范忠誠(chéng), 王琮仁, 符策崗, 陳曉峰

1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬海口醫(yī)院 骨科中心,海南 海口 570208;2.?？谑泄强婆c糖尿病醫(yī)院 骨科中心,海南 海口 570208

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是由關(guān)節(jié)軟骨缺陷引起的關(guān)節(jié)疾病[2]。OA是老年人常見(jiàn)的關(guān)節(jié)疾病,常導(dǎo)致疼痛和功能限制,最終降低生活質(zhì)量[2]。然而,OA的分子發(fā)病機(jī)制尚不明確,因此,治療策略的發(fā)展受到限制[3]。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA,LncRNA)是一類長(zhǎng)度>200 nt的RNA。大量研究報(bào)道,多種失調(diào)的LncRNA參與了OA的發(fā)生發(fā)展[4-7]。LncRNA HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA(HOX transcript antisense RNA,HOTAIR)位于12q13.13,是具有反式作用的LncRNA[8]。已有研究證實(shí),LncRNA HOTAIR上調(diào)可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、集落形成、遷移和侵襲[7]。但其在OA發(fā)病中的潛在分子機(jī)制尚處于初步探索階段[9]。本研究旨在探討LncRNA HOTAIR/miR-519c-3p/骨形成蛋白Ⅱ型受體(bone morphogenetic protein receptor 2,BMPR2)信號(hào)軸在OA進(jìn)展中的作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 細(xì)胞購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。脂多糖購(gòu)自北京索萊寶公司;SYBR Premix Ex Taq GC試劑盒購(gòu)自TAKARA公司;雙螢光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega公司;CCK-8試劑購(gòu)自TargetMol公司。

1.2 研究方法

1.2.1 微小RNA-519c-3p過(guò)表達(dá) 細(xì)胞接種于6孔板過(guò)夜培養(yǎng)后,微小RNA-519c-3p(microRNA-519c-3p,miR-519c-3p)過(guò)表達(dá)慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞,24 h后獲得miR-519c-3p過(guò)表達(dá)細(xì)胞系。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定 在4℃條件下于平板上包被抗體過(guò)夜,封閉后將上清樣品加入孔中與抗體進(jìn)行孵育。進(jìn)行顯色,終止后測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處吸光光度值。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè) TRIzol RNA試劑提取總RNA,檢測(cè)RNA濃度后逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,通過(guò)SYBR Premix Ex Taq GC試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡 細(xì)胞樣品冰上裂解后,BCA試劑盒測(cè)定濃度,上樣30 μg聚丙烯酰胺凝膠電泳,轉(zhuǎn)印至PVDF膜,5%脫脂奶粉室溫封閉1 h,加入一抗后于4℃孵育過(guò)夜。次日復(fù)溫清洗后二抗孵育2 h,顯影檢測(cè)蛋白表達(dá)?？贵w均購(gòu)于Abcam公司。

1.2.5 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 根據(jù)預(yù)測(cè)的結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物,并構(gòu)建LncRNA HOTAIR野生型和突變型雙熒光素酶載體。各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后,參照試劑盒操作說(shuō)明檢測(cè)熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 LncRNA HOTAIR負(fù)向調(diào)控miR-519c-3p的表達(dá) ENCORI網(wǎng)站預(yù)測(cè)LncRNA HOTAIR可能與miR-519c-3p結(jié)合(圖1a)。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示,與HOTAIR-WT質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染時(shí),miR-519c-3p組熒光素酶活性低于對(duì)照組,組間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與HOTAIR-MUT質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染時(shí),對(duì)照組與miR-519c-3p組熒光素酶活性比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)圖1b。RIP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示,miR-519c-3p組細(xì)胞與Ago2抗體結(jié)合的樣品中LncRNA HOTAIR的富集顯著(P<0.05,圖1c)。LncRNA HOTAIR在生物素化的miR-519c-3p的吸附物中也顯著富集(P<0.05,圖1d)。qRT-PCR結(jié)果顯示,si-HOTAIR組miR-519c-3p的相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖1e);HOTAIR組miR-519c-3p的相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖1f)。

