張 興,高英魁,郝中華,劉靜靜,張華強(qiáng),歸 榮,張珂菲,周廣薇,鄧立新,王學(xué)兵,2*,童 超,2*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,河南鄭州 450002;2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物免疫學(xué)國(guó)際聯(lián)合研究中心,河南鄭州 450046)

奶牛乳腺炎給奶牛養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1],造成產(chǎn)奶量降低、奶牛淘汰和治療費(fèi)用等。發(fā)病因素主要以細(xì)菌性感染為主,分為傳染性和環(huán)境性乳腺炎。前者主要由大腸埃希氏菌(E.coli)、鏈球菌(S.aureus)、無(wú)乳鏈球菌(S.agalactiae)和支原體(Mycoplasma)感染等。在擠奶過(guò)程中,通過(guò)手、毛巾或者被細(xì)菌污染的擠奶器將將病菌傳染給了健康母牛。環(huán)境性乳腺炎發(fā)病原因主要是奶牛周?chē)h(huán)境的污染,如墊料、土壤、排泄物、污水等[2]。該病發(fā)病率高流行廣泛,對(duì)全球奶牛生產(chǎn)都產(chǎn)生了嚴(yán)重的影響[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì),奶牛乳腺炎的發(fā)病率高達(dá)50%,且在全球每年造成的損失高達(dá)約350億美元[3]。預(yù)防和治療奶牛乳房炎是國(guó)內(nèi)外亟待解決的問(wèn)題。

脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)是一種位于革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁上的糖脂質(zhì),包括核心多糖、類(lèi)脂A和O-抗原[4],是革蘭氏陰性菌的主要致病性物質(zhì)。類(lèi)脂A是 LPS的關(guān)鍵毒性部位,它能誘導(dǎo)細(xì)胞對(duì) LPS產(chǎn)生應(yīng)答,進(jìn)而導(dǎo)致炎癥和細(xì)胞凋亡。細(xì)胞外LPS的刺激可以被細(xì)胞膜上的TLR4/MD-2受體復(fù)合物識(shí)別,使髓樣分化因子 88與TLR4結(jié)合,導(dǎo)致NF-κB活化后進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)誘導(dǎo)特定基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),從而引起炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡信號(hào)的活化[5-7]。LPS的刺激可以激活促凋亡因子BAK、BAX過(guò)表達(dá),導(dǎo)致細(xì)胞色素C和其他蛋白進(jìn)入細(xì)胞質(zhì),活化caspase-3、caspase-9引起細(xì)胞凋亡[8-9]。也有其他研究表明,LPS可通過(guò)TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白信號(hào)途徑誘導(dǎo)上皮細(xì)胞凋亡,TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白的連接蛋白IRAK-1能與Fas死亡結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白結(jié)合,激活 caspase凋亡相關(guān)蛋白酶,從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10-12],但是LPS誘導(dǎo)上皮細(xì)胞凋亡的確切機(jī)理尚待深入探討。

