莫勇芳,王 豪,劉文波,何啟杰,隋夢琪,陳 櫻,2,3,歐陽康,2,3,黃偉堅,2,3,韋祖樟,2,3*

(1.廣西大學動物科學技術(shù)學院,動物傳染病與分子免疫學實驗室,廣西南寧 530005;2.廣西壯族自 治區(qū)獸用生物制品工程研究中心,廣西南寧 530005;3.廣西高校動物疫病預防與控制重點實驗室,廣西南寧 530005)

A型塞內(nèi)卡病毒(Senecavirus A,SVA)又稱塞內(nèi)卡山谷病毒(Seneca vally virus,SVV),是塞內(nèi)卡病毒屬的唯一成員[1-6]。該病毒2002年首次被分離,命名為SVV-001[1,6-7]。SVV-001對豬無致病性,人工感染SVV-001的豬無臨床癥狀[5,8]。2007年SVA逐漸在加拿大、美國、巴西等國家出現(xiàn)并蔓延,感染豬以水皰損傷為臨床癥狀[9-10]。2015年我國廣東省最先檢測到該病毒并對其報道,而后在湖北、福建、河南等省份也逐漸出現(xiàn)了塞內(nèi)卡病毒感染的病例[1,9-11]。豬感染SVA后的臨床癥狀為:鼻部及口腔黏膜、蹄部冠狀帶出現(xiàn)水皰,同時可以觀察到發(fā)病豬跛行、站立困難,嚴重者還會出現(xiàn)蹄殼脫落。SVA感染在新生仔豬和母豬中發(fā)病率較高,7日齡以內(nèi)的新生仔豬死亡率高達30%～70%[1,6-7],嚴重影響了養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。SVA作為一種新出現(xiàn)的傳染病病原對養(yǎng)豬業(yè)存在重大威脅。

SVA基因組為單股、線性、正義RNA,長度約為7.2 kb。SVA基因組僅含有一個開放閱讀框(ORF),編碼一個大型多聚蛋白,被切割為典型的小RNA病毒L-4-3-4布局,可裂解為12個成熟的病毒蛋白,即前導蛋白L,結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2、VP3、VP4,非結(jié)構(gòu)蛋白2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D[1-2,5,7,11]。SVV-001的非結(jié)構(gòu)蛋白中,2C、3C、3D的多肽區(qū)域較為保守。3D蛋白是RNA依賴的RNA聚合酶的主要成分,在病毒復制和VPg尿苷?；衅鹬匾饔肹1-3,7]。本研究擬通過構(gòu)建表達截短3D蛋白的原核表達載體,表達純化截短3D蛋白后免疫新西蘭大白兔制備大量多克隆抗體,對獲得的抗體鑒定成功后為后續(xù)對3D蛋白的功能研究以及SVA病毒致病機制的深入研究儲備材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、細胞、質(zhì)粒和實驗動物 本研究所用SVA毒株為SVA/GX/CH/2018(GenBank登錄號:MK039162.1)[10]、原核表達載體pET-32a(+)和BHK-21細胞由廣西大學動物科學技術(shù)學院動物傳染病與分子免疫學實驗室分離保存。4 kg左右的新西蘭大白兔購自廣西大學實驗動物中心。

