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        整合素β1在大鼠BMSCs軟骨分化過程中的實驗研究*

        2023-09-25 08:45:28左右清胡熙苒
        黑龍江醫(yī)藥 2023年17期
        關(guān)鍵詞:苯胺藍整合素軟骨

        鄧 娟,左右清,王 念,胡熙苒,曾 禮

        1.湘潭醫(yī)衛(wèi)職業(yè)技術(shù)學(xué)院臨床學(xué)院,湖南 湘潭 411104;2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,湖南 長沙 410013

        創(chuàng)傷和關(guān)節(jié)炎等引起的關(guān)節(jié)軟骨缺損性癥狀給患者的生活質(zhì)量帶來極大的影響,也是骨關(guān)節(jié)外科目前的難題[1-2]。軟骨組織主要成分是水、膠原與蛋白多糖等,其營養(yǎng)主要由周圍關(guān)節(jié)液或下面的骨基質(zhì)擴散而來,其中無血管無神經(jīng)無淋巴組織,則限制了軟骨再生[3-4]。種子細胞骨髓基質(zhì)干細胞(bone marrow stem cells,BMSCs)取材方便,來源廣泛,且增殖能力強,具有多項分化潛能[5-6]。已有研究顯示,外源性誘導(dǎo)因子、物理刺激、仿生支架等技術(shù)已成功地將BMSCs誘導(dǎo)成軟骨細胞,表達軟骨表型或特異性軟骨標(biāo)志[7-8]。本實驗旨在利用TGF-β3和抗整合素β1單克隆抗體,分別促進和抑制整合素的表達,研究和探討整合素β1在大鼠BMSCs誘導(dǎo)軟骨分化的過程中的作用及其機制,以期為臨床軟骨組織的修復(fù)和應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。

        1 資料與方法

        1.1 一般資料

        健康4 周齡SD 大鼠(180~200 g/只)由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院動物中心提供,實驗均在湘雅基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實驗中心進行。L-DMEM 培養(yǎng)基(GIBCO,美國),胎牛血清(Fetal bovine serum,F(xiàn)BS)(Hyclone,美國),Dexamethasone 和VitaminC (Sigma,美國),TGF-β3(PEPROTECH,美國),F(xiàn)ITC anti-rat CD29 及同型陰性對照和FITC anti-rat CD45 及同型陰性對照(Biolegend,美國),F(xiàn)ITC anti-rat CD34 及同型陰性對照(北京博奧森),CD29 單克隆抗體(Biolegend,美國),Col-II 抗體(北京博奧森),IHC 試劑盒(武漢博士德),DAB 顯色試劑盒(Pierce,美國),甲苯胺藍染液(Sigma,美國),預(yù)染maker (#SM0671)(Fermentas,美國),變性凝膠電泳(SDS-PAGE)和半干轉(zhuǎn)印所用試劑(Sigma,美國)。

        1.2 實驗分組

        采用全骨髓培養(yǎng)法培養(yǎng)大鼠骨髓基質(zhì)干細胞,傳至第三代首先進行流式細胞儀檢測細胞表面CD29、CD34、CD45 的表達情況,得出CD29 的陽性率達99.0%。實驗分三組,(1)對照組:以基礎(chǔ)培養(yǎng)液(L-DMEM+10%FBS+1%雙抗+3%谷氨酰胺)常規(guī)培養(yǎng)(5% CO2,37℃)7 d 和14 d。(2)誘導(dǎo)組:在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入TGF-β3(40 ng/mL)、地塞米松(0.1 μmol/L)、胰島素(6.25 μg/mL)、維生素C(50 μg/mL)。培養(yǎng)條件及時間同上。(3)抑制組:在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中加入anti-CD29 單克隆抗體(0.1 μg/mL)、地塞米松(0.1 μmol/L)、胰島素(6.25 μg/mL)、維生素C(50 μg/mL),培養(yǎng)條件及時間同上。

        1.3 col-Ⅱ免疫細胞化學(xué)染色

        分別取誘導(dǎo)7 d 和誘導(dǎo)14 d 的細胞,每組隨機抽取2盒。PBS 清洗,甲醛固定,H2O2+純甲醇浸泡以滅活內(nèi)源性過氧化物酶,蒸餾水洗1~2次,BSA封閉液。滴加一抗(col-Ⅱ),37℃孵育1 h,PBS 清洗。滴加生物素化山羊抗鼠lgG,20~37℃孵育20 min,PBS清洗。滴加試劑SABC,20~37℃孵育20 min,PBS 清洗。DAB 顯色,蘇木素輕度復(fù)染,依次75%,95%,95%,100%,100%酒精各5 min脫水,二甲苯透明,封片,顯微鏡觀察結(jié)果。

