咪 唑 液 洗 脫，經(jīng)SDS-PAGE 檢 測(cè) 后，發(fā) 現(xiàn)500 mmol·L-1咪 唑 洗 脫純化后的蛋白產(chǎn)物濃度與純度比較高，獲得大小為63.5 KD 的純化蛋白（圖3）。

圖3 SIKCDPK1 重組蛋白純化Fig.3 Purification of SIKCDPK1 recombinant protein

2.4 體外激酶活性分析

ATP 與熒光素酶結(jié)合，使反應(yīng)液由不發(fā)光狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榘l(fā)光狀態(tài)，發(fā)光值越大表明ATP 含量越高，隨著酶促反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，ATP 被消耗，發(fā)光值越來(lái)越小，因此酶活力與發(fā)光值成反比，本研究通過(guò)檢測(cè)不同時(shí)間段溶液中的發(fā)光值，利用發(fā)光值的改變量（對(duì)照與樣品之間相對(duì)光單位RLU 的差值），評(píng)估反應(yīng)液中的ATP 含量，判斷激酶的活性。有Ca2+時(shí)，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，ATP 逐漸被消耗，發(fā)光值越來(lái)越低（圖4）。而換成Ca2+螯合劑EGTA 時(shí)，發(fā)光值隨時(shí)間的延長(zhǎng)沒(méi)有發(fā)生明顯的變化。說(shuō)明有Ca2+時(shí)，SIKCDPK1 具有激酶催化活性，Ca2+被螯合劑EGTA 阻斷后，SIKCDPK1 幾乎沒(méi)有激酶活性。

圖4 SIKCDPK1 激酶活性Fig.4 Kinase activity of SIKCDPK1

SIKCDPK1 激酶活性隨著Ca2+濃度的升高而呈“S”型的變化趨勢(shì)（圖5），當(dāng)Ca2+濃度為14.0~79.0 nmol·L-1時(shí)，SIKCDPK1 激 酶 活 性 快 速 升 高，濃 度 為79.0~135.0 nmol·L-1時(shí)，SIKCDPK1 激 酶 活 性 升 高 速 率 減 慢，SIKCDPK1 激酶活性達(dá)到最大的1/2 所需要的Ca2+濃度（K0.5）為48.7 nmol·L-1。

圖5 Ca2+對(duì)SiKCDPK1 活性的激發(fā)Fig.5 Trigger action of SIKCDPK1 activity by Ca2+

檢測(cè)不同濃度HisⅢ發(fā)生酶促反應(yīng)時(shí)的發(fā)光值，發(fā)現(xiàn)當(dāng)?shù)孜颒isⅢ濃度為0~100 μg·mL-1時(shí)，其酶促反應(yīng)速率急劇增加（圖6），濃度為100~250 μg·mL-1時(shí)，反應(yīng)速率平穩(wěn)，濃度為250~500 μg·mL-1時(shí)，反應(yīng)速率增加較慢，500 μg·mL-1時(shí)達(dá)到最大反應(yīng)速率。用不同濃度HisⅢ發(fā)生酶促反應(yīng)時(shí)的發(fā)光值與不加HisⅢ時(shí)的發(fā)光值的差值代表酶活性的改變量，經(jīng)GraphPad Prism 9.1 軟 件 中 的 enzyme kinetics Michaelis-Menten 計(jì) 算 得 到SIKCDPK1 的Km值 為43.8 μg·mL-1。

圖6 底物HisⅢ的Km值Fig.6 The Km value of substrate HisⅢ

2.5 SIKCDPK1 蛋白亞細(xì)胞定位

為探究SIKCDPK1 的亞細(xì)胞定位，將SikCDPK1 基因與綠色熒光蛋白基因GFP融合后，構(gòu)建了植物融合表達(dá)載體pBI121-SikCDPK1-GFP，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法侵染洋蔥鱗莖表皮細(xì)胞后，在激光共聚焦顯微鏡下觀察熒光。如圖7 所示，侵染后的洋蔥表皮細(xì)胞能夠檢測(cè)到較強(qiáng)的熒光信號(hào)，并且綠色熒光都集中在細(xì)胞核上，其余部位并未檢測(cè)到綠色熒光信號(hào)。對(duì)照35S-GFP在細(xì)胞膜與細(xì)胞核內(nèi)均有綠色熒光分布，而未做侵染的洋蔥表皮細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)不到熒光信號(hào)，因此判定SIkCDPK1 蛋白主要定位在細(xì)胞核。

圖7 SikCDPK1-GFP 融合蛋白亞細(xì)胞定位Fig.7 Subcellular localization of SikCDPK1-GFP fusion protein

3 討論

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 結(jié)果表明，SikCDPK1基因表達(dá)量由高到低依次是種子、葉片、莖、根、幼葉、幼莖，說(shuō)明天山雪蓮種子、葉片、莖、根中都存在SikCDPK1基因，但該基因在各器官表達(dá)水平不一樣，成熟組織中的基因表達(dá)量高于幼嫩組織，葉片中的基因表達(dá)量高于莖中的，說(shuō)明SikCDPK1基因表達(dá)沒(méi)有明顯的組織特異性。