1.1.2 主要試劑 引物合成于北京擎科生物科技有限公司;PrimeStar Max DNA Polymerase、T4 DNA Ligase、BCA蛋白定量試劑盒,寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品;Gel Extraction Kit、Cycle Pure Kit,美國OMEGA公司產(chǎn)品;AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量制備試劑盒,愛思進生物技術(shù)(杭州)有限公司產(chǎn)品;內(nèi)切酶EcoRⅤ、EcoRⅠ,紐英倫生物技術(shù)(北京)有限公司產(chǎn)品;Trans5α Chemically Competent Cell、BL21(DE3)Chemically Competent Cell、FITC標記的山羊抗兔IgG(H+L),北京全式金生物公司產(chǎn)品;異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG),北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品;Ni瓊脂糖凝膠,北京康為世紀生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;5×蛋白上樣緩沖液、HRP-山羊抗兔IgG,上海碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;預染蛋白質(zhì)分子量標準,南京翼飛雪生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器設備 移液槍和離心機,Eppendorf公司產(chǎn)品;PCR儀、細菌恒溫培養(yǎng)箱、細胞恒溫培養(yǎng)箱及熒光倒置顯微鏡,Thermo公司產(chǎn)品;無菌操作臺,蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司產(chǎn)品;瓊脂糖凝膠電泳儀,北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品;凝膠成像儀和垂直電泳儀,Bio-Rad公司產(chǎn)品;Western blot化學發(fā)光成像儀,Cytiva公司產(chǎn)品;恒溫水浴鍋,邦西儀器科技有限公司產(chǎn)品;倒置顯微鏡,Nikon公司產(chǎn)品;超聲波破碎儀,寧波新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設計與擴增 用Protean軟件分析SVA 3D基因的全序列。由于3D蛋白的100 aa-300 aa具有豐富的抗原表位,因此將其編碼該段的基因作為目的片段進行擴增,大小共計600 bp。分別設計上游引物:5′-acgGATATCatccctggactagacccta-3′,下劃線處為引入的酶切位點EcoRⅤ;下游引物:5′-cgtGAATTCggtcgcggcacaaccagag-3′,下劃線處為引入的酶切位點EcoRⅠ。使用抽提試劑盒提取SVA/GX/CH/2018毒株的RNA,以SVA/GX/CH/2018毒株RNA為模板進行反轉(zhuǎn)錄,RT反應程序為:42℃ 1 h;以獲得的cDNA為模板擴增3D截短基因,PCR反應程序為:95℃ 3 min;98℃ 10 s,56℃ 5 s,72℃ 10 s,共計32個循環(huán);72℃ 10 min,擴增目的片段。

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 將pET-32a載體與擴增的截短3D基因膠回收產(chǎn)物分別與限制性內(nèi)切酶EcoRⅤ和EcoRⅠ于37℃孵育5 h后回收酶切產(chǎn)物。將回收產(chǎn)物按照載體∶目的片段=1∶7的比例用T4連接酶16℃過夜連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Trans5α感受態(tài)細胞,轉(zhuǎn)化產(chǎn)物涂布于含氨芐青霉素鈉的LA平板過夜培養(yǎng)。挑取單個菌落,37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)16 h,抽提質(zhì)粒,經(jīng)EcoRⅤ和EcoRⅠ雙酶切鑒定,質(zhì)粒送上海生工生物工程公司測序。

1.2.3 目的蛋白的原核表達 選取測序正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細胞,涂板、培養(yǎng)后挑取單個菌落進行少量表達鑒定。經(jīng)37℃、200 r/min恒溫培養(yǎng)箱震蕩培養(yǎng)至菌液OD600nm=0.4～0.6時加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG溶液,再將菌液轉(zhuǎn)移至16℃、200 r/min低溫搖床振蕩培養(yǎng)過夜。取部分誘導后菌液,離心獲得菌體,PBS重懸后超聲破碎菌體,4℃離心獲得上清和沉淀。將誘導菌體、上清、沉淀與5×SDS Loading buffer混合,處理變性后經(jīng)SDS-PAGE和考馬斯亮藍染色觀察目的蛋白表達情況。

1.2.4 重組SVA 3D蛋白的純化與鑒定 菌液經(jīng)大量擴繁誘導后,離心、超聲、沉淀溶解后4℃離心10 min,按照Ni-NTA說明書的方法對重組蛋白進行純化。純化后的蛋白使用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。將純化的蛋白樣品煮沸變性后上樣進行SDS-PAGE及考馬斯亮藍染色。

1.2.5 SVA 3D蛋白多克隆抗體的制備 首免前先在免耳緣靜脈采集分離血清作為后續(xù)試驗的陰性對照血清。首免時將純化的3D蛋白與弗氏完全佐劑按照1∶1比例充分乳化,按照1 mg/只的劑量于兔頸部、背部、臀部的皮下多點注射免疫。二免與三免時將純化蛋白與弗氏不完全佐劑按照1∶1比例充分乳化免疫,免疫劑量為500 μg/只。三免4 d后可采集耳緣靜脈血測定抗體效價決定是否需要四免,本研究三免1周后心臟采血,分離血清,分裝保存。

