黎俏 綜述 高天旸 審校

1.南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510515；2.東莞康華醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，廣東 東莞 523080；3.廣東省第二人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，廣東 廣州 518025

最新證據(jù)表明，免疫系統(tǒng)在生殖相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[1]。子宮自然殺傷細(xì)胞(uNK)是天然免疫調(diào)節(jié)中的一種淋巴細(xì)胞亞群，是妊娠后母胎界面中重要的免疫細(xì)胞。早期人類對uNK 細(xì)胞在生殖系統(tǒng)的作用可能存在一些錯誤的認(rèn)識，主要是基于對外周血自然殺傷(pbNK)細(xì)胞的相關(guān)研究，認(rèn)為uNK細(xì)胞也有類似pbNK 的毒性作用，對生殖過程有不良影響。但越來越多的證據(jù)顯示，uNK 細(xì)胞和pbNK 細(xì)胞具有不同表型和功能特征，uNK在生殖過程中扮演有益的角色，是實(shí)現(xiàn)胚胎植入、維持妊娠的基礎(chǔ)保障。妊娠是一個免疫過程，因?yàn)閮蓚€基因不同的個體并存。母體淋巴細(xì)胞里的T 細(xì)胞和大量獨(dú)特的uNK 細(xì)胞可以識別子宮母胎界面的胎盤細(xì)胞，存在多種避免T細(xì)胞損傷胎兒的保護(hù)機(jī)制，從而猜測uNK細(xì)胞的激活可能是生理性的，uNK細(xì)胞對胎盤細(xì)胞的同種異體識別成為調(diào)節(jié)胎盤功能的關(guān)鍵母嬰免疫機(jī)制。近年研究表明，uNK細(xì)胞與胚胎種植和早期胎盤功能等密切相關(guān)，其維持著胎兒和母體間的平衡，一旦失去平衡，就會導(dǎo)致反復(fù)著床失敗或復(fù)發(fā)性流產(chǎn)等妊娠相關(guān)疾病[2]。隨后廣泛的研究表明了uNK細(xì)胞在妊娠期間的各種作用，包括新血管的形成、滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移和免疫耐受等。然而，目前還不清楚uNK細(xì)胞在正常和病理性妊娠中的具體功能，所以須謹(jǐn)慎對待任何抑制NK細(xì)胞的療法。本文就uNK細(xì)胞在胚胎種植過程中發(fā)揮作用的研究進(jìn)展做一綜述。

1 母胎界面發(fā)育

母胎界面是子宮黏膜和胚胎的胚外組織的連接交界處，其作為兩個同種異體之間交流的平臺。滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵入啟動母胎屏障的形成，這些滋養(yǎng)層細(xì)胞來源于胚胎的囊胚層以及子宮內(nèi)膜。在人類胚胎發(fā)育過程中，滋養(yǎng)層細(xì)胞分化為兩個亞群：絨毛滋養(yǎng)層(VTs)和絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞(EVTs)。EVTs侵入血管內(nèi)壁，重建螺旋動脈，而VTs形成絨毛膜絨毛，絨毛膜絨毛位于絨毛的表面，具有向胎兒運(yùn)輸營養(yǎng)和氧氣的能力[3]。滋養(yǎng)細(xì)胞是胚胎外組織中最常見的細(xì)胞類型，它們幫助在胎盤一側(cè)形成葉狀絨毛膜和底蛻膜以及在另一側(cè)形成絨毛膜羊膜。子宮內(nèi)膜通過蛻膜化的特殊組織反應(yīng)來幫助胚胎及胎盤的發(fā)育和功能。蛻膜化是母胎關(guān)系發(fā)展的重要過程。其特征是黏膜基質(zhì)細(xì)胞(ESCs)增殖分化為具有豐富細(xì)胞質(zhì)的大塊球形細(xì)胞，以及蛻膜基質(zhì)細(xì)胞的核和表型變化。隨著胚胎的擴(kuò)張和細(xì)胞滋養(yǎng)層細(xì)胞的侵入生長，子宮內(nèi)膜布滿螺旋動脈的蛻膜。子宮腺體、基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞共同作用以實(shí)現(xiàn)蛻膜化。胚胎發(fā)育的最重要條件之一是子宮內(nèi)膜蛻膜化。妊娠早期蛻膜化伴隨免疫細(xì)胞的增加，其占總蛻膜細(xì)胞的40%，這些細(xì)胞同時對子宮腺體及胎盤組織有營養(yǎng)作用。缺乏蛻膜化可能會導(dǎo)致其他一些妊娠相關(guān)的疾病[4]，如不孕癥、復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)(RSA)、胎兒子宮內(nèi)生長受限(IUGR)等。

