周宏超,賈 佩,張 琪,郭抗抗,許信剛

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,陜西楊凌 712100;2.陜西正能農(nóng)牧科技有限責(zé)任公司,陜西高陵 7102011)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一種重要的豬傳染性疾病,該病以母豬繁殖障礙、新生仔豬高死亡率、各年齡段豬呼吸困難為主要特征[1]。2006年我國暴發(fā)的高致病性豬繁殖與呼吸綜合征(HP-PRRS)具有極高的發(fā)病率和病死率[2],對養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失,初步統(tǒng)計,HP-PRRS感染豬的發(fā)病率達(dá)50%以上,病死率可達(dá)30%以上[3]。2021年,NADC30-LIKE PRRSV已成為我國的主流毒株,多種毒株的田間重組使得該病的防控難度加大。

豬圓環(huán)病毒( Porcine circovirus,PCV)屬于圓環(huán)病毒科( Circoviridae)圓環(huán)病毒屬其中一員 ,是單股環(huán)狀DNA 病毒,病毒無囊膜,被認(rèn)為是最小的動物病毒之一[4],在PCV的4個血清型中,PCV2可導(dǎo)致豬群發(fā)病[5],并將PCV2引起的疾病統(tǒng)稱為圓環(huán)病毒相關(guān)疾病[6]。

PRRSV和PCV2均侵害豬的免疫系統(tǒng)并導(dǎo)致免疫抑制,兩者的混合感染導(dǎo)致機(jī)體的抵抗力下降[7],引起多種病毒性疾病和細(xì)菌性疾病的繼發(fā)感染[8],嚴(yán)重影響豬場的經(jīng)濟(jì)效益。本文通過總結(jié)1例規(guī)?；i場PRRSV和PCV2混合感染的診斷、防治,跟蹤病毒血癥及抗體水平的持續(xù)變化,以期為規(guī)?；i場PRRSV和PCV2混合感染的防控提供參考。

1 基本情況

1.1 仔豬種源情況

陜西省某規(guī)?；i場基礎(chǔ)母豬存欄4 800頭,獸醫(yī)部檢測實驗室對4批次3日齡仔豬的斷尾去勢液檢測PRRSV核酸陽性,4批次仔豬大群臨床表現(xiàn)無異常,豬群處于平穩(wěn)狀態(tài)。

1.2 育肥豬群發(fā)病情況

3 000頭4批次仔豬21日齡斷奶直接轉(zhuǎn)入育肥豬場,豬進(jìn)場第3天大群陸續(xù)表現(xiàn)咳嗽、食欲減退、精神沉郁、消瘦蒼白豬數(shù)量增多,死亡率明顯升高。

1.3 診斷及評估檢測

1.3.1 主要試劑 PRRSV抗體檢測試劑盒(DU-763),北京愛德士元亨生物科技有限公司產(chǎn)品;PCV2抗體檢測試劑盒(20220531),北京金諾百泰生物科技有限公司產(chǎn)品;科牧豐磁珠法核酸提取試劑(32A6)購自北京科牧豐生物科技有限公司;PRRSV qPCR檢測試劑盒(211227)購自北京愛德士元亨生物科技有限公司;PCV2 qPCR檢測試劑盒(20220418P),哈爾濱元亨生物藥業(yè)有限公司產(chǎn)品;所有樣品的檢測試劑為同批次試劑盒,試劑均在規(guī)定有效期內(nèi)使用,PRRSV和PCV2抗體試劑盒置于4℃冰箱冷藏保存?zhèn)溆?核酸提取試劑置于常溫保存?zhèn)溆?PRRSV和PCV2擴(kuò)增試劑盒置于-25℃冷凍保存。

1.3.2 主要儀器 -25℃冰箱(YCD-265),澳柯瑪股份有限公司產(chǎn)品;離心機(jī)(D3024),大龍醫(yī)療設(shè)備有限公司產(chǎn)品;離心管架、加樣槽;電熱恒溫箱(DHP-2),上海一恒科技有限公司產(chǎn)品;移液器(F3),賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品;酶標(biāo)儀(multiskan fc),賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品;熒光定量PCR儀(48),北京愛德士元亨生物科技有限公司;核酸提取儀(32孔),北京科牧豐生物制藥有限公司。