圖1 LncRNA HOTAIR負(fù)向調(diào)控miR-519c-3p的表達(dá)(a.生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測(cè)位點(diǎn);b.細(xì)胞中的熒光素酶活性;c.Ago2在不同組細(xì)胞中富集LncRNA HOTAIR;d.生物素在不同組細(xì)胞中富集LncRNA HOTAIR;e.si-HOTAIR組miR-519c-3p的相對(duì)表達(dá)情況;f.HOTAIR組miR-519c-3p的相對(duì)表達(dá)情況)

2.2 miR-519c-3p的過(guò)表達(dá)抑制了人軟骨細(xì)胞OA的進(jìn)展 qRT-PCR結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染miR-519c-3p模擬物后,miR-519c-3p組miR-519c-3p相對(duì)表達(dá)量高于NC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖2a)。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與NC組比較,miR-519c-3p組軟骨細(xì)胞增殖速度變慢(P<0.05,圖2b)。qRT-PCR結(jié)果顯示,與NC組比較,miR-519c-3p過(guò)表達(dá)后,細(xì)胞中降基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metallopeptidase,MMP)3、MMP9、MMP13、含Ⅰ型血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶(ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif,ADAMTS)4、ADAMTS5及促炎因子白細(xì)胞介素(interleukin,IL)-1β、IL-6和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor alpha,TNF-α)的mRNA水平顯著降低,而COL2A1、SOX9和Aggrecan的mRNA水平升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖2c、d)。蛋白質(zhì)印跡(western blot,WB)結(jié)果顯示,與NC組比較,miR-519c-3p組MMP3、MMP9、MMP13、ADAMTS4、ADAMTS5蛋白表達(dá)水平降低,COL2A1、SOX9蛋白表達(dá)水平升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖2e)。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)結(jié)果顯示,與NC組比較,miR-519c-3p組的IL-1β、IL-6、TNF-α水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖2f)。

圖2 miR-519c-3p過(guò)表達(dá)抑制人軟骨細(xì)胞OA的進(jìn)展(a.miR-519c-3pRNA的表達(dá)水平;b.各組細(xì)胞的生長(zhǎng)情況;c.各組細(xì)胞中OA相關(guān)基因的mRNA表達(dá)水平;d.OA相關(guān)基因在不同組細(xì)胞中的mRNA表達(dá)水平;e.各組細(xì)胞中OA相關(guān)基因的蛋白表達(dá)水平;f.各組細(xì)胞上清中促炎因子的表達(dá)水平)

2.3 miR-519c-3p負(fù)向調(diào)控BMPR2的表達(dá) 生物信息學(xué)網(wǎng)站TargetScanHuman預(yù)測(cè)BMPR2是miR-519c-3p的下游靶點(diǎn)(圖3a)。雙熒光素酶報(bào)告的結(jié)果如下:miR-NC或miR-519c-3p 與BMPR2-WT共轉(zhuǎn)染細(xì)胞后,NC組熒光素酶活性高于miR-519c-3p組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),但二者與BMPR2-MUT共轉(zhuǎn)染組間的熒光素酶活性比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,圖3b)。qRT-PCR結(jié)果及WB結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR-519c-3p過(guò)表達(dá)后,miR-519c-3p組BMPR2的mRNA及蛋白表達(dá)水平低于NC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);miR-519c-3p表達(dá)被抑制后,miR-519c-3p sponge組的BMPR2的mRNA及蛋白表達(dá)水平高于miR-NC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3c、d。此外,當(dāng)細(xì)胞過(guò)表達(dá)LncRNA HOTAIR后,HOTAIR組的BMPR2的mRNA及蛋白表達(dá)水平高于Control組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);LncRNA HOTAIR表達(dá)被抑制后,siHOTAIR組的BMPR2的mRNA及蛋白表達(dá)低于siNC組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖3e、f)。