細(xì)胞自噬在演化過(guò)程中表現(xiàn)出高度的保守性,其發(fā)生和發(fā)展受許多與自噬相關(guān)的基因控制[13]。哺乳動(dòng)物的自噬誘導(dǎo)機(jī)制主要是由Atg12的結(jié)合和LC3的修飾作用引起的[14]。Atg12的結(jié)合作用是一個(gè)類(lèi)似泛素化的過(guò)程,需要泛素活化酶E1、E2的參與。Atg12先被Atg7 (E1樣酶)激活,然后用Atg10(E2樣酶)將其轉(zhuǎn)移到Atg5,最終與Atg16結(jié)合形成多聚體復(fù)合體,并參與自噬擴(kuò)展[15-16]。LC3 前體形成后,被Atg4 加工成胞漿可溶性的 LC3-Ⅰ,在Atg7和Atg3的作用下形成LC3-Ⅱ參與自噬體膜的延伸直到自噬溶酶體的形成,因此LC3-Ⅱ被作為自噬形成的標(biāo)志物,也是目前唯一發(fā)現(xiàn)定位于自噬泡膜上多種信號(hào)傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)蛋白[17-18]。本試驗(yàn)以不同濃度的LPS處理MAC-T細(xì)胞誘導(dǎo)自噬和凋亡,檢測(cè)LPS對(duì)MAC-T細(xì)胞自噬和凋亡的影響,為大腸埃希氏菌誘導(dǎo)牛乳腺炎發(fā)生機(jī)制的研究提供參考,為臨床應(yīng)用奠定試驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 牛乳腺上皮細(xì)胞(MAC-T)來(lái)自河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生理生化實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要試劑 連翹酯苷A(純度>98%),成都普飛德生物科技有限公司產(chǎn)品;脂多糖(LPS),美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品;Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒,南京諾唯贊公司產(chǎn)品;2×RealStar Fast染料法qPCR預(yù)混液,北京康潤(rùn)公司產(chǎn)品;qPCR引物,上亞生物科技有限公司產(chǎn)品。試驗(yàn)所用抗體LC3α/β、P62、BAX、BCL-2、ATG5、ATG7、Beclin-1、caspase-3,萬(wàn)類(lèi)生物科技公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 CO2培養(yǎng)箱,美國(guó)Thermo公司產(chǎn)品;冷凍離心機(jī),Eppendorf公司產(chǎn)品;超凈工作臺(tái),蘇州金燕凈化設(shè)備廠(chǎng)產(chǎn)品; 酶標(biāo)儀,Tecan公司產(chǎn)品;倒置相差顯微鏡,Leica公司產(chǎn)品; 蛋白電泳儀,Bio-Rad公司產(chǎn)品;qPCR設(shè)備,德國(guó)Analytik-Jena公司產(chǎn)品;顯影儀,上海Tanon公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和分組 試驗(yàn)前從液氮罐中取出凍存的MAC-T牛乳腺上皮細(xì)胞,復(fù)蘇后在含100 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液、37℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2～3 d傳代1次,取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MAC-T細(xì)胞用于自噬和凋亡模型的建立,用 LPS(0、50、100、200 μg/mL)不同濃度處理MAC-T細(xì)胞12 h,查看自噬和凋亡基因和蛋白的表達(dá)。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 按細(xì)胞計(jì)數(shù)板法計(jì)數(shù),以1×104細(xì)胞/cm2的密度將MAC-T細(xì)胞接種于96孔板。根據(jù)使用說(shuō)明,采用CCK-8試劑盒對(duì)細(xì)胞活性進(jìn)行測(cè)定。將 LPS加入到細(xì)胞中12 h和24 h后,加入10 μL CCK-8溶液在37℃的遮光環(huán)境中培養(yǎng)1 h～4 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)的吸光度,檢測(cè)細(xì)胞的活性。

1.2.3 LDH法檢測(cè)細(xì)胞上清液中乳酸脫氫酶含量 以1×104細(xì)胞/cm2的密度將MAC-T細(xì)胞接種于96孔板,收集細(xì)胞培養(yǎng)液并以1 100 r/min離心5 min,取20 μL培養(yǎng)液上清于全新的96孔板中。向各孔中加入25 μL基質(zhì)緩沖液和5 μL輔酶溶液,輕微震蕩混勻后,放入37℃恒溫水浴鍋溫浴15 min。加入25 μL 2,4-二硝基苯肼混勻后繼續(xù)37℃水浴15 min。加入250 μL 0.4 mol/L的NaOH溶液混勻,室溫靜置5 min。使用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的吸光度,每個(gè)處理組6個(gè)重復(fù),取平均值記錄。按照說(shuō)明書(shū)要求將2 μmol/mL的丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)品用雙蒸水分別稀釋200倍、100倍、50倍、20倍、10倍、5倍、2倍,按照上述操作測(cè)得吸光度后繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。計(jì)算各處理組LDH的含量。

1.2.4 RT-qPCR(熒光定量PCR) 用移液槍吸棄4組樣本的細(xì)胞培養(yǎng)上清,用PBS洗細(xì)胞2次,加入1 mL Trizol溶液,吹打混勻,靜止10～15 min使細(xì)胞充分裂解。裂解后的細(xì)胞移到1.5 mL的EP管中,12 000 r/min、4℃離心5 min,移液槍吸取上清液至新的1.5 mL的EP管中,管中加0.2 mL氯仿,混勻,靜置,12 000 r/min、4℃離心15 min,加1 mL異丙醇,混勻,靜置,12 000 r/min、4℃離心10 min,接下來(lái)?xiàng)壣锨?加入1 mL的DEPC水配制的750 mL/L的乙醇,7 500 r/min、4℃離心5 min,用移液槍小心的把上層乙醇吸出只留下沉淀,將EP管倒扣在吸水紙上使乙醇揮發(fā),加20 μL的DEPC水將沉淀溶解,測(cè)定各樣品RNA濃度,4組樣品濃度稀釋至1 000 ng/μL,根據(jù)反轉(zhuǎn)錄體系合成cDNA。采用兩步法進(jìn)行RT-qPCR擴(kuò)增。20 μL體系,上、下游引物各0.5 μL,cDNA 1 μL,2×RealStar Fast染料法qPCR預(yù)混液10 μL,無(wú)菌無(wú)酶水8 μL,以上所有步驟均在冰上進(jìn)行,引物序列信息見(jiàn)表1。