1.2.6 間接ELISA測定SVA 3D蛋白多克隆抗體的效價 所有血清樣本設置3個重復。200 ng/孔的蛋白在4℃條件下包被過夜。孵育后棄液,TBST振蕩洗滌3次,每次5 min。然后加入含50 g/L脫脂乳的封閉液,37℃恒溫箱內(nèi)封閉2 h。洗板3次,以TBST稀釋的待檢陽性血清與未免疫兔的陰性血清為一抗,一抗稀釋梯度按1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000、1∶32 000、1∶64 000、1∶128 000、1∶256 000、1∶512 000進行,每孔加入100 μL稀釋的血清,37℃孵育 1 h。洗板3次,加入100 μL稀釋比例為1∶10 000的HRP標記羊抗兔IgG,37℃孵育1 h。洗板3次,使用TMB顯色液顯色,常溫下避光放置10 min,再加入終止液。5 min內(nèi)使用酶標儀測定每個孔在OD450nm的吸光度。

1.2.7 SVA 3D蛋白多克隆抗體間接免疫熒光分析 BHK-21細胞消化后鋪12孔板,待細胞長成單層后按照MOI=0.1的劑量接種SVA/GX/CH/2018毒株,準備進行間接免疫熒光測驗(indirect immunofluorescence assay,IFA)。18 h后用冰甲醇固定細胞。同時設置未接毒的BHK-21細胞作為陰性對照。固定后用PBS洗3次,加入含50 g/L脫脂乳的封閉液,37℃封閉1 h。洗板3次,加入一抗,一抗為稀釋的SVA 3D蛋白多克隆抗體血清,37℃靜置2 h。為了確定3D蛋白多克隆抗體的最佳使用濃度,一抗設置4個稀釋梯度,即1∶50、1∶100、1∶200、1∶400。PBST洗板5次,加入1∶500稀釋的FITC標記山羊抗兔IgG,37℃避光作用45 min,洗板5次,DAPI染色,室溫下靜置10 min,洗板2次后于倒置熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

1.2.8 SVA 3D蛋白多克隆抗體Western blot分析 BHK-21細胞消化后鋪6孔板,待細胞長成單層后按照MOI=0.1的劑量接種SVA/GX/CH/2018毒株,24 h后收集細胞。同時收集未接毒的BHK-21細胞作為陰性對照。細胞樣品變性后上樣進行SDS-PAGE,電泳完成后將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜,使用含50 g/L脫脂乳的封閉液于37℃封閉2 h,PBST洗3次,每次5 min;按照1∶500的比例用PBST稀釋3D蛋白多克隆抗體作為一抗,4℃孵育過夜。洗膜5次,加入1∶2 000稀釋的HRP標記的山羊抗兔IgG,37℃孵育45 min,洗膜5次。用ECL超敏化學發(fā)光試劑盒顯色后于Western blot化學發(fā)光成像儀曝光成像。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

以SVA/GX/CH/2018 cDNA為模板,通過PCR擴增截短3D基因片段(圖1A),將擴增片段克隆至載體pET-32a(+)中,獲得攜帶3D基因片段的重組原核表達質(zhì)粒pET-32a-3D。使用EcoRⅤ和EcoRⅠ對重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定,如圖1B所示,除了載體片段外,還切出大小為600 bp的目的條帶,與預期大小一致;測序后結(jié)果顯示插入的片段為擴增的3D基因片段。

A.M1.DNA標準DL 2 000; 1.SVA 3D基因; B.M2.DNA標準DL 10 000; 1.重組質(zhì)粒pET-32a-3D的EcoRⅤ和EcoRⅠ雙酶切

2.2 SVA 3D截短蛋白的誘導表達

誘導目的蛋白表達后,進行SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)目的蛋白均在沉淀中表達,大小約39.5 ku,上清未見符合預期大小的蛋白條帶。大量誘導目的蛋白表達后進行純化,經(jīng)SDS-PAGE分析獲得了與預期相符大小的單一條帶(圖2)。對純化蛋白用BCA蛋白定量試劑盒檢測,濃度為1.5 mg/mL。