圖3 miR-519c-3p負(fù)向調(diào)控BMPR2的表達(dá)(a.生物信息學(xué)網(wǎng)站TargetScanHuman 8.0預(yù)測(cè)二者結(jié)合位點(diǎn);b.各組細(xì)胞熒光素酶活性;c.miR-519c-3p過(guò)表達(dá)及被抑制后不同組細(xì)胞BMPR2的mRNA水平;d.miR-519c-3p過(guò)表達(dá)及被抑制后不同組細(xì)胞BMPR2的蛋白水平;e.LncRNA HOTAIR過(guò)表達(dá)及被抑制后不同組細(xì)胞BMPR2的mRNA水平;f.LncRNA HOTAIR過(guò)表達(dá)及被抑制后不同組細(xì)胞BMPR2的蛋白水平)

2.4 LncRNA HOTAIR通過(guò)miR-519c-3p/BMPR2調(diào)控人軟骨細(xì)胞OA的進(jìn)展 與NC組比較,si-HOTAIR組BMPR2表達(dá)水平降低,而si-HOTAIR+miR-519c-3p sponge組BMPR2的RNA水平升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,圖4a)。WB結(jié)果趨勢(shì)相同(圖4b)。

圖4 LncRNA HOTAIR通過(guò)miR-519c-3p/BMPR2調(diào)控人軟骨細(xì)胞OA的進(jìn)展(a.不同組細(xì)胞BMPR2的mRNA水平比較;b.不同組細(xì)胞BMPR2的蛋白水平比較;c.不同組細(xì)胞活力比較;d.不同組細(xì)胞降解酶及促炎因子的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量比較;e.不同組細(xì)胞軟骨標(biāo)志基因mRNA相對(duì)表達(dá)量比較;f.不同組細(xì)胞上清中IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)水平比較)

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與NC組比較,si-HOTAIR組增殖變慢,si-HOTAIR+miR-519c-3p sponge組細(xì)胞增殖變快(P<0.05)。與 NC組比較,miR-519c-3p組細(xì)胞增殖變慢,miR-519c-3p+BMPR2組細(xì)胞增殖變快(P<0.05)。見(jiàn)圖4c。

qRT-PCR結(jié)果顯示,與NC組比較,si-HOTAIR組中降解酶(MMP3、MMP9、MMP13、ADAMTS4和ADAMTS5)及促炎因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著降低,而軟骨細(xì)胞標(biāo)志基因COL2A1、SOX9和Aggrecan的mRNA相對(duì)表達(dá)量上調(diào)(P<0.05);與si- HOTAIR組比較,si-HOTAIR+miR-519c-3p sponge組細(xì)胞的降解酶和促炎因子的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量升高,軟骨標(biāo)志基因mRNA相對(duì)表達(dá)量卻下調(diào)(P<0.05)。同樣,qRT-PCR結(jié)果顯示,與NC組比較,miR-519c-3p組降解酶和促炎因子基因mRNA相對(duì)表達(dá)量降低,軟骨標(biāo)志基因mRNA相對(duì)表達(dá)量增加(P<0.05);但與miR-519c-3p組比較,miR-519c-3p+BMPR2組細(xì)胞的降解酶和促炎因子的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量升高,軟骨標(biāo)志基因mRNA相對(duì)表達(dá)量下調(diào)(P<0.05)。見(jiàn)圖4d、e。

ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α在不同組別中的表達(dá)水平表現(xiàn)出與各促炎因子基因mRNA相對(duì)表達(dá)量相同的趨勢(shì)(圖4f)。這些結(jié)果提示,LncRNA HOTAIR通過(guò)miR-519c-3p/BMPR2調(diào)控人軟骨細(xì)胞OA的進(jìn)展。

3 討論

LncRNA HOTAIR在癌癥生物學(xué)中具有重要的致癌作用[9]。近年來(lái),有研究報(bào)道,LncRNA HOTAIR在OA病理中具有多種功能[9-10]。本研究闡明了LncRNA HOTIAR/miR-519c-3p/BMPR2軸在調(diào)節(jié)OA進(jìn)展中的作用。

