姜瑛，張輝紅，魏暢，徐正陽，趙穎，劉芳，李鴿子，張雪海，柳海濤

（1. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，河南 鄭州 450002；2. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，省部共建小麥玉米作物學(xué)國家重點實驗室，河南 鄭州 450046）

全世界14 多億hm2耕地中，有43%的區(qū)域?qū)儆诟珊岛桶敫珊担斐勺魑锂a(chǎn)量損失約50%，高于其他自然災(zāi)害的總和[1-2］。干旱脅迫作為一種多維脅迫，可以引起植物中一系列生理生化反應(yīng)，甚至導(dǎo)致植物的光合作用停止和細(xì)胞代謝的紊亂，造成植物的死亡，限制了植物的生產(chǎn)力[3］。干旱脅迫可導(dǎo)致植物體內(nèi)過氧化物和活性氧（reactive oxygen species， ROS）含量積累，造成植物體內(nèi)ROS 的產(chǎn)生和清除失衡，引起細(xì)胞膜過氧化、蛋白質(zhì)氧化、膜通透性改變，使植物丙二醛（malondialdehyde， MDA）含量升高，滲透調(diào)節(jié)和抗氧化能力下降，影響植物正常發(fā)育[4-6］。植物會通過一系列的防御機制緩解干旱脅迫下過度積累的ROS 對自身造成的危害[7］。干旱脅迫下，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（包括可溶性蛋白、可溶性糖等）降低細(xì)胞滲透勢，從而維持正常的滲透壓，促使細(xì)胞從外界吸水，防止細(xì)胞失水[4］，同時還能夠保護細(xì)胞內(nèi)大分子結(jié)構(gòu)[8］。植物受到干旱脅迫時，其葉片光合生理會發(fā)生明顯變化，主要通過凈光合速率和蒸騰速率等來反映[9］，主要表現(xiàn)為光合作用和光合速率下降，從而導(dǎo)致植物生物量降低[10］。為了降低和消除干旱脅迫下植物體內(nèi)產(chǎn)生的氧化脅迫，植物細(xì)胞體內(nèi)產(chǎn)生了由超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化物酶（peroxidase， POD）、過氧化氫酶（catalase， CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase， APX）、谷胱甘肽（glutathione， GSH）、抗壞血酸（ascorbate， AsA）等組成的自我防御系統(tǒng)[11］。使用褪黑素（melatonin， MT）、赤霉素（gibberellin， GA）等多種外源植物激素對干旱脅迫下植物的生理過程有著積極的影響[12-15］。

褪黑素又稱松果體素，分子式C13N2H16O2，化學(xué)名稱為N-乙?；?5-甲氧基色胺，是一種內(nèi)源性的自由基清除劑和抗氧化劑，能夠有效清除過量的活性氧物質(zhì)（ROS）、刺激抗氧化酶活性進行抗氧化調(diào)節(jié)、增強抗氧化劑的抗氧化能力、提高線粒體內(nèi)部氧化磷酸化進行抗氧化調(diào)節(jié)[16］。研究表明，外源褪黑素能夠促進植株生物量積累，改善干旱脅迫對根系構(gòu)型的抑制作用[17］，降低MDA 含量，緩解脅迫對細(xì)胞膜的毒害[18］，清除過量自由基，提高滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量[19］，增加葉片葉綠素含量，提高光合速率[20］，促進還原性物質(zhì)AsA、GSH 含量提高[21］，增加抗氧化酶活性和含量[22］，緩解干旱脅迫對植株生長發(fā)育的抑制作用。褪黑素可以提高植物的耐旱性，但其具體表現(xiàn)以及褪黑素對植物耐旱性影響的潛在機制還需要進一步探究。

