王召霞，黃煜琪，趙 蓉，杜雨澤，馬曉軍，李冬娜,

（1.天津科技大學(xué)輕工科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457；2.浙江大勝達(dá)包裝股份有限公司，杭州 311215；3.山西工程技術(shù)學(xué)院，陽泉 045000）

傳統(tǒng)石油基高分子聚合物具有耐久性、耐腐蝕性和優(yōu)良的性能，是目前主要的包裝材料來源。然而，由于石油基塑料難以在短時間內(nèi)自然降解，多年來對全球生態(tài)環(huán)境造成了大范圍的污染。同時，塑料制品的工業(yè)化生產(chǎn)也導(dǎo)致了全球能源消耗的速度迅速攀升，石油資源供不應(yīng)求，經(jīng)濟(jì)發(fā)展受到嚴(yán)重阻礙。加之近年來限塑令與雙碳計劃的頒布實施，一方面，人類必須開發(fā)新的清潔能源作為維持全球經(jīng)濟(jì)運(yùn)轉(zhuǎn)的儲備資源；另一方面，迫切需要研發(fā)可降解的塑料以替代不可回收的傳統(tǒng)塑料。生物質(zhì)作為一種清潔低碳、原料豐富且高效的可再生能源，具有顯著的節(jié)能減排效益。我國生物質(zhì)種類眾多，儲量巨大，其中80%以上來自農(nóng)林廢棄物、林業(yè)廢棄物等木質(zhì)纖維素材料[1]。全球每年林業(yè)和農(nóng)業(yè)廢棄物年產(chǎn)量達(dá)1500 億t～2000 億t[2-3]，因此，合理開發(fā)利用這些木質(zhì)資源已成為全球經(jīng)濟(jì)可持續(xù)發(fā)展的重大戰(zhàn)略決策和選擇。

聚蘋果酸（PMA）是一種生物高分子材料，是以唯一的單體L-蘋果酸（L-malic acid，L-MA）通過無數(shù)酯鍵聚合后形成的脂肪族聚合物，具有優(yōu)異的生物相容性、可生物降解性、易修飾性及水溶性，在生物醫(yī)學(xué)材料、可降解塑料、食品包裝材料等方面被廣泛研究，是最具發(fā)展?jié)摿Φ摹熬G色塑料”[4]。近年來，PMA 的生物發(fā)酵技術(shù)成為國內(nèi)外學(xué)者日漸關(guān)注的方向。通過葡萄糖、木糖等為碳源底物被微生物代謝以合成PMA，避免了有毒溶劑的使用，反應(yīng)過程簡單溫和，能耗低，且產(chǎn)物分子量大。然而，PMA 生物發(fā)酵時的碳源成本占總生產(chǎn)成本的60%[5]，限制了PMA 的工業(yè)化生產(chǎn)。由于木質(zhì)生物質(zhì)含豐富的纖維素和半纖維素，能產(chǎn)生大量葡萄糖和木糖，是理想的替代碳源。利用以廉價生物質(zhì)能源制備增值化學(xué)品的現(xiàn)代生物技術(shù)，實現(xiàn)了廢棄木質(zhì)資源轉(zhuǎn)化和高值化利用，同時在一定程度緩解全球能源枯竭和生態(tài)環(huán)境污染的危機(jī)。

1 聚蘋果酸的結(jié)構(gòu)及性質(zhì)

PMA 是一種以L-蘋果酸單體通過38 個酯鍵相互連接而成的一種水溶性脂肪族聚酯化合物，結(jié)構(gòu)簡式為HOOCCH2CH(OH)COOH。在PMA 的分子鏈中，一蘋果酸分子的α-羥基與另一分子的β-羧基是通過酯化作用連接起來的，因此PMA 中存在大量的酯鍵、羥基和自由羧基。PMA 具有3 種結(jié)構(gòu)形態(tài)，分別是α-PMA、β-PMA、γ-PMA，如圖1 所示，其中β 型PMA 是唯一可以在自然界生物體內(nèi)合成的構(gòu)型[6]。

圖1 PMA 的三種結(jié)構(gòu)

生物合成的PMA 經(jīng)分離和純化后，一般以鈣鹽、鈉鹽等鹽的形式或自由酸的形態(tài)存在，經(jīng)過冷凍干燥或噴霧干燥后在常態(tài)下呈白色粉末狀固體[7]。PMA 分子量的變化范圍很大，故沒有固定熔點和玻璃化溫度。商用PMA 溶液呈橘紅色透明狀，密度1.19～1.22 g/cm3，pH 值為1～2。具有高度化學(xué)穩(wěn)定性及熱穩(wěn)定性，分解溫度為330 ℃，不隨水蒸氣揮發(fā)。