本研究利用生物信息學(xué)網(wǎng)站ENCORI分析LncRNA HOTAIR潛在的下游分子miR-519c-3p,雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)和RIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)了miR-519c-3p可與LncRNA HOTAIR相結(jié)合,qRT-PCR和WB結(jié)果發(fā)現(xiàn)LncRNA HOTAIR和miR-519c-3p的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。這提示LncRNA HOTAIR可以靶向調(diào)控下游miR-519c-3p的表達(dá)。

有研究報(bào)道,miR-519c-3p可通過(guò)靶向BTG3促進(jìn)肝癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[11]。此外,抑制LncRNA NEAT1通過(guò)調(diào)節(jié)miR-519c-3p/MeCP2軸促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞對(duì)順鉑的敏化[12]。但miR-519c-3p在OA中的作用少見(jiàn)報(bào)道。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),miR-519c-3p過(guò)表達(dá)后,軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)變慢,降解酶(MMP3、MMP9、MMP13、ADAMTS4和ADAMTS5)及促炎因子(IL-1β、IL-6和TNF-α)水平降低,而COL2A1和SOX9水平升高,這提示miR-519c-3p可以抑制OA進(jìn)展。鑒于過(guò)往LncRNA HOTAIR可促進(jìn)OA進(jìn)展的研究[10],這提示miR-519c-3p和LncRNA HOTAIR在OA的進(jìn)展上具有拮抗作用,這也與LncRNA HOTAIR負(fù)向調(diào)控miR-519c-3p表達(dá)的結(jié)論相符。

miRNA家族構(gòu)成了精密的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[13]。本研究利用生物信息學(xué)和雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)預(yù)測(cè)并證實(shí)miR-519c-3p、BMPR2相互結(jié)合。上調(diào)miR-519c-3p表達(dá)后BMPR2表達(dá)降低;反之miR-519c-3p被抑制后BMPR2的表達(dá)增高。這提示,miR-519c-3p不僅可以與BMPR2結(jié)合,并可調(diào)控其表達(dá)水平。此外,本研究結(jié)果顯示,LncRNA HOTAIR表達(dá)被抑制后,BMPR2表達(dá)下調(diào);LncRNA HOTAIR過(guò)表達(dá)后,BMPR2表達(dá)隨之增高?；贚ncRNA HOTAIR對(duì)miR-519c-3p的負(fù)調(diào)控作用,這提示LncRNA HOTAIR通過(guò)下調(diào)miR-519c-3p水平削弱了miR-519c-3p對(duì)BMPR2的抑制。綜上,miR-519c-3p可以負(fù)向調(diào)控BMPR2的表達(dá)。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),LncRNA HOTAIR干擾的軟骨細(xì)胞中感染miR-519c-3p sponge,可以逆轉(zhuǎn)干擾LncRNA HOTAIR對(duì)BMPR2的下調(diào),這提示BMPR2的表達(dá)被LncRNA HOTAIR顯著激活,而被miR-519c-3p抑制。BMPR2對(duì)于軟骨的形成以及關(guān)節(jié)修復(fù)具有重要的影響[14]。本研究通過(guò)回補(bǔ)實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-519c-3p通過(guò)靶向BMPR2軸調(diào)控軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)、降解酶及促炎因子的分泌,這提示,LncRNA HOTAIR不僅調(diào)控下游miR-519c-3p/BMPR2的表達(dá),更通過(guò)miR-519c-3p/BMPR2途徑調(diào)控OA的進(jìn)展。

綜上所述,LncRNA HOTAIR可通過(guò)miR-519c-3p/BMPR2軸調(diào)控OA的進(jìn)展。本研究為闡明OA進(jìn)展的分子機(jī)制、篩選OA特異性生物標(biāo)志物提供重要依據(jù)。