M.蛋白分子質(zhì)量標準; 1.未誘導pET-32a(+); 2.未誘導pET-32a-3D; 3.IPTG誘導pET-32a; 4.IPTG誘導pET-32a-3D; 5.誘導的pET-32a-3D上清; 6.誘導的pET-32a-3D沉淀;7.純化3D重組蛋白

2.3 SVA 3D蛋白多克隆抗體效價測定

采用間接ELISA方法,以純化的3D蛋白作為包被抗原,三免后1周采集兔血清作為一抗對制備的多克隆抗體進行效價測定。以陽性與陰性血清的OD450nm之比(P/N)大于或等于2.1時的血清最高稀釋倍數(shù)作為抗體效價,結(jié)果如圖3所示,制備的多克隆抗體在1∶256 000時P/N仍然大于2.1(圖3),說明制備的3D蛋白多克隆抗體效價超過1∶256 000。

圖3 SVA 3D蛋白多克隆抗體效價測定

2.4 SVA 3D蛋白多克隆抗體IFA分析

SVA/GX/CH/2018接種于BHK-21細胞,18 h后固定,3D蛋白多克隆抗體分別按照1∶50、1∶100、1∶200、1∶400的比例稀釋后作為一抗進行IFA試驗。在熒光顯微鏡下觀察試驗結(jié)果(圖4),可觀察到在1∶50至1∶400的條件下,感染SVA的細胞中均呈現(xiàn)明顯的綠色熒光,而未接種SVA/GX/CH/2018的BHK-21細胞中未觀察到熒光,結(jié)果表明制備的3D蛋白多克隆抗體能夠識別SVA的3D蛋白。

A1～A3.感染SVA的BHK-21細胞(1∶50);B1～B3.感染SVA的BHK-21細胞(1∶100);C1～C3.感染SVA的BHK-21細胞(1∶200);D1～D3.感染SVA的BHK-21細胞(1∶400); E1～E3.未感染SVA的BHK-21細胞

2.5 SVA 3D蛋白多克隆抗體的Western blot分析

SVA/GX/CH/2018以MOI=0.1接種BHK-21細胞,24 h后收集細胞,同時設置未接種SVA/GX/CH/2018的BHK-21細胞作為陰性對照。對細胞裂解液處理后進行Western blot分析,在51 ku左右出現(xiàn)與預計3D蛋白大小相符合的印跡條帶(圖5),表明制備的多克隆抗體能夠與SVA 3D蛋白結(jié)合。

M.蛋白分子質(zhì)量標準;1.感染SVA的BHK-21細胞;2.未感染SVA的BHK-21細胞

3 討論

SVA感染己經(jīng)在美國、加拿大、巴西、中國、泰國和越南等國家豬場暴發(fā),并造成較嚴重的經(jīng)濟損失[2,5,10,12]。SVA作為引發(fā)豬水皰性疾病的主要病原之一,各年齡段的豬均可感染[1,7,13]。通過序列比較和遺傳進化分析表明,當前流行的對豬具有致病性的SVA毒株與原型毒株SVV-001遺傳距離較遠,表明SVA的毒力明顯增強且還在不斷進化[1,13-14]。目前針對SVA的商品化疫苗及檢測試劑還不成熟[11],因此還需要繼續(xù)深入SVA的相關研究。本研究通過表達SVA 3D截短蛋白并制備了相應的多克隆抗體,為后續(xù)開展3D蛋白功能的研究以及SVA致病機制研究提供材料儲備。

本研究中3D截短蛋白以包涵體形式表達,純化后的重組蛋白濃度為1.5 mg/mL,達到了免疫試驗動物的要求。用間接ELISA方法對制備的抗血清進行抗體測定,其效價超過了1∶256 000,后續(xù)對抗體進行IFA和Western blot鑒定,IFA檢測后在熒光顯微鏡下,SVA感染的BHK-21細胞中能夠觀察到明顯的熒光,表明制備的抗體能夠與SVA 3D蛋白發(fā)生特異性結(jié)合;從SVA感染的BHK-21細胞樣品中采用Western blot方法能檢測到與預期大小相符條帶,雖然存在部分雜帶,可能是多克隆抗體與其他蛋白非特異性結(jié)合所致?？傮w來說,本研究成功制備了SVA 3D蛋白的多克隆抗體,且該抗體具備良好的反應性。