        1.4 蛋白多糖甲苯胺藍染色

        取誘導(dǎo)14 d 的細胞,每組隨機抽取2 盒。PBS 清洗,10%中性甲醛固定,PBS 清洗,加甲苯胺藍染液(注意加前要把染液過濾,以去除雜質(zhì)),50 ℃下20~30 min,或者常溫下2~4 h。蒸餾水洗2次,把爬片固定在載玻片上。95%酒精分色10 s。PBS 洗2 次,封片,然后顯微鏡下觀察。

        1.5 Western Blot檢測col-Ⅱ和integrin的表達

        取誘導(dǎo)14 d 的細胞,每組隨機抽取2 盒。步驟分四步,(1)提取細胞蛋白(冰上操作):用預(yù)冷的PBS 洗滌,加入細胞裂解液裂解20 min,刮取轉(zhuǎn)移至1.5 mL Ep 管,靜置、渦旋,使充分混勻,高速低溫離心機離心,4 ℃下14 000 轉(zhuǎn)/分離心10 min。取上清液并定量取5 μL 按BCA蛋白定量試劑盒說明書操作,在酶標(biāo)儀上進行蛋白濃度定量。煮樣,-20℃保存。(2)SDS-PAGE 電泳:分別配置好分離膠與濃縮膠,蛋白樣品按每孔60 μg 上樣,電泳槽置于冰盆中(4℃環(huán)境),電壓30 伏,待蛋白跑出孔,約30 min,調(diào)電壓60 伏,待蛋白跑進分離膠,約1~2 h。調(diào)電壓120 伏,電泳1.5~2 h。(3)半干式轉(zhuǎn)印:在轉(zhuǎn)膜槽底部陽極的平板上從下往上依次放置濾紙(三張)-PVDF膜-凝膠-濾紙(三張),以橫流轉(zhuǎn)印25~30 min。(4)免疫顯色:轉(zhuǎn)印完畢后室溫下封閉2 h。將PVDF膜與一抗(兔抗鼠col-Ⅱ,兔抗鼠integinβ1)在4 ℃下孵育過夜,TBST洗膜3次,再與辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗室溫孵育1 h,TBST 洗膜3 次,進行ECL 顯色,在暗室中操作,再采用Bio-1D 凝膠成像系統(tǒng)掃描顯影的膠片,并用BioCapt 圖像分析系統(tǒng)進行定量分析(以平均光密度值Density 表示)。

        2 結(jié)果

        2.1 免疫細胞化學(xué)檢測col-II的表達

        在TGF-β3的作用下,誘導(dǎo)組II 型膠原免疫細胞化學(xué)結(jié)果顯示有部分細胞呈陽性;誘導(dǎo)7 d,可見有軟骨細胞分化趨勢;誘導(dǎo)14 d,可見多數(shù)細胞形態(tài)由原來的長形向?qū)挻蟊馄蕉嘟切巫兓粚φ战M與抑制組型膠原表達則為陰性,細胞仍為長形或長梭形,見圖1。

        圖1 免疫細胞化學(xué)檢測col-II的表達

        2.2 甲苯胺藍染色檢測蛋白多糖的表達

        取誘導(dǎo)14 d 的細胞進行甲苯胺藍染色檢測蛋白多糖,可見誘導(dǎo)組的大部分細胞甲苯胺藍異染性著色明顯,蛋白多糖表達陽性,見圖2,左圖為×100,右圖為×200。

        圖2 甲苯胺藍染色檢測蛋白多糖的表達

        2.3 Western Blot檢測col-II蛋白和integrin的表達

        誘導(dǎo)組細胞integrin 的表達量均較抑制組、對照組增多,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),說明細胞膜上的整合素受體被明顯下調(diào),TGF-β3提高了整合素受體的表達量,見圖3。誘導(dǎo)組col-II 的表達量顯著高于抑制組和對照組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01);對照組和抑制組col-II 的表達量則無明顯差異,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見圖4。

        圖3 Western Blot 檢測integrin的表達

        圖4 Western Blot 檢測col-II的表達

        3 討論

        多種原因?qū)е碌能浌菗p傷是臨床常見疾病,但軟骨組織缺乏神經(jīng)支配,痛感遲鈍,致延誤病情,缺乏血管、淋巴,致軟骨再生能力差,故易導(dǎo)致?lián)p傷進行性加重[9],隨著組織工程技術(shù)和干細胞研究的不斷深入,誘導(dǎo)BMSCs分化為軟骨細胞視為目前軟骨再生修復(fù)的主要方法[10],誘導(dǎo)因子在BMSCs定向軟骨分化過程中發(fā)揮著重要作用。