表1 引物序列信息

1.2.5 蛋白質(zhì)免疫印跡分析 使用RIPA裂解液提取細(xì)胞的總蛋白,用BSA試劑盒測(cè)定總蛋白濃度,在SDS凝膠電泳每孔上樣30 μg進(jìn)行電泳后,將蛋白轉(zhuǎn)印到PVDF膜上,在37℃下用50 g/L的脫脂奶粉進(jìn)行封閉,一抗孵育4℃過(guò)夜,用二抗孵育1 h,然后用ECL顯色液檢測(cè)膜上的信號(hào),并通過(guò)Tanon 5200收集數(shù)據(jù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,各組試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。組間比較采用單因素方差分析,差異顯著性以P<0.05表示。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞活性的測(cè)定

在12 h處理組中,50 μg/mL～100 μg/mL LPS處理細(xì)胞活力無(wú)明顯變化,在150、200、250 μg/mL處理下細(xì)胞活力顯著下降。在LPS 24 h處理組中,50、100、150、200、250 μg/mL LPS處理下MAC-T細(xì)胞活力顯著下降(圖1)。表明MAC-T細(xì)胞的活力會(huì)隨著LPS濃度和處理時(shí)間增加而下降。

與對(duì)照組相比,*P<0.05,**P<0.01

2.2 LPS對(duì)MAC-T細(xì)胞上清LDH的含量影響

與對(duì)照組相比,用50、100、150、200、250 μg/mL LPS處理的細(xì)胞,細(xì)胞上清中的LDH顯著升高,呈現(xiàn)出梯度依賴(lài)性,表明隨著LPS濃度的增加,對(duì)細(xì)胞的損傷程度加重(圖2)。

與對(duì)照組相比,*P<0.05,**P<0.01

2.3 LPS對(duì)MAC-T細(xì)胞核形態(tài)的影響

Hoechst33342染色觀察不同濃度的LPS(0、50、100、200 μg/mL)處理12 h對(duì)MAC-T細(xì)胞核的影響(圖3)。對(duì)照組細(xì)胞核呈卵圓形,染色質(zhì)均勻分布,LPS處理后,細(xì)胞核形態(tài)出現(xiàn)異型性,染色質(zhì)碎裂、固縮(圖3白色箭頭)。隨著LPS濃度增加,形態(tài)異常細(xì)胞核數(shù)目逐漸增多。

白色箭頭指示發(fā)生形態(tài)變化的細(xì)胞核White arrows indicate morphologically altered nuclei

2.4 LPS處理MAC-T細(xì)胞自噬和凋亡相關(guān)基因的表達(dá)

與對(duì)照組相比,不同濃度LPS(50～100 μg/mL)處理后,自噬相關(guān)基因LC3B、P62、ATG5、ATG7、Beclin-1的mRNA表達(dá)量極顯著上升(P<0.01),與LPS 100 μg/mL濃度對(duì)比,在200 μg/mL濃度LPS處理組,LC3B、P62、ATG5、ATG7、Beclin-1的mRNA表達(dá)量極顯著下降(P<0.01)(圖4A～圖4E)。凋亡相關(guān)基因在不同濃度LPS(50、100、200 μg/mL)處理后,BAX和caspase-3表達(dá)極顯著升高(P<0.01),BCL-2表達(dá)呈現(xiàn)出極顯著下降(P<0.01)(圖4F～圖4H)。

A.LC3B mRNA; B.p62 mRNA; C.ATG5 mRNA; D.ATG7 mRNA; E.Beclin-1 mRNA; F.BAX mRNA; G caspase-3 mRNA; H.BCL-2 mRNA;與對(duì)照組相比,*P<0.05,**P<0.01,##P<0.01

2.5 LPS處理MAC-T細(xì)胞自噬和凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)

與對(duì)照組相比,LPS(50、100 μg/mL)處理下自噬相關(guān)蛋白LC3B、P62、ATG5、ATG7和Beclin-1的表達(dá)極顯著上升(P<0.01),與LPS 100 μg/mL濃度對(duì)比,在200 μg/mL濃度LPS處理組,自噬相關(guān)蛋白LC3B、ATG5、ATG7和Beclin-1的表達(dá)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)(圖5A～圖5E)。與對(duì)照組相比,凋亡相關(guān)到蛋白在不同濃度LPS(50、100、200 μg/mL)處理后,BAX和caspase-3表達(dá)顯著升高,BCL-2表達(dá)呈現(xiàn)出極顯著下降(圖5F～圖5H)。