1.3.3 方法

1.3.3.1 病原檢測 參照科牧豐磁珠法病毒提取試劑盒說明書進(jìn)行病毒核酸的提取,操作程序為:從試劑盒中取出預(yù)分裝深孔板,顛倒混勻(目的是重懸磁珠),撕去鋁箔封口膜,加300 μL樣本在提取孔,放置于核酸提取儀中,選擇DNA/RNAM同提程序運(yùn)行,運(yùn)行結(jié)束后收集核酸即可。PRRSV擴(kuò)增參照愛德士PRRSV qPCR檢測試劑盒說明書進(jìn)行PRRSV擴(kuò)增,對于試驗不成立的樣本需重新進(jìn)行試驗。PCV2擴(kuò)增參照世紀(jì)元亨 PCV2 qPCR檢測試劑盒說明書進(jìn)行,對于試驗不成立的樣本重新進(jìn)行試驗。

1.3.3.2 抗體檢測 PRRSV抗體:參照愛德士PRRSV抗體檢測試劑盒說明書進(jìn)行,在試驗成立的情況下(陽性對照OD值-陰性對照OD值0.15且陰性對照OD值0.15),計算每個樣本的S/P值,若S/P值<0.4為陰性,若S/P值0.4為陽性。對于試驗不成立的樣本重新進(jìn)行試驗。PCV2抗體:參照金諾PCV2抗體檢測試劑盒說明書進(jìn)行操作,在試驗成立的情況下(陽性對照OD值>0.4且陰性對照OD值<0.3),計算每個樣本的S/P值,若S/P值<0.4為陰性,若S/P值0.4為陽性。對于試驗不成立的樣本需重新進(jìn)行試驗。

1.4 診斷檢測結(jié)果

1.4.1 qPCR結(jié)果 對采集的咳嗽豬口腔液(1～5號樣本)和瘦弱發(fā)白豬扁桃體、淋巴結(jié)、胸腺、肺臟(6～10號樣本)用qPCR方法檢測PRRSV和PCV2。PRRSV qPCR結(jié)果顯示:試驗成立(陽性對照具有標(biāo)準(zhǔn)“S”型擴(kuò)增曲線且Ct值=30.05、陰性對照FAM通道無“S”型擴(kuò)增曲線且無Ct值),2、3、6號樣本檢測結(jié)果為PRRSV陽性(樣本對應(yīng)的FAM通道有標(biāo)準(zhǔn)“S”型擴(kuò)增曲線且Ct值<38),其余樣本為陰性(圖1)。PCV2 qPCR結(jié)果顯示:試驗成立(陽性對照具有標(biāo)準(zhǔn)“S”型擴(kuò)增曲線且Ct值=21.2、陰性對照FAM通道無“S”型擴(kuò)增曲線且無Ct值),6、9號樣本檢測結(jié)果為PCV2陽性(6、9號樣本對應(yīng)的FAM通道有標(biāo)準(zhǔn)“S”型擴(kuò)增曲線且Ct值<30),其余樣本為陰性(圖2)。

1～5.咳嗽豬口腔液;6～10.發(fā)白瘦弱豬解剖扁桃體、淋巴結(jié)、胸腺和肺臟的組織混合樣本

1～5.咳嗽豬口腔液;6～10.發(fā)白瘦弱豬解剖扁桃體、淋巴結(jié)、胸腺和肺臟的組織混合樣本

圖3 PRRSV抗體水平跟蹤檢測結(jié)果

圖4 PCV2抗體水平跟蹤檢測結(jié)果

1.5 診斷結(jié)果

根據(jù)豬群整體情況、發(fā)病豬臨床癥狀、死亡豬剖檢病理變化及實驗室檢測結(jié)果綜合分析,該病例診斷為PRRSV和PCV2混合感染。

2 防控方案及豬健康度跟蹤

2.1 防控方案

該批仔豬在14日齡接種PCV2全病毒滅活疫苗(1頭份/頭)和PRRSV(CH-1R株)弱毒疫苗(1頭份/頭),25日齡確診為PRRSV和PCV2的混合感染。在疾病確診后立即將病弱咳嗽豬隔離飼養(yǎng),對全群進(jìn)行7 d的藥物保健,保健方案為用泰萬菌素(800 g/t)+磺胺間甲氧嘧啶(1 kg/t)+電解多維(2 kg/t),治療結(jié)束后同時免疫PRRSV(CH-1R株)弱毒疫苗(1頭份/頭)和PCV2全病毒滅活疫苗(1頭份/頭)。