玉米（Zea mays）屬于禾本科玉蜀黍?qū)?，是世界三大主要作物之一，同時也是重要的飼草來源，為高耗水植物，對干旱脅迫反應(yīng)較為敏感，整個生育期需要充足的水分供應(yīng)[23］，尤其是苗期的干旱逆境對玉米的增產(chǎn)有重要影響[24］。而且，玉米是單株生產(chǎn)力較強的禾谷類作物，擁有極強的根系是其高產(chǎn)的主要原因之一[25］。植物根系是影響產(chǎn)量的重要器官，是連接地上部與土壤水分、養(yǎng)分的橋梁，發(fā)揮著固持地上組織和汲取地下水分養(yǎng)分的雙重功能，與作物的生長發(fā)育及產(chǎn)量密切相關(guān)[23］。有研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫會導(dǎo)致玉米葉片內(nèi)自由基大量產(chǎn)生和積累，從而引發(fā)膜脂過氧化作用，細(xì)胞膜穩(wěn)定性下降，導(dǎo)致玉米的生長發(fā)育受到阻礙[26］。韓希英等[27］的研究結(jié)果表明，干旱會抑制玉米根系生長，減弱根系吸收能力，從而造成玉米減產(chǎn)。馬旭輝等[28］研究發(fā)現(xiàn)，外源褪黑素可促進干旱條件下玉米根系發(fā)育，減輕對氧化系統(tǒng)的損傷，緩解產(chǎn)生的光合抑制，從而提高玉米的抗旱性。

目前應(yīng)用聚乙二醇（PEG-6000）模擬自然干旱已經(jīng)成為研究植物幼苗抗旱性的重要手段[29］。本研究主要利用PEG-6000 模擬干旱脅迫環(huán)境，通過葉片噴施的方法，探討不同濃度的褪黑素對玉米幼苗的根系構(gòu)型及分級特征、生長及光合特性、抗氧化能力和滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響，豐富玉米的抗旱性研究，為探索褪黑素提高植物抗旱性的生理機制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試玉米品種為鄭單985，種子購買于河南秋樂種業(yè)科技股份有限公司。霍格蘭（Hoagland）營養(yǎng)液配方為：4 mmol·L-1Ca（NO3）2·4H2O、6 mmol·L-1KNO3、2 mmol·L-1MgSO4·7H2O、1 mmol·L-1NaH2PO4·2H2O、46.1 μmol·L-1H3BO3、9.1 μmol·L-1MnCl2·4H2O、0.76 μmol·L-1ZnSO4·7H2O、0.32 μmol·L-1CuSO4·5H2O、0.08 μmol·L-1Na2MoO4·2H2O、100 μmol·L-1EDTA-Fe。褪黑素購自美國Sigma 公司，相對分子質(zhì)量為232.28，分子式C13H16N2O，純度為>99%。試驗所用模擬干旱脅迫的聚乙二醇購買于索萊寶生物有限公司。

1.2 試驗設(shè)計

本試驗于2021 年10 月在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院光照室內(nèi)進行，溫室設(shè)置的晝夜條件為16 h/8 h，晝/夜溫度26 ℃/20 ℃，光照強度400 μmol·m-2·s-1，濕度75%±5%。

選擇健康、大小均勻的玉米種子在5%的H2O2中浸泡消毒15 min，用去離子水充分沖洗以清除種子表面的H2O2，在黑暗、溫度為25 ℃的條件下，將清洗過后的種子在育苗盆中浸泡12 h，之后取出種子均勻擺放在浸潤的紗布上，保持種子濕潤，催芽72 h 后轉(zhuǎn)入溫室。在盛有1/4 Hoagland 營養(yǎng)液的體積為2 L 的培養(yǎng)盒中，移栽生長至一心一葉時的玉米幼苗進行培養(yǎng)，每盆種植9 株幼苗，在幼苗生長至兩葉一心之前，每2 d 更換1/2 Hoagland 營養(yǎng)液，當(dāng)玉米生長至兩葉一心時，更換全Hoagland 營養(yǎng)液并及時處理。將濃度為15%的聚乙二醇（PEG-6000）加入營養(yǎng)液中模擬干旱脅迫，本試驗共設(shè)置5 個處理：1）CK：葉面噴施清水為空白對照（噴施以霧狀水汽在葉片表面形成水滴自然落下為止）；2）MT0：15% PEG 的營養(yǎng)液+葉面噴施清水；3）MT10：15% PEG 的營養(yǎng)液+葉面噴施10 μmol·L-1褪黑素；4）MT50：15% PEG 的營養(yǎng)液+葉面噴施50 μmol·L-1褪黑素；5）MT100：15% PEG 的營養(yǎng)液+葉面噴施100 μmol·L-1褪黑素，每個處理設(shè)置3 盆重復(fù)，施加處理5 d 后采樣。