PMA 是一種陰離子酸，其分子鏈上存在無數(shù)酯鍵，在無機(jī)酸、酶解及加熱條件（185 ℃）的作用下會發(fā)生水解而斷裂分解成L-MA[8]。L-MA 是生物體內(nèi)三羧酸（TCA）循環(huán)的中間代謝物，能被用作生物體生長代謝的能量[9-10]，其半數(shù)致死量LD50達(dá)3.3 g/kg，故L-MA 和PMA 幾乎沒有毒性，同時PMA 具有優(yōu)異的生物相容性、生物可降解性和無免疫原性等特性[11]。PMA 分子鏈中有許多游離的羧基，應(yīng)用這些具有反應(yīng)活性的羧基基團(tuán)，可與其他功能性分子反應(yīng)，最終形成具有多種功能的納米平臺[12-13]。羧基與某些藥物基團(tuán)的有毒側(cè)鏈結(jié)合后，可降低其毒副作用[14]。由于親水性羧基，PMA 具有良好的水溶性和吸水性。

2 聚蘋果酸的合成方法

2.1 化學(xué)合成法

化學(xué)合成法分為直接聚合和開環(huán)聚合，能夠獲得三種構(gòu)型的PMA。直接聚合法以熔融的L-MA 為原料，在無溶劑或有溶劑（二苯醚）的情況下加入催化劑（氯化亞錫、錫粉或氧化亞錫），于高溫下發(fā)生脫水酯化反應(yīng)，一步形成γ-PMA。此法步驟簡單，但溫度要求高，故非常耗能，且催化劑含毒，產(chǎn)物復(fù)雜，分離提純的難度高，而且制備的PMA 分子量較低（一般為1500～5000 Da），優(yōu)點是簡單方便，使用有機(jī)溶劑少，產(chǎn)率高，能滿足應(yīng)用范圍小的低分子量PMA生產(chǎn)，是相對“綠色”的合成方法。開環(huán)聚合法分兩種：內(nèi)酯開環(huán)聚合和交酯開環(huán)聚合。交酯開環(huán)聚合是以天冬氨酸為初始原料，加入芐醇和硫酸，在NaNO3的作用下取代氨基留下羧基以形成交酯，再通過氫解開環(huán)聚合形成α-PMA。內(nèi)酯開環(huán)聚合是以L-MA 為原料，經(jīng)一系列反應(yīng)形成四元環(huán)狀單體芐酯蘋果酸內(nèi)酯，陰離子開環(huán)聚合得到中間體聚β-蘋果酸芐酯，再用引發(fā)劑氫解而開環(huán)脫芐得到鏈狀β-PMA[15-16]。此法的優(yōu)點是反應(yīng)溫度低，PMA 相對分子量大，能達(dá)幾萬至幾十萬；但是，此法成本高，產(chǎn)率低，反應(yīng)步驟復(fù)雜，產(chǎn)物分離提純難。

2.2 生物合成法

生物合成法是指利用微生物吸收碳源和營養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行代謝和生長，以分泌代謝產(chǎn)物PMA。葡萄糖、木糖、蔗糖、半乳糖、果糖均可被微生物利用以轉(zhuǎn)化PMA，再經(jīng)下游處理后可得到PMA 純品。生物合成法的原料來源廣、資源豐富，反應(yīng)過程溫和、污染小，獲得的PMA 均為β 型、具有相對較高的分子量（6～11 kDa）和純度，分離過程簡單，可以減少石油資源消耗和CO2排放。FENG 等[17]利用細(xì)胞固定化后的A.pullulans CCTCCM2012223 進(jìn)行發(fā)酵合成了約123.7 g/L 的PMA。然而，PMA 發(fā)酵工藝的總成本中，有60%來自精制碳源的制備，如此高昂的成本限制了其工業(yè)生產(chǎn)。利用可再生生物質(zhì)作為替代碳源進(jìn)行PMA 發(fā)酵成為主要的研究方向。但由于優(yōu)產(chǎn)菌株難分離、發(fā)酵過程難控制、發(fā)酵時間長等問題，生物合成PMA 尚未形成大規(guī)模生產(chǎn)。