2 NK細(xì)胞

2.1 NK細(xì)胞發(fā)育的細(xì)胞階段 免疫學(xué)家一直被母親和胎兒之間的聯(lián)系所吸引。Fukui 等[5]在1953 年首次描述了半異基因胎兒的存活情況，以此來說明母親對胎兒的免疫耐受性。近年來，主動免疫的概念得到了普及，支持植入部位的免疫系統(tǒng)不受抑制的觀點(diǎn)，說明它是功能性的。最近的研究結(jié)果表明，胎兒細(xì)胞和母親的免疫細(xì)胞包括先天淋巴細(xì)胞(ILC)、T調(diào)節(jié)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等，它們可進(jìn)行雙向免疫對話[6]。在人類中，NK 細(xì)胞是一種高度特化的大顆粒淋巴細(xì)胞亞群，約占全部循環(huán)淋巴細(xì)胞的15%[7]。它們是大型細(xì)胞毒性先天淋巴細(xì)胞，可在免疫學(xué)上調(diào)節(jié)白細(xì)胞活化和實(shí)現(xiàn)微生物感染監(jiān)測。由于它們具有將病毒感染和癌細(xì)胞與健康細(xì)胞區(qū)分開來的潛力，無需預(yù)先致敏，因此被稱為“天然”殺手。IFN-γ和TNF-α是NK細(xì)胞分泌的兩種炎癥介質(zhì)，它們介導(dǎo)細(xì)胞毒性并產(chǎn)生大量炎癥細(xì)胞因子[8]。NK 細(xì)胞存在于骨髓、肝臟、子宮、脾臟和肺中，也有少量發(fā)現(xiàn)在次級淋巴組織(SLT)、黏膜相關(guān)淋巴組織(MALT)和胸腺中[9]。與其他血細(xì)胞一樣，NK 細(xì)胞起源于骨髓來源的多能祖細(xì)胞，即CD34+造血干細(xì)胞(HSC)。人類NK 細(xì)胞的發(fā)育通過由各種細(xì)胞表面標(biāo)志物受體的存在定義為多階段的分化過程，共分為五個階段[10]：第一階段，CD34+CD117+CD123+/+FLT3+；第二階段，CD34+CD117+CD123+FLT3+CD127+；第三階段，CD38+CD117+CD123+CD45+CD7+CD10+CD127+；第四階段，CD34+CD117+/+CD94+CD16+(也稱為CD56bright)；第五階段，CD34-CD117-/+CD94+CD16+(也稱為CD56dim)。CD56+CD16+和CD56-CD16+是基于CD16 表達(dá)的人類常見NK細(xì)胞的兩個亞群[11]。CD56+NK細(xì)胞群產(chǎn)生大量的IFN-γ，并隨著細(xì)胞因子IL-2、IL-12、IL-15或IL-18的增加而增殖，但它對靶細(xì)胞識別沒有反應(yīng)并且具有低殺傷力。另一方面，CD56 缺陷型(CD56+)NK細(xì)胞大多具有細(xì)胞毒性，并且產(chǎn)生較少的IFN-γ。最近發(fā)現(xiàn)了一部分新的NK 細(xì)胞，即CD56-CD16-的NK 細(xì)胞亞群，其表面受體譜介于CD56+的和CD56-之間，能產(chǎn)生IFN-γ和細(xì)胞毒性[12]。

2.2 uNK細(xì)胞的起源 長期以來，研究人員一直好奇于妊娠期間uNK 細(xì)胞的起源。根據(jù)一項(xiàng)動物研究，子宮中NK細(xì)胞的形成和成熟與其他組織中的NK細(xì)胞發(fā)育具有一些共同特征，同時也表現(xiàn)出組織特異性，因此它們有利于塑造母胎界面發(fā)育過程中發(fā)生的結(jié)構(gòu)變化[13]。也有人提出，免疫過程通過復(fù)雜的信號通路為uNK細(xì)胞活化、增殖和分化建立了一個平衡的環(huán)境[14]。曾有報(bào)道在小鼠處女子宮中，外周循環(huán)中的CD49a-DX5+cNK 細(xì)胞很少，但卻存在大量的CD49a+DX5+trNK細(xì)胞[15]。這些trNK細(xì)胞不同于肝臟和皮膚組織中發(fā)現(xiàn)的其他trNK 細(xì)胞，因?yàn)樗鼈內(nèi)狈-bet 轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，并被識別為NK細(xì)胞的獨(dú)特譜。此外，在妊娠小鼠較處女小鼠子宮中發(fā)現(xiàn)高比例的trNK 細(xì)胞，表明其可能通過妊娠期間的局部增殖，同時trNK細(xì)胞可能有助于uNK 細(xì)胞的積累。此外，通過實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)蛻膜化的試驗(yàn)證實(shí)，在早期妊娠模型中，在trNK細(xì)胞局部增殖時，遷移的循環(huán)NK(cNK)細(xì)胞貢獻(xiàn)較少[16]。相反，Sojka等[14-15]2018年收集的數(shù)據(jù)并沒有真正忽略cNK細(xì)胞的貢獻(xiàn)，因?yàn)樗鼈兊臄?shù)量也是從外周循環(huán)血積累的。因此作者提出了一個兩波假設(shè)[16]，以支持cNK細(xì)胞和trNK細(xì)胞在懷孕期間有利于對uNK細(xì)胞積累。第一波為在子宮內(nèi)膜重塑期間蛻膜化過程中開始。根據(jù)研究結(jié)果，這種波是由局部trNK細(xì)胞增殖引起的，cNK細(xì)胞對妊娠早期uNK細(xì)胞池的增長貢獻(xiàn)最小。第二波在形成胎盤過程中參與的cNK 細(xì)胞，包括血管重塑。缺乏cNK細(xì)胞但保留trNK細(xì)胞的小鼠，如Nfil3小鼠，在uNK細(xì)胞積累方面表現(xiàn)出顯著缺陷，胎盤不理想，螺旋動脈重塑異常。總的來說，這些發(fā)現(xiàn)表明trNK 細(xì)胞和外周循環(huán)血cNK 細(xì)胞都是在妊娠期間的uNK細(xì)胞匯集中發(fā)揮作用的。