        整合素是一個受體大家族,由α和β兩個亞單位組成,目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有18 個α 亞基和8 個β 亞基,相互之間以非共價鍵結(jié)合,可以形成24 種有功能的異二聚體跨膜糖蛋白[11],分胞膜外區(qū)、胞漿區(qū)和跨膜區(qū)三部分。細胞外區(qū)能結(jié)合細胞外基質(zhì)蛋白,而胞漿區(qū)與細胞骨架相互作用介導(dǎo)細胞形態(tài)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。在BMSCs表面表達的主要整合素受體有β1、α1β1、αvβ3、α2、αL、β2、α5β1[12],整合素介導(dǎo)的黏附作用調(diào)節(jié)著多種細胞功能,包括細胞分化與凋亡、細胞增殖、細胞黏附與遷移,淋巴細胞歸巢等[13]。整合素的調(diào)節(jié)受多種因子的影響,研究最多的是TGF-β、PDGF(血小板衍化生長因子)[14],可以上調(diào)整合素的表達,而某些白細胞分泌的蛋白酶抑制物和細胞中抗腫瘤細胞增殖因子TNF(腫瘤壞死因子)、IL(白細胞介素)等以及抗整合素單克隆抗體[15]則可抑制其表達。有研究則表明:在體外用整合素抗體抑制肢芽間充質(zhì)細胞表面整合素的表達可以抑制肢芽間充質(zhì)細胞軟骨分化[16]。

        TGF-β 與生長分化因子(GDF)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)均屬于TGF 家族,其中TGF-β、BMP 參與軟骨與骨的生成調(diào)節(jié),而TGF-β 是體外軟骨分化的強誘導(dǎo)劑[17]。在人體內(nèi)存在3種形式的TGF-β,分別是TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3,其中TGF-β3誘導(dǎo)成軟骨的作用最強,TGF-β2次之,TGF-β1相對最弱,其誘導(dǎo)生成的Ⅱ型膠原和蛋白多糖的表達均比TGF-β1誘導(dǎo)時產(chǎn)生的量多且時間早。TGF-β3促進MSCs向軟骨方向分化,在5~40 ng/mL 范圍內(nèi)具有時間濃度依賴性,隨著濃度增高和培養(yǎng)時間延長,Ⅱ型膠原的產(chǎn)生逐漸增多;大于40 ng/mL 時,無明顯增多甚至減少。本實驗采用40 ng/mL 濃度的TGF-β3來進行骨髓基質(zhì)干細胞的軟骨方向誘導(dǎo)。

        本研究用10%FBS(胎牛血清)的L-DMEM 培養(yǎng)液(40 ng/mL TGF-β3、地塞米松1×10 mol/L、維生素C50 μg/mL、胰島素6.25 μg/mL),抑制軟骨分化培養(yǎng)液(anti-CD29 單克隆抗體100 ng/mL、地塞米松1×10~7 mol/L、維生素C50 μg/mL、胰島素6.25 μg/mL),在單層培養(yǎng)條件下對大鼠骨髓基質(zhì)干細胞進行誘導(dǎo),誘導(dǎo)1 周時可見Ⅱ型膠原表達,2 周后進行甲苯胺藍染色檢測蛋白多糖的表達,提示有大量蛋白多糖的合成,免疫細胞化學(xué)檢測Ⅱ型膠原表達增多,且細胞形態(tài)由原來的長形或長梭形向扁平寬大多角方向變化,呈現(xiàn)軟骨細胞表型,抑制組和對照組檢查結(jié)果一致。通過Western Blot 實驗得到抑制組integrin 表達明顯少于誘導(dǎo)組,且?guī)缀醪槐磉_II 型膠原蛋白,與對照組結(jié)果相近,而誘導(dǎo)組能高表達integrin,同時II型膠原蛋白表達量亦明顯增多。結(jié)果表明anti-CD29 單克隆抗體能有效抑制integrin 表達水平,從而抑制軟骨形成,而TGF-β3能上調(diào)integrin的表達,促進軟骨分化。

        綜合以上結(jié)果與分析,研究成功用TGF-β3誘導(dǎo)大鼠BMSCs 向軟骨細胞分化,表達軟骨細胞表型,也利用anti-CD29單克隆抗體抑制integrin表達,抑制了信號轉(zhuǎn)導(dǎo),從而阻礙軟骨分化。研究明確了整合素通路可能是影響軟骨分化的重要信號傳導(dǎo)途徑,為修復(fù)軟骨缺損奠定了一定的理論基礎(chǔ),但其具體機制還需要進一步的科學(xué)研究。

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