合成PMA的菌種主要有短梗霉（Aureobasidium sp.），出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans）、多頭絨泡菌（Physarum polycephalum）和圓弧青霉菌（Penicillium cyclopium）等。其中，多頭絨泡菌和圓弧青霉菌產(chǎn)生的PMA 較少，僅2.7～3.3 g/L，無法滿足工業(yè)化生產(chǎn)需求，現(xiàn)已很少報道。NAGATA 等[18]從土壤中篩選、分離并鑒定了一種短梗霉菌株Aureobasidium sp.A-91，分別以甘露糖和葡萄糖為碳源進(jìn)行發(fā)酵，合成了12 g/L 和47 g/L 的PMA。目前，主流生產(chǎn)菌株是出芽短梗霉（Aureobasidium pullulans），其合成的PMA 產(chǎn)量高達(dá)152.5 g/L。出芽短梗霉產(chǎn)生的PMA 主要以PMA-葡聚糖的結(jié)合體分泌到細(xì)胞質(zhì)外。根據(jù)PMA 在丙酮中的高溶解性，通過丙酮沉淀可去除連接的葡聚糖，得到較純的PMA。由于每株出芽短梗霉的生理特征和代謝活性不同，PMA 的生產(chǎn)強(qiáng)度存在很大差別。

3 合成階段的影響因素

為實現(xiàn)PMA 發(fā)酵的優(yōu)化控制，需要對發(fā)酵培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分和發(fā)酵條件有充分的研究和認(rèn)識。碳源、氮源、中和劑、pH 值、接種量等培養(yǎng)基條件的優(yōu)化可以實現(xiàn)對微生物發(fā)酵代謝的控制，從而增加目標(biāo)產(chǎn)物的積累。

3.1 碳源

碳源是發(fā)酵培養(yǎng)基的主要成分之一，為微生物生長提供能源和用以合成菌體生物量的骨架，同時作為底物供菌體合成目的產(chǎn)物。研究發(fā)現(xiàn)，各種糖如葡萄糖、果糖、木糖、半乳糖、麥芽糖、蔗糖和乳糖以及可溶性淀粉、甘油都可以被作為搖瓶中PMA 生產(chǎn)的碳源[19-21]。其中，葡萄糖和蔗糖為碳源時的PMA產(chǎn)量最高，其次是木糖、果糖和麥芽糖。甘油[22]、有機(jī)酸[23]、醇等都可被出芽短梗霉用作碳源發(fā)酵并刺激PMA 生產(chǎn)。殷海松等[24]發(fā)現(xiàn)添加氨基酸也可被菌體作為碳源吸收利用，如天冬氨酸、亮氨酸、纈氨酸和蘇氨酸促進(jìn)了A.pullulans CGMCC3337 菌體生長和PMA 的生產(chǎn)，在最優(yōu)組合的氨基酸條件下獲得了57.89 g/L 的PMA，比未添加氨基酸時提高了40.92%。

3.2 氮源

氮源在菌體生長過程中用于構(gòu)成細(xì)胞組分如酶類、蛋白質(zhì)[25]，同時也作為含氮代謝物合成的底物如氨基酸。研究發(fā)現(xiàn)，有機(jī)氮源（酵母提取物、胰蛋白酶、玉米漿和丁二酸銨等）對PMA 產(chǎn)量的影響無顯著差異[20]，而無機(jī)氮源（NH4NO3、NaNO3、NH4Cl 等）對PMA 合成有顯著影響[26]。而且，氮源的量或碳氮比對菌體生長和PMA 的生產(chǎn)有決定性的影響。WANG等[27]發(fā)現(xiàn)0.1 g/L NH4NO3無法滿足發(fā)酵前期的細(xì)胞生長需要，添加10 g/L NH4NO3時的細(xì)胞生長迅速，但發(fā)酵結(jié)束時仍有未被消耗的NH4+，且不利于PMA生成，當(dāng)在低氮時（2 g/L），PMA 產(chǎn)量最高。生物質(zhì)來源的底物一般本身含有天然氮素，能刺激菌體生長繁殖。LEATHERS 等[28]利用A.pullulans 50383 在含最低總氮含量的大麥秸稈水解物中獲得了更高的PMA 產(chǎn)量。CHENG 等[29]用玉米漿作為氮源，發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充甘蔗汁或大豆糖蜜會降低PMA 產(chǎn)量，因為過多的氮源促進(jìn)了細(xì)胞生長而不是PMA 合成。