2.3 uNK 細(xì)胞的功能 uNK 細(xì)胞在月經(jīng)周期呈周期性表達(dá)特點(diǎn)，在妊娠后母胎界面表達(dá)顯著升高，受到甾體激素的精細(xì)調(diào)節(jié)。uNK 細(xì)胞通過其表達(dá)的受體與EVTs上配體相互作用，在維持免疫耐受、實(shí)現(xiàn)螺旋動脈重塑、控制滋養(yǎng)層侵襲和促進(jìn)胎盤發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用[17]。uNK 細(xì)胞表達(dá)許多受體，包括殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(KIRs)等，EVTs 表達(dá)I類HLA-C/E/G/F的MHC分子，具有高度多態(tài)性。KIR/HLA-C的不同組合與復(fù)發(fā)性流產(chǎn)、先兆子癇和胎兒生長受限等相關(guān)，影響妊娠結(jié)局。

3 反復(fù)著床失敗中的NK細(xì)胞的功能

當(dāng)有證據(jù)表明沒有發(fā)生植入時，通常被診斷為植入失敗[18]。目前對于反復(fù)著床失敗(repeated/recurrent implantation failure，RIF)的定義診斷標(biāo)準(zhǔn)尚未統(tǒng)一，目前國內(nèi)外較為公認(rèn)的RIF 定義是：經(jīng)歷3 次及以上移植周期，且累積移植至少4 枚卵裂期優(yōu)質(zhì)胚胎而未獲臨床妊娠[19]。IVF/ICSI-ET周期中胚胎著床率約30%，反復(fù)著床失敗的發(fā)生率為5%～10%[20]。有研究表明RIF 經(jīng)常由有功能缺陷的子宮內(nèi)膜引起，約25%的RIF 患者種植窗發(fā)生置換，因此uNK 細(xì)胞在植入期的預(yù)測中起著重要作用，這表明它們可能導(dǎo)致胚胎植入失敗[21]。曾有研究報(bào)告顯示，與正?？缮龐D女組相比，有不明原因的反復(fù)植入失敗史的婦女在妊娠前子宮內(nèi)膜中存在更多數(shù)量的uNK細(xì)胞，從而推測uNK可能參與RIF[22]。此外，在分泌中期，與正常生育女性組對照相比，IVF 后患有RIF 的女性顯示出uNK 細(xì)胞在基質(zhì)細(xì)胞中的比例顯著增加，同時顯示uNK細(xì)胞數(shù)量與IL-15 的基質(zhì)表達(dá)相關(guān)。同樣，一項(xiàng)隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)，患有RIF 的女性子宮內(nèi)膜IL-12 或IL-18 水平較高，這可能與較高的uNK細(xì)胞數(shù)量有關(guān)[23]。另外一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，與IVF后胚胎著床的女性相比，RIF 女性的uNK 細(xì)胞與子宮內(nèi)膜小動脈的數(shù)量和分布沒有顯著差異[24]。在一項(xiàng)系統(tǒng)分析中，將患有RIF 的女性與對照組進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜中pNK 或uNK 細(xì)胞沒有差異[25]。綜上，目前各種研究的結(jié)果參差不齊，盡管在臨床研究中廣泛使用了各種細(xì)胞計(jì)數(shù)測量，但目前還沒有確鑿的證據(jù)表明uNK 細(xì)胞參與了妊娠病理。因此在RIF環(huán)境中檢測pbNK或uNK細(xì)胞需要進(jìn)一步研究。