1.3 測定指標(biāo)與方法

1.3.1 生物量的測定 每個處理取3 株長勢均勻一致的植株樣品用干凈的剪刀將地上部和根進行分離，去離子水沖洗干凈后用吸水紙吸干表面的水分，測定植株的株高、主根長、地上部鮮重和根鮮重，將根系于20 mmol·L-1的 EDTA-Na2溶液中浸泡15 min，用去離子水重復(fù)沖洗3 次，用于根系形態(tài)測量后，裝入信封，和地上部一同于電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（GZX-9420MBE，上海）105 ℃下殺青30 min 后70 ℃累計烘干48 h 至恒重，用分析天平（PTX-FA2，福建）稱取植株干重。

1.3.2 根系構(gòu)型指標(biāo)的測定 各處理選取3 株完整的根系，將洗凈根系放入20 cm×40 cm 根盤中，置于根系掃描儀（V700 PHOTO，Epson，日本）上，根盤中添加高度為5~10 mm 水，使水面恰好全部沒過根系，再用儀器遮光板全部覆蓋住根盤，使用根系掃描儀進行根系全景掃描。然后利用圖像分析軟件（WinRHIZO? 2003b， 加拿大）測定以下指標(biāo)：總根長（total root length， RL）、根表面積（root surface area， SA）、根體積（root volume， RV）、根平均直徑（root average diameter， RD）、根尖數(shù)（root tips， RT）和分枝數(shù)（root forks， RF）以及根系構(gòu)型分級參數(shù)。根據(jù)根系直徑（RD， mm）大小對 RL、SA 和 RV 進行區(qū)間等級定義：Ⅰ級：RD 0~0.5 mm；Ⅱ級：RD 0.5~1.0 mm；Ⅲ級：RD 1.0~1.5 mm；Ⅳ級：RD>1.5 mm。

1.3.3 光合參數(shù)的測定 各處理選取3 株長勢一致且完整的植株，使用便攜式光合測定儀（Li-6400， LICOR Inc.， 美國）測定第一片完全展開葉片的光合速率（photosynthetic rate，Pn）、氣孔導(dǎo)度（stomatal conductance，Gs）、胞間CO2濃度（intercellular CO2concentration，Ci）和蒸騰速率（transpiration rate，Tr）。

1.3.4 可溶性蛋白含量的測定 采用考馬斯亮藍(lán)G-250 染色法[30］測定可溶性蛋白含量。

1.3.5 丙二醛含量的測定 采用硫代巴比妥酸（TBA）法測定MDA 含量[31］。

1.3.6 抗壞血酸和谷胱甘肽含量的測定 參照Zhang 等[32］的方法測定AsA 含量；參照Guri[33］的方法測定GSH 含量。

1.3.7 抗氧化酶活性測定 參考王學(xué)奎等[34］的方法，采用氮藍(lán)四唑（nitro-blue tetrazolium， NBT）光化學(xué)還原法測定SOD 活性；采用愈創(chuàng)木酚法[34］測定POD 活性；采用H2O2氧化還原法[34］測定CAT 活性；采用比色法[35］測定APX 活性。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用Microsoft Excel 2019 處理數(shù)據(jù)，SPSS 25.0 和Metabo Analyst 5.0 軟件進行數(shù)據(jù)分析，通過LSD 檢驗（P<0.05）進行單因素方差分析（ANOVA）處理間的差異顯著性，采用Pearson 法進行指標(biāo)間的相關(guān)性分析，使用Origin 2021 作圖。

3) 能解決部分邊際油田和短距離必須使用DPST的問題，提高VLCC的作業(yè)范圍和作業(yè)條件，降低原油的裝載成本。

應(yīng)用隸屬函數(shù)法對不同處理抗旱性進行綜合評價。利用隸屬函數(shù)值公式：

反隸屬函數(shù)值公式：

式中：Xi為指標(biāo)的測定值；Xmin和Xmax分別為所有處理的某一指標(biāo)的最小值和最大值；R（Xi）表示指標(biāo)Xi的隸屬函數(shù)值，然后把每個處理的隸屬函數(shù)值求和求平均值，根據(jù)平均隸屬函數(shù)值的大小確定不同處理的抗旱性，該值越大說明抗旱能力就越強。如果所測指標(biāo)與干旱脅迫呈正相關(guān)就用隸屬函數(shù)（1）式，呈負(fù)相關(guān)就用反隸屬函數(shù)（2）式。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫下不同濃度褪黑素處理對玉米幼苗生長及生物量的影響