3.3 pH 值和中和劑

培養(yǎng)基的pH 值會直接影響到微生物菌體細(xì)胞膜的通透性，從而影響微生物對培養(yǎng)基內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)及微量元素的吸收利用。A.pullulans 適合在酸性環(huán)境中生長，但pH 過低也會影響PMA 合成。研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基初始pH 值為4.0～6.0 時，有利于PMA 的合成[11]。靳挺等[30]研究了初始pH（4.0，4.5，5.0，5.5，6.0）對發(fā)酵的影響，隨著pH 的升高，PMA 產(chǎn)量逐漸增加，并在初始pH 值為5.5 時，PMA 的最高產(chǎn)量達(dá)16.58 g/L。CAO 等[31]研究發(fā)現(xiàn)，控制pH=6.0 及溶解氧濃度大于70%，能顯著促進(jìn)A.pullulans ipe-1 酵母形態(tài)細(xì)胞的比例，并提高PMA 的濃度，且在pH＜5時，PMA 被水解了，同時多糖增加。LI 等[32]發(fā)現(xiàn)，在pH 為3 的 條 件 下，A.pullulans NG 會 形 成 厚 垣 孢子，抑制PMA 的產(chǎn)生。PMA 呈酸性，在發(fā)酵過程中隨著PMA 的積累，發(fā)酵液的pH 會大幅降低。因此，需要加入中和劑以維持pH 平衡。

在傳統(tǒng)發(fā)酵工藝中，CaCO3是最普遍使用的中和劑，能維持發(fā)酵液pH 穩(wěn)定在適合菌體生長的范圍[27]。外源性Ca2+可以增加短梗霉酵母樣細(xì)胞的形成，從而減少酵母細(xì)胞向菌絲體的轉(zhuǎn)化。CaCO3的加入可誘導(dǎo)L-MA 的生成切換到還原途徑，并導(dǎo)致用于PMA 生產(chǎn)的L-MA 的積累。此外，CaCO3以HCO3-的形式提供CO2，為微生物CO2固定提供了充足的底物。

3.4 接種量

接種量決定了A.pullulans 在搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)中的生長繁殖速度，接種量越大，發(fā)酵瓶內(nèi)A.pullulans繁殖達(dá)到高峰的時間越短，PMA 得率越高。但是，如果接種濃度過高會導(dǎo)致溶解氧不足，影響產(chǎn)物的合成，產(chǎn)生過多代謝廢物；接種濃度過低則會延長培養(yǎng)時間，并降低發(fā)酵產(chǎn)量。在實際生物發(fā)酵過程中，菌株種類、培養(yǎng)基配方、其他發(fā)酵條件等都會影響接種量的變化。李睿穎等[33]對高細(xì)胞通透性的A.pullulans TJZK-BA21682 生產(chǎn)PMA 發(fā)酵過程中的接種量進(jìn)行了優(yōu)化，得出其最佳接種量為8%，當(dāng)接種量過大或過小都會抑制PMA 的合成。

4 木質(zhì)資源生物轉(zhuǎn)化PMA 的研究進(jìn)展

木質(zhì)資源的成分主要為纖維素、半纖維素及木質(zhì)素，也存在少量果膠、樹膠、藻膠和瓊脂等，其結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜[34]。在新型生物能源發(fā)酵技術(shù)中，木質(zhì)資源中的纖維素和半纖維素具有非常高的利用價值。纖維素鏈經(jīng)纖維素內(nèi)切酶、外切酶與β-糖苷酶水解后可產(chǎn)生大量葡萄糖[35]。而半纖維素可被水解轉(zhuǎn)化成豐富的單糖如己糖（葡萄糖、甘露糖和半乳糖）和戊糖（木糖和阿拉伯糖），以及含量很低的鼠李糖和果糖。利用廢棄木質(zhì)資源作為底物發(fā)酵生產(chǎn)PMA 成為廣大科技工作者的研究重心，因為，該原料不僅成本低廉，而且由其轉(zhuǎn)化合成的PMA 產(chǎn)量最高可達(dá)114.4 g/L，產(chǎn)物分子量與用精制糖發(fā)酵時的基本一樣，具有極高的經(jīng)濟(jì)效益。目前，已經(jīng)有研究將大麥秸稈、小麥秸稈、玉米、玉米芯、大豆殼、甘蔗渣、生甘薯、菊芋莖塊等可再生木質(zhì)資源制備成可發(fā)酵糖，代替精制碳源應(yīng)用于PMA 的低成本發(fā)酵生產(chǎn)，如表1 所示。