本研究發(fā)現(xiàn)SikCDPK1基因表達(dá)除受Ca2+影響外，還受ABA、GA3、SA、H2O2影響。ABA、GA3、SA、H2O2是逆境防御系統(tǒng)中重要的信號(hào)分子，在擬南芥中發(fā)現(xiàn)AtCPK3、AtCPK6、AtCPK21、AtCPK23基因參與ABA 誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉[21］，AtCPK10也參與ABA 和Ca2+介導(dǎo)的氣孔運(yùn)動(dòng)[22］，AtCPK8在ABA 和H2O2介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起抗旱作用[13］，玉米（Zea mays）ZmCPK1響應(yīng) H2O2誘導(dǎo)，參與H2O2信號(hào)傳導(dǎo)途徑[23］。水稻OsCPK21參與ABA 介導(dǎo)的下游逆境基因的表達(dá)[24］，這些研究表明CDPKS可參與多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路并在逆境響應(yīng)中發(fā)揮作用。SikCDPK1基因具體如何參與這些信號(hào)分子的信號(hào)途徑來(lái)發(fā)揮抗逆作用，需進(jìn)一步深入研究。

體外激酶活性分析發(fā)現(xiàn)Ca2+存在時(shí)，SIKCDPK1 具有激酶催化活性，加入Ca2+螯合劑EGTA 后，SIKCDPK1幾乎沒(méi)有激酶活性，這與番茄LeCPK2 蛋白激酶是Ca2+依賴性的研究結(jié)果相似[25］，證實(shí)SIKCDPK1 發(fā)揮激酶活性也是需要Ca2+的。冰葉日中花（Mesembryanthemum crystallinum）McCPK1 激酶活性能被K0.5為0.15 μmol·L-1的Ca2+激活[26］，煙草NtCPK5 激酶活性能被K0.5為0.04 μmol·L-1的Ca2+激活[27］，NtCPK4 激酶活性能被K0.5為0.25 μmol·L-1的Ca2+激活[28］。擬南芥AtCPK11被0.55 μmol·L-1的Ca2+激活[29］。本研究發(fā)現(xiàn)SIKCDPK1 激酶活性隨Ca2+濃度增加而增加，Ca2+濃度（K0.5）為48.7 nmol·L-1時(shí)，SIKCDPK1 激酶活性可達(dá)到最大活性的1/2，說(shuō)明該激酶活性可受nmol·L-1級(jí)別Ca2+濃度的激發(fā)。以HisⅢ為底物時(shí)，SIKCDPK1 的Km值可達(dá)43.8 μg·mL-1，說(shuō)明SIKCDPK1 激酶活性不僅受到Ca2+濃度的影響，還受到底物HisⅢ濃度的影響，推測(cè)Ca2+和底物等影響因素可能會(huì)在細(xì)胞內(nèi)形成一種復(fù)合的環(huán)境共同調(diào)控SIKCDPK1 的激酶活性，并將Ca2+信號(hào)向下游傳遞，使植物參與逆境響應(yīng)。

亞細(xì)胞定位分析發(fā)現(xiàn)SIKCDPK1 蛋白定位于細(xì)胞核，采用Prosite 數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)SikCDPK1在N-端（220~225）（547~552）處有 2 個(gè)豆蔻?；稽c(diǎn)。在煙草NtCDPK2亞細(xì)胞定位中發(fā)現(xiàn)，少量的豆蔻?；稽c(diǎn)不能使蛋白穩(wěn)定結(jié)合在膜結(jié)構(gòu)上，多個(gè)豆蔻?；稽c(diǎn)才能使CDPKS穩(wěn)定結(jié)合于膜上[30］。豆蔻?；稽c(diǎn)修飾后，蛋白與膜結(jié)合較松散，大多定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核[31］。玉米ZmCK1含有一個(gè)豆蔻?；稽c(diǎn)，定位于細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核[32］。棕櫚?；稽c(diǎn)修飾可以增強(qiáng)蛋白質(zhì)疏水性，促進(jìn)蛋白質(zhì)與膜結(jié)合，使蛋白質(zhì)在膜間的亞細(xì)胞運(yùn)輸過(guò)程中發(fā)揮重要作用[33］。SikCDPK1豆蔻酰化位點(diǎn)少，又無(wú)棕櫚?；稽c(diǎn)，這可能是SIKCDPK1 蛋白定位于細(xì)胞核而不能定位細(xì)胞膜的原因。SIKCDPK1 蛋白定位于細(xì)胞核，推測(cè)其主要在細(xì)胞核里發(fā)揮作用。

4 結(jié)論

SikCDPK1基因在天山雪蓮種子、葉片、莖、根中都表達(dá)，無(wú)明顯組織表達(dá)特異性，該基因響應(yīng)信號(hào)分子Ca2+、ABA、GA3、SA、H2O2誘導(dǎo)表達(dá)且響應(yīng)模式有差異。SIKCDPK1 發(fā)揮激酶活性需要Ca2+，受nmol·L-1級(jí)別Ca2+濃度的激發(fā)，SIKCDPK1 主要在細(xì)胞核發(fā)揮作用。本研究豐富了對(duì)雪蓮SikCDPK1基因的認(rèn)知，為進(jìn)一步深入研究SikCDPK1基因的表達(dá)機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。