干旱脅迫下，玉米幼苗地上部和地下部的生長和發(fā)育都受到了不同程度的抑制，與CK 相比，MT0處理下玉米幼苗的株高、地上部鮮重和干重、主根長、地下部鮮重和干重顯著降低了24.03%、65.90%、56.96%、24.35%、49.69%和60.59%。相比干旱處理（MT0），噴施50 μmol·L-1的褪黑素，玉米幼苗的株高、地上部鮮重和干重、地下部鮮重和干重、莖耐受指數(shù)和根耐受指數(shù)顯著增加了18.12%、67.16%、114.40%、38.27%、129.62%、113.95% 和130.77%。噴施褪黑素后根冠比進一步提高，在MT10處理達(dá)到最大，相比于MT0處理提高了31.25%（表1 和圖1）。

圖1 干旱脅迫下不同濃度褪黑素處理對玉米幼苗生長表型的影響Fig. 1 Effects of different concentrations of melatonin on growth phenotype of maize seedlings under drought stress

表1 干旱脅迫下不同濃度褪黑素處理對玉米幼苗生長及耐受指數(shù)的影響Table 1 Effects of different concentrations of melatonin treatments on the growth and tolerance index of maize seedlings under drought stress （mean±SD）

2.2 干旱脅迫下不同濃度褪黑素處理對玉米幼苗根系構(gòu)型分級的影響

與CK 相比，在MT0處理下，玉米幼苗的RL、SA、RV 和RT 顯著降低，分別降低了67.48%、55.59%、39.13%和73.72%（表2）。并且，干旱脅迫顯著抑制了Ⅰ~ Ⅲ徑 級 區(qū) 間 的RL（73.57%、38.43% 和0.97%）、SA（69.48%、41.38% 和49.37%）和RV（64.00%、43.75%和50.00%）。外源噴施褪黑素明顯緩解了干旱脅迫對玉米幼苗的抑制作用，其中當(dāng)噴施50 μmol·L-1的褪黑素時（MT50），玉米幼苗的RL、SA 和RT 均達(dá)到最高，與MT0處理相比，分別增加了83.58%、63.96%和85.11%，RV 和RD 在MT100處理時達(dá)到最大，升高了48.21%和2.22%。Ⅰ和Ⅱ級徑級區(qū)間的RL、SA 和RV 均在MT50處理下達(dá)到最高，與MT0處理相比，RL 的Ⅰ級、SA 的Ⅰ級、RV 的Ⅰ和Ⅱ級均顯著提高，Ⅳ級徑級區(qū)間的RL、SA 和RV 有不同程度的變化趨勢，但各處理間均無顯著性差異。

表2 干旱脅迫下不同濃度褪黑素對玉米幼苗根系結(jié)構(gòu)和根系分級的影響Table 2 Effects of different concentrations of melatonin on root structure and grading of maize seedlings under drought stress（mean±SD）

在5 個 處 理 下，RD 0~0.5 mm 徑 級 區(qū) 間 的RL 和SA 以及RD >1.5 mm 徑級區(qū)間的RV 占據(jù)總根系的比例較大；與MT0處理相比，隨著褪黑素濃度的提高，RD 0~0.5 mm 徑級區(qū)間的RL 和SA 的占比分別增加了3.90%~15.33%和2.81%~28.10%，且RD 0~0.5 mm 徑級區(qū)間的RL、SA 和RV 的占比均在MT50處理下最高；RD 0.5~1.0 mm 徑級區(qū)間內(nèi)的RL、SA 和RV 的占比均有不同程度的降低，分別降低了11.59%~35.09%、7.65%~20.60%和10.29%~13.07%，且RD 0.5~1.0 mm 徑級區(qū)間內(nèi)的RL 和SA 的占比在MT50處理降至最低，RV 的占比在MT100處理降至最低（圖2）。

圖2 干旱脅迫下不同濃度褪黑素對玉米幼苗根長、根表面積以及根體積在不同徑級區(qū)間所占百分比Fig. 2 The percentage of different concentrations of melatonin on root length， root surface area and root volume in different diameters of maize seedlings under drought stress

2.3 干旱脅迫下不同濃度褪黑素處理對玉米幼苗組織內(nèi)MDA 含量的影響

干旱脅迫（MT0）顯著增加地上部和地下部MDA 含量，與CK 相比分別增加了54.19%和41.50%。外源褪黑素處理后，與MT0處理相比，MDA 含量顯著降低，其中地上部MDA 含量在MT50處理降至最低，下降了20.17%（圖3A），地下部MDA 含量在MT10處理降至最低，降低了47.52%（圖3B）。