A.LC3B protein; B.p62 protein; C.ATG5 protein; D.ATG7 protein; E.Beclin-1 protein; F.BAX protein; G.Caspase-3 protein; H.BCL-2 protein;與對(duì)照組相比,*P<0.05,**P<0.01,##P<0.01

3 討論

乳腺上皮細(xì)胞是乳腺天然免疫屏障的主要組成成分,是研究泌乳機(jī)制、乳腺炎發(fā)病機(jī)制的重要細(xì)胞模型。本研究以MAC-T細(xì)胞為研究對(duì)象,探究不同濃度的LPS對(duì)MAC-T細(xì)胞自噬和凋亡的影響。自噬在真核細(xì)胞中是一種獨(dú)特的現(xiàn)象,是細(xì)胞在饑餓時(shí)通過(guò)循環(huán)利用細(xì)胞質(zhì)的物質(zhì)來(lái)補(bǔ)充自己的能量,自噬分為4種,微自噬、分子伴侶介導(dǎo)的自噬、非典型自噬及巨自噬[19],本文主要適用于巨自噬。自噬對(duì)維持細(xì)胞的結(jié)構(gòu)具有重要意義,ATG5、ATG7和Beclin-1在巨自噬中是必須的基因[20]。體外試驗(yàn)表明,ATG5作為自噬的關(guān)鍵樞紐,被敲除后可以抑制自噬的發(fā)生并且促進(jìn)細(xì)胞凋亡[21],還可以激活NF-κB信號(hào)通路產(chǎn)生一系列炎癥損傷[22]。ATG7敲除會(huì)影響自噬體的形成及線(xiàn)粒體的形變,產(chǎn)生自噬性的損害。本文研究顯示,LPS可以使LC3和p62蛋白水平升高,證明了LPS可以提升MAC-T細(xì)胞自噬的水平,p62的下降代表自噬流順暢[23-24],p62升高代表自噬小體降解受到抑制,可以推測(cè)LPS在引起MAC-T細(xì)胞自噬增加的同時(shí),阻滯細(xì)胞內(nèi)自噬溶酶體的降解。研究發(fā)現(xiàn),在巨噬細(xì)胞中LPS的刺激可以使p62升高,與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致。在內(nèi)皮細(xì)胞中低于1 μg/mL的LPS造成p62表達(dá)上升,高于1 μg/mL的LPS會(huì)使p62表達(dá)下降[25]。這種差異可能與細(xì)胞種類(lèi)和LPS的濃度不同有關(guān)。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序性死亡的一種類(lèi)型,分為內(nèi)源性和外源性?xún)煞N途徑[26],這兩種途徑均可以導(dǎo)致caspase-3的激活,促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放,產(chǎn)生凋亡小體誘導(dǎo)caspase-9的活化并最終產(chǎn)生細(xì)胞凋亡[27]。ATG5在凋亡細(xì)胞中起到了關(guān)鍵的作用,在細(xì)胞凋亡發(fā)生時(shí)ATG5會(huì)被鈣蛋白酶切割導(dǎo)致其N(xiāo)端片段進(jìn)入線(xiàn)粒體和BCL-2家族受體結(jié)合相互作用,導(dǎo)致細(xì)胞色素C的釋放促進(jìn)細(xì)胞凋亡[28],且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的BCL-2可以和Beclin-1的BH3結(jié)構(gòu)域結(jié)合從而抑制自噬的發(fā)生,也可以被caspase-3、6、7、8、9、10進(jìn)行剪切,C末端進(jìn)入線(xiàn)粒體導(dǎo)致細(xì)胞色素C的釋放從而導(dǎo)致促進(jìn)凋亡的發(fā)生[29]。在本研究中200 μg/mL的LPS濃度對(duì)比100 μg/mL濃度處理MAC-T細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平下降,很可能是凋亡的發(fā)生抑制了自噬的進(jìn)程,細(xì)胞自噬不足以挽救細(xì)胞從而過(guò)度到了凋亡階段。

綜上所述,低濃度LPS(50～100 μg/mL)處理增加MAC-T細(xì)胞自噬,高濃度的LPS(200 μg/mL)可抑制此過(guò)程。同時(shí)伴隨著LPS濃度梯度的上升(50～200μg/mL),細(xì)胞凋亡逐漸增加。