表1 出芽短梗霉利用不同木質(zhì)資源生產(chǎn)PMA

CHENG 等[29]發(fā)現(xiàn)A.pullulans ZX-10 將大豆糖蜜中的所有碳水化合全部轉(zhuǎn)化為PMA，且在氮限制發(fā)酵中的PMA 產(chǎn)量為71.9 g/L，得率為0.69 g/g。WEI 等[36]發(fā)現(xiàn)甘蔗汁可以作為經(jīng)濟(jì)的底物，發(fā)酵過程中無需任何預(yù)處理或營養(yǎng)補(bǔ)充，獲得了116.3 g/L的高PMA 效價和0.41 g/g 的得率。LEATHERS 等[28]利用堿性H2O2預(yù)處理后的玉米纖維和小麥秸稈作為唯一碳源合成了20 g/L 以上的PMA。ZAN 等[37]利用廉價的生甘薯水解物作為底物，在有氧纖維床生物反應(yīng)器中合成了最高產(chǎn)量為57.5 g/L 的PMA。ZOU 等[38]發(fā)現(xiàn)，由農(nóng)業(yè)廢棄物玉米芯制備的水解液可以很好地用于分批發(fā)酵生產(chǎn)28.6 g/L 的PMA。XIA 等[39]使用經(jīng)簡化后的菊芋莖（JA）水解物組成的培養(yǎng)基，發(fā)現(xiàn)JA 提高了丙酮酸羧化酶和蘋果酸脫氫酶活性，從而獲得了比葡萄糖培養(yǎng)基更高的PMA濃度（114.4 g/L），而且在不添加外源氮源下，預(yù)處理后JA 中的生產(chǎn)率比單一葡萄糖高了2 倍。YEGIN等[40]使用稀酸預(yù)處理的大麥秸稈制備了一種水解液，其總發(fā)酵糖可達(dá)94.60 g/L，并且促進(jìn)PMA 產(chǎn)量達(dá)35.76 g/L，得率為0.39 g/g。XIA 等[41]利用農(nóng)產(chǎn)工業(yè)廢渣通過固態(tài)發(fā)酵的方法由A.pullulans HA-4D從甘薯渣和麥麩（質(zhì)量比1∶1）的混合底物生產(chǎn)PMA，最高產(chǎn)量達(dá)75.4 mg/g。CAO 等[42]以甘蔗渣水解液為原料合成PMA，發(fā)現(xiàn)將酸和酶水解產(chǎn)物混合不利于PMA 的生產(chǎn)。利用甘蔗渣酶水解產(chǎn)物生產(chǎn)PMA 的產(chǎn)量比由酸水解產(chǎn)物獲得PMA 的產(chǎn)量高25.4%，說明酸水解產(chǎn)物更有利于微生物細(xì)胞生長，對PMA 產(chǎn)量的增加沒有顯著影響。WANG 等[43]選擇具有高營養(yǎng)價值和低成本特性的玉米浸液作為生長因子發(fā)酵合成PMA，在添加3 g/L 玉米浸液后，PMA的產(chǎn)量和微生物細(xì)胞生長分別提高了32.8%和41.8%。

5 總結(jié)與展望

PMA 是一種非常有前途的高分子聚合物，具有廣泛的應(yīng)用前景，然而碳源的高成本和低產(chǎn)物得率使得大多數(shù)研究依然停留在實驗室階段，阻礙了PMA 的大規(guī)模生產(chǎn)。基于此，研究者探索了以成本低廉的木質(zhì)資源為碳源底物生物轉(zhuǎn)化PMA 的潛力，取得了顯著成效。但還存在一些問題和挑戰(zhàn)：

（1）由于木質(zhì)素的存在，大部分來源于木質(zhì)資源的原料在進(jìn)行水解預(yù)處理時會產(chǎn)生許多木質(zhì)纖維素抑制物（如糠醛、5-羥甲基糠醛、乙酸、甲酸等），這類物質(zhì)對微生物的生長和代謝具有明顯的抑制作用。為了去除或減少這些消極影響，一般需要通過化學(xué)還原、物理吸附或加入生物酶的方法對水解液進(jìn)行解毒。這增加了成本負(fù)擔(dān)，還存在糖損失、廢料和抑制物回收困難等問題，使用的化學(xué)試劑和吸附樹脂也對環(huán)境造成了一定壓力。

（2）大部分來自農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物的廢材本身含有復(fù)雜的重金屬離子、油脂和農(nóng)藥殘留，從而造成可發(fā)酵糖轉(zhuǎn)化率低和糖酸轉(zhuǎn)化率低等問題。而玉米、甘薯這類農(nóng)業(yè)作物富含淀粉，是A.pullulans 代謝的優(yōu)質(zhì)碳水化合物，能夠產(chǎn)生高效價的PMA（10.1～123.7 g/L）。但是，這類農(nóng)業(yè)生物質(zhì)是全球范圍的主要糧食作物，需求量極大，不太適合于PMA 的商業(yè)化生產(chǎn)。因此，開發(fā)低毒、低成本、高營養(yǎng)且不與食品供應(yīng)鏈競爭的木質(zhì)生物質(zhì)碳源是今后研究的主要方向。