圖3 干旱脅迫下不同濃度褪黑素對玉米幼苗組織內(nèi)MDA 含量的影響Fig.3 Effects of different concentrations of melatonin on MDA content in maize seedlings under drought stress不同小寫字母代表干旱脅迫下不同濃度褪黑素處理間差異達(dá)到顯著水平（P<0.05），下同。Different lowercase letters represent significant difference

2.4 干旱脅迫下不同濃度褪黑素處理對玉米幼苗組織內(nèi)可溶性蛋白含量的影響

干旱脅迫下，地上部和地下部可溶性蛋白分別增加了2.55%和15.45%。外源褪黑素處理后進一步升高了可溶性蛋白含量，當(dāng)外源褪黑素濃度為50 μmol·L-1（MT50）時，地上部可溶性蛋白含量增加至最高，與MT0處理相比，增加了32.12%（圖4A），當(dāng)外源褪黑素濃度為10 （MT10）、50 （MT50）和100 μmol·L-1（MT100）時，與MT0處理相比，地下部可溶性蛋白含量均表現(xiàn)出顯著性增加，分別升高了45.68%、49.14%和52.30%，在MT100處理增加的最多（圖4B）。

圖4 干旱脅迫下不同濃度褪黑素對玉米幼苗組織內(nèi)可溶性蛋白含量的影響Fig.4 Effects of different concentrations of melatonin on soluble protein content in maize seedling tissues under drought stress

2.5 干旱脅迫下不同濃度褪黑素處理對玉米幼苗光合參數(shù)的影響

植物的光合速率能直接反映出干旱脅迫下的生長狀態(tài)。如圖5 所示，干旱脅迫導(dǎo)致玉米幼苗的光合速率（Pn）、氣孔導(dǎo)度（Gs）和蒸騰速率（Tr）出現(xiàn)不同程度的下降，分別下降了53.45%、19.12%和14.11%，其中Pn和Gs的下降均達(dá)到了顯著性水平。外源褪黑素處理后，Pn、Gs和Tr均表現(xiàn)出先升高再降低的趨勢，且均在MT50處理升至最高，與MT0相比，分別增加了85.83%、32.81%和12.46%。當(dāng)外源褪黑素濃度為100 μmol·L-1（MT100）時，與MT50相比，Pn、Gs和Tr分別降低了31.07%（圖5A）、28.22%（圖5B）和14.86%（圖5D）。當(dāng)外源施加不同濃度褪黑素時，各處理間玉米幼苗的胞間CO2濃度（Ci）差異不顯著（圖5C）。

圖5 干旱脅迫下不同濃度褪黑素對玉米幼苗光合參數(shù)的影響Fig.5 Effects of different concentrations of melatonin on photosynthetic parameters of maize seedlings under drought stress

2.6 干旱脅迫下不同濃度褪黑素處理對玉米幼苗組織內(nèi)AsA 和GSH 含量的影響

AsA 和GSH 在植物抵抗氧化脅迫方面有著很重要的作用，含量的高低與植物的抗逆性有著密切關(guān)系[36］。如圖6 所示，干旱脅迫下，玉米幼苗地上部的AsA 含量和地下部的AsA 和GSH 含量均顯著升高，分別提高了173.09%、48.74%和60.12%，地上部GSH 含量降低了23.43%，施加外源褪黑素后地上部和地下部的AsA 含量均低于MT0處理，相比于MT0處理分別下降了2.74%~32.24%（圖6A）和18.24%~29.15%（圖6B），地下部的GSH 含量在MT100處理達(dá)到最高，升高了6.55%（圖6D）。

圖6 干旱脅迫下不同濃度褪黑素對玉米幼苗組織內(nèi)AsA 和GSH 含量的影響Fig.6 Effects of different concentrations of melatonin on AsA and GSH contents in maize seedling tissues under drought stress