4 妊娠并發(fā)癥治療的免疫調(diào)節(jié)策略

正常的妊娠過程是母體免疫系統(tǒng)和胎兒抗原共同作用的結(jié)果，該免疫系統(tǒng)適應(yīng)失敗可導(dǎo)致母胎發(fā)生同種免疫排斥反應(yīng)，導(dǎo)致各種妊娠的相關(guān)并發(fā)癥。為了積極改變母體免疫系統(tǒng)或減少過度的免疫反應(yīng)所產(chǎn)生的破壞，臨床上常用免疫調(diào)節(jié)藥物用于治療妊娠相關(guān)并發(fā)癥，如糖皮質(zhì)激素、靜脈注射免疫球蛋白(IVIG)和抗TNFα藥物等。先前的研究表明，適當(dāng)?shù)膁NK(定位于基底蛻膜的uNK 細(xì)胞)細(xì)胞生理性能可確保健康懷孕，但降低dNK 細(xì)胞功能會導(dǎo)致妊娠失敗[26]。盡管dNK 細(xì)胞功能障礙的實(shí)際病因尚不清楚，但維持NK 細(xì)胞的正確激活狀態(tài)對于每次正常妊娠都至關(guān)重要，因此，其在抑制NK 細(xì)胞功能的治療中可能會增加風(fēng)險。

自從發(fā)現(xiàn)NK 細(xì)胞代表著床和妊娠早期子宮內(nèi)膜基質(zhì)的關(guān)鍵白細(xì)胞成分以來，臨床已經(jīng)對NK 細(xì)胞進(jìn)行了很多研究。盡管在了解NK細(xì)胞的作用方面取得了重大進(jìn)展，但人體組織的可用性和從動物模型推斷的局限性限制了臨床對妊娠早期階段的研究。uNK細(xì)胞的功能研究揭示了它們的功能，特別強(qiáng)調(diào)細(xì)胞因子和血管生成生長因子的釋放，以及妊娠早期的螺旋動脈重塑。研究表明NK 細(xì)胞計(jì)數(shù)在反復(fù)種植失敗患者中發(fā)生了改變，但其功能影響尚不清楚。在發(fā)現(xiàn)有效的診斷和治療方法之前，了解uNK 細(xì)胞數(shù)量增加的機(jī)制以及功能后果至關(guān)重要。此外，在未來的研究中，應(yīng)研究男性變量(如精液成分)對uNK 細(xì)胞分化和反復(fù)著床失敗的可能影響。此外，了解子宮中不同細(xì)胞類型之間的串?dāng)_環(huán)境是有限的，未來的研究還應(yīng)該闡明這些相互作用在各種生理和病理情況下的復(fù)雜性。

5 展望

uNK 細(xì)胞在水平上的研究仍存在技術(shù)上的局限性，因此仍有很多未知值得進(jìn)一步探索，特別是關(guān)于uNK 細(xì)胞的確切起源和功能。復(fù)雜性是生殖免疫相關(guān)研究的主要特點(diǎn)，主要表現(xiàn)為參與分子的多樣性、效應(yīng)作用水平的差異性(分子、細(xì)胞、組織水平等)，以及遺傳組合的多態(tài)性。未來利用新的分子和遺傳學(xué)方法進(jìn)行研究有助于確定uNK 細(xì)胞與母胎界面其他細(xì)胞的相互作用機(jī)制，并在未來實(shí)現(xiàn)臨床轉(zhuǎn)化應(yīng)用。基于既往pbNK 細(xì)胞的相關(guān)研究，目前臨床針對反復(fù)種植失敗(RIF)和復(fù)發(fā)性流產(chǎn)(RM)已開展不同的免疫治療方法，包括：父系淋巴細(xì)胞主動免疫、類固醇、TNFa 抑制劑、靜脈輸注免疫球蛋白(IVIG)、脂肪乳以及宮腔灌注重組人粒細(xì)胞集落刺激因子(r-GSF)等，用于治療uNK 細(xì)胞的“過度”免疫反應(yīng)。但研究結(jié)果存在很大爭議，一些方法已逐漸被停用。此外，現(xiàn)有研究大多集中在尋找外周血中的標(biāo)志物pbNK，并不直接針對uNK 細(xì)胞，對療法缺乏業(yè)內(nèi)共識，研究設(shè)計(jì)存在很大局限性。未來需要更多設(shè)計(jì)良好、樣本量更大的前瞻性隨機(jī)對照研究，以便更客觀、更完整地評估相關(guān)免疫療法的療效、可靠性，特別是關(guān)注這些治療方法的安全性。因此，對于相關(guān)“免疫療法”的臨床應(yīng)用，仍應(yīng)該保持謹(jǐn)慎的態(tài)度。