2.7 干旱脅迫下不同濃度褪黑素處理對玉米幼苗抗氧化酶活性的影響

干旱脅迫下，地上部的SOD 活性顯著提高，提高了8.00%，地下部的SOD 活性顯著降低，降幅達(dá)13.71%。外源褪黑素處理后地上部和地下部的SOD 活性均在褪黑素濃度為50 μmol·L-1（MT50）時升至最高，分別升高了25.13%（圖7A）和71.46%（圖7B）。干旱脅迫下，玉米幼苗地上部的POD 活性在MT50處理升至最高，相比于MT0處理升高了42.82%（圖7C），地下部的POD 活性總體顯著升高，在MT100處理升至最高，相比于MT0處理升高了12.86%（圖7D）。玉米幼苗地上部的CAT 活性在MT50處理升至最高，相比于MT0處理升高了27.24%（圖7E），地下部的CAT 活性在干旱脅迫下總體低于CK，在MT50處理最低，與MT0相比，降低了33.33%（圖7F）。干旱脅迫下地上部的APX 活性均顯著升高，在MT50處理升至最高，較MT0處理增幅為48.80%（圖7G），地下部的APX 活性無明顯變化趨勢，在褪黑素濃度為100 μmol·L-1（MT100）時最高，較MT0處理增幅為51.77%（圖7H）。

圖7 干旱脅迫下不同濃度褪黑素對玉米幼苗組織內(nèi)抗氧化酶活性的影響Fig.7 Effects of different concentrations of melatonin on antioxidant enzyme activities in maize seedlings under drought stress

2.8 干旱脅迫下不同濃度褪黑素處理誘導(dǎo)玉米幼苗各指標(biāo)變化的主成分分析、隨機森林結(jié)果、相關(guān)性分析以及熱圖分析

通過主成分分析（PCA）的方法研究了干旱脅迫下不同濃度褪黑素處理對玉米幼苗的各生理指標(biāo)的影響，其中PC1 和PC2 分別占據(jù)了總方差的59.9%和21.9%（圖8A）；MT10和MT100沒有顯著分離，CK、MT0和MT50均顯著分離（圖8B）；PC1 顯著影響了地下部MDA 含量、地下部AsA 含量、地上部MDA 含量、地下部GSH 含量、Ci、RD、地上部AsA 含量、地下部POD 活性、根冠比、地上部SOD 活性、地上部可溶性蛋白含量、地上部CAT 活性、地上部APX 活性、地下部可溶性蛋白含量、地上部可溶性蛋白含量、地下部SOD 活性、地上部耐受指數(shù)和地下部耐受指數(shù)，PC2 顯著影響了地上部GSH 含量、地下部CAT 活性、地下部MDA 含量、地下部AsA 含量、地上部MDA 含量、地下部GSH 含量、Ci、地下部APX 活性、RD、地上部AsA 含量（圖8C）。隨機森林圖（圖8D）顯示，對于生長指標(biāo)，平均精度下降值由大到小順序為地下部干重、地上部干重；對于根系指標(biāo)，平均精度下降值處于Ⅰ級徑級區(qū)間的RL 位于Ⅰ級徑級區(qū)間的SA、RV 之前；對于耐性指數(shù)，平均精度下降值由大到小順序為地上部耐受指數(shù)、地下部耐受指數(shù)；對于抗性物質(zhì)，平均精度下降值由大到小順序為地下部MDA 含量、地上部MDA 含量；對于抗性酶活性，平均精度下降值由大到小順序為地下部SOD 活性、地下部APX 活性、地上部SOD 活性、地下部POD 活性。

圖8 干旱脅迫下不同濃度褪黑素處理誘導(dǎo)玉米幼苗各指標(biāo)變化的主成分分析和隨機森林結(jié)果Fig. 8 Principal component analysis and random forest plot of maize seedling index changes induced by different concentrations of melatonin under drought stress

根據(jù)圖9 和表3 的相關(guān)性結(jié)果分析可知，玉米幼苗的Pn與RL、SA、RV、RT、株高（plant height， Ph）、主根長（main root length， MRL）、植株鮮重（plant fresh weight， FW）和植株干重（plant drought weight， DW）呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），與RD 呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01），顯著影響了玉米幼苗的地上部和根系的生長；玉米幼苗的Gs與SA、RV、Ph 和DW 呈顯著正相關(guān)（P<0.05）；玉米幼苗的MDA 含量與RD 呈極顯著正相關(guān)（P<0.01），與RL、SA、RV、RT、Ph、FW 和DW 呈極顯著負(fù)相關(guān)（P<0.01），與MRL 呈顯著負(fù)相關(guān)（P<0.05），能夠顯著影響玉米幼苗的生長發(fā)育。

圖9 干旱脅迫下不同濃度褪黑素處理玉米幼苗各指標(biāo)變化的相關(guān)性分析和熱圖Fig. 9 Correlation analysis of various indexes of maize seedlings treated with different concentrations of melatonin under drought stress and heat map

表3 干旱脅迫下不同濃度褪黑素處理的玉米幼苗生長指標(biāo)和生理指標(biāo)的相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of growth indexes and physiological indexes of maize seedlings treated with different concentrations of melatonin under drought stress

2.9 干旱脅迫下不同濃度褪黑素處理玉米幼苗的生理指標(biāo)的平均隸屬函數(shù)值

4 個干旱脅迫下處理的平均隸屬函數(shù)值為0.4372~0.6440，不同處理間的差異比較大，MT50處理的MDA、可溶性蛋白、SOD 和CAT 的平均隸屬函數(shù)值均最大，MT10處理的AsA 的平均隸屬函數(shù)值最小，MT100處理的APX的平均隸屬函數(shù)值最大（表4）。根據(jù)隸屬函數(shù)值綜合評價，4 個處理的抗旱性強弱排序為MT50>MT10>MT100>MT0，即MT50處理的抗旱性最強，MT10和MT100處理的抗旱性一般。

表4 干旱脅迫下不同濃度褪黑素處理玉米幼苗生理指標(biāo)的平均隸屬函數(shù)值Table 4 Average membership function values of physiological indexes of maize seedlings treated with different concentrations of melatonin under drought stress

3 討論

干旱脅迫下，植物的形態(tài)和生理生化會發(fā)生變化來適應(yīng)脅迫，生物量的積累和植株形態(tài)的變化是植物響應(yīng)干旱脅迫的最直接表現(xiàn)[37］。本研究結(jié)果表明，外源噴施不同濃度的褪黑素均不同程度地緩解了干旱脅迫對玉米幼苗生長發(fā)育狀況的影響，減輕了干旱脅迫對幼苗株高、主根長、生物量的抑制作用，提高了根長、根體積、根表面積、根尖數(shù)、根冠比、莖和根的耐受指數(shù)，有利于玉米幼苗對水分的吸收，減輕了干旱脅迫造成的危害；使得Ⅰ級（RD 0~0.5 mm）徑級區(qū)間的RL 和SA 以及Ⅳ級（RD>1.5 mm）徑級區(qū)間的RV 占據(jù)總根系的較大比例；在干旱脅迫下，隨著噴施褪黑素濃度的提高，Ⅰ級徑級區(qū)間的RL 和SA 在MT50（50 μmol·L-1）處理下最高，隨著濃度的升高占比逐漸降低。李冬等[38］在煙草（Nicotiana tabacum）上的研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下外源噴施褪黑素降低了根冠比；葉君等[39］研究發(fā)現(xiàn)，干旱脅迫下根施外源褪黑素顯著增加了小麥（Triticum aestivum）根冠比；而馬旭輝等[28］采用水培根灌和盆栽浸種褪黑素兩種不同施用方式對玉米幼苗根系及抗旱性進行研究，發(fā)現(xiàn)褪黑素能夠促進玉米幼苗根系發(fā)育，提高光合作用，緩解氧化損傷，本試驗結(jié)果與其基本一致，說明在不同施用方式下，褪黑素均可以不同程度緩解逆境脅迫的抑制作用[40-42］。本試驗玉米幼苗生長指標(biāo)變化可能是由于褪黑素與生長素有著相同的前體物質(zhì)及部分相似的生理功能，通過誘導(dǎo)生長素的合成來促進玉米幼苗的生理代謝活動[43］，進而減輕干旱脅迫所造成的毒害，促進玉米幼苗及其根系的正常生長發(fā)育。因此，干旱脅迫條件下施加一定濃度的褪黑素在玉米幼苗根系生長方面起著重要作用。

光合作用是維持植物生存重要的基本功能，干旱脅迫產(chǎn)生的活性氧會對植物的光合作用產(chǎn)生抑制[44］。干旱脅迫條件下，植物主動關(guān)閉或收縮氣孔來維持體內(nèi)水分的含量，引起氣孔導(dǎo)度的下降，CO2進出細(xì)胞受到阻礙，蒸騰速率和光合作用下降，植物有機物質(zhì)的合成和能量的運輸受到抑制，嚴(yán)重影響了植物的正常生長發(fā)育[45］。而在干旱脅迫下，施用褪黑素一方面能夠顯著增加葉片的氣孔導(dǎo)度和胞間CO2濃度，顯著降低CO2在傳遞過程中受到的阻力，提高CO2的吸收速率；另一方面，還能提高葉片對光能的利用，減輕光能對光合器官的損傷[46］。在本試驗中，干旱脅迫下玉米幼苗的光合速率和氣孔導(dǎo)度顯著降低，蒸騰速率略有降低，而CO2濃度升高，在噴施50 μmol·L-1的褪黑素處理后，光合速率和氣孔導(dǎo)度均達(dá)到最高，且達(dá)到顯著性水平，然后隨著褪黑素濃度的提高，葉片的光合速率、氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率均有不同程度降低，胞間CO2濃度略有升高。干旱脅迫條件下，適宜濃度的褪黑素能夠使植物重新打開氣孔來改善氣孔功能，在小麥[14］、蘋果[47］（Malus pumila）和黃瓜（Cucumis sativus）[48］等多種植物上都已發(fā)現(xiàn)其在氣孔調(diào)節(jié)方面具有積極作用。褪黑素處理后蒸騰速率的增加可能是由于增強的氣孔導(dǎo)度驅(qū)動以在干旱脅迫下維持光合作用的穩(wěn)定狀態(tài)[14，49］。

干旱脅迫下植物會產(chǎn)生較多活性氧自由基，損害原生質(zhì)膜并影響正常的生理生化代謝，但植株利用抗氧化防護系統(tǒng)等機制抵抗氧化物脅迫[50］，其中過氧化產(chǎn)物MDA 可作為膜脂過氧化損害程度和抗旱能力的重要指標(biāo)[51］。干旱脅迫還會導(dǎo)致細(xì)胞滲透勢升高，抑制植物從外界吸收水分，造成植物組織缺水，可溶性蛋白是植物體內(nèi)主要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，植物可通過增加其含量來緩解干旱脅迫造成的損傷，提高植物的抗旱性[4］。褪黑素本身具有清除活性氧的功能，并能維持活性氧的代謝平衡，降低活性氧對細(xì)胞膜系統(tǒng)造成的損傷，增強自身抗氧化酶活性，以清除過量的活性氧[52］。本研究表明，不同濃度的褪黑素處理均表現(xiàn)出抗逆效果，其中施用50 μmol·L-1褪黑素效果最優(yōu)。在干旱脅迫下噴施50 μmol·L-1褪黑素處理后，玉米幼苗地上部的MDA 含量顯著降低，可溶性蛋白含量、SOD 活性、POD 活性、CAT 活性和APX 活性顯著增加；地下部的MDA 含量、AsA 含量、POD 活性和APX 活性顯著降低，可溶性蛋白含量和SOD 活性顯著增加；隨機森林結(jié)果表明MDA 含量對玉米幼苗的影響最大（圖8D）；相關(guān)性結(jié)果分析表明，玉米幼苗的光合速率和MDA 含量與玉米幼苗生物量的積累和根系構(gòu)型緊密相關(guān)（圖9 和表3）。噴施50 μmol·L-1褪黑素能夠有效提高植株體內(nèi)抗氧化酶活性和促進可溶性蛋白合成，降低MDA 含量，保持原生質(zhì)膜正常的生理生化代謝，從而提高玉米幼苗的抗旱能力，與Liu 等[53］對黃瓜幼苗的研究相同，褪黑素可以提高SOD、POD、CAT 的活性，以緩解干旱脅迫的損傷。本試驗還發(fā)現(xiàn)外源噴施一定濃度的褪黑素有助于植物體內(nèi)活性氧和過氧化物的清除，維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，而較高濃度的褪黑素作用不太明顯，與楊小龍等[22］的研究結(jié)果相似。褪黑素在多種作物中均表現(xiàn)出保護光合器官、提高抗氧化能力和持水能力的特性，顯著增強了作物的抗逆能力[14，43，54］。

4 結(jié)論

干旱脅迫嚴(yán)重抑制了玉米幼苗的生長發(fā)育，外源噴施50 μmol·L-1褪黑素抗旱性最強，能夠有效調(diào)節(jié)玉米幼苗地上部和地下部的抗氧化酶活性和滲透調(diào)節(jié)能力，降低丙二醛含量；同時還提高了葉片的光合作用能力，緩解了干旱脅迫對玉米幼苗地上部和根系生長發(fā)育造成的影響。褪黑素的應(yīng)用可有效提高玉米幼苗抗旱性，為進一步挖掘可提高作物抗旱性的物質(zhì)及其作用機理提供了理論依據(jù)。