2.2 豬健康度跟蹤

2.2.1 病毒血癥檢測

2.2.1.1 PRRSV病毒血癥跟蹤檢測 在啟動豬群防控方案后每間隔2周對豬群的固定豬采集30份血清(直至該批育肥豬出欄),6份樣本合為1份樣本檢測PRRSV,以此評估該批育肥豬PRRSV病毒血癥的持續(xù)時間(表1)。

表1 PRRSV病毒血癥跟蹤檢測結(jié)果

對該批次發(fā)病豬PRRSV病毒血癥的跟蹤檢測發(fā)現(xiàn):1號樣本的病毒血癥期在疫苗免疫后10周消失,2號樣本的病毒血癥期在疫苗免疫后8周消失,3號樣本的病毒血癥期在疫苗免疫后4周消失,4號樣本的病毒血癥期在疫苗免疫后4周消失,5號樣本的病毒血癥期在疫苗免疫后6周消失。

2.2.1.2 PCV2病毒血癥跟蹤檢測 在啟動豬群防控方案后每間隔2周對豬群的固定豬采集30份血清(直至該批育肥豬出欄),6份樣本合為1份樣本檢測PCV2,以此評估該批育肥豬PCV2病毒血癥的持續(xù)時間(表2)。對該批次發(fā)病豬PCV2病毒血癥的跟蹤檢測發(fā)現(xiàn),1號樣本的病毒血癥期持續(xù)到該批次豬出欄;2號樣本的病毒血癥期在疫苗免疫后8周消失;3號樣本的病毒血癥期在疫苗免疫后4周消失,在12周重復(fù)出現(xiàn)直至豬出欄;4號樣本的病毒血癥期在疫苗免疫后4周消失,在16周重復(fù)出現(xiàn)直至豬出欄;5號樣本的病毒血癥期在疫苗免疫后6周消失。

表2 PCV2病毒血癥跟蹤檢測結(jié)果

2.2.2 抗體水平跟蹤檢測

2.2.2.1 PRRSV抗體水平跟蹤檢測 在啟動豬群防控方案后每間隔2周對豬群的固定豬采集30份血清(直至該批育肥豬出欄),檢測PRRSV抗體,以此總結(jié)該批次育肥豬PRRSV抗體水平變化規(guī)律(圖1)。

對該批次發(fā)病豬PRRSV抗體水平跟蹤檢測發(fā)現(xiàn):雖然各階段PRRSV抗體陽性率均為100%,但是各階段豬群的S/P值有明顯變化。S/P值從疫苗免疫前的0.6上升到免疫后6周齡的1.9,隨后持續(xù)降至免疫后18周齡的1.0。

2.2.2.2 PCV2抗體水平跟蹤檢測 在啟動豬群防控方案后每間隔2周對豬群的固定豬采集30份血清(直至該批育肥豬出欄),檢測PCV2抗體,以此了解該批次育肥豬PCV2抗體水平變化規(guī)律(圖2)。

對該批發(fā)病豬PCV2抗體水平跟蹤檢測發(fā)現(xiàn):雖然各階段的PCV2抗體陽性率均為100%,但是各階段豬群的S/P值有明顯變化。S/P值從疫苗免疫前的1.55下降到免疫后6周齡的0.7,隨后持續(xù)上升至免疫后18周齡的1.6。

4 討論

PRRSV和PCV2做為呼吸道疾病的主要病毒性疾病[9],在豬群中誘發(fā)的混合感染屢見不鮮[10-14],臨床防控除加強(qiáng)生產(chǎn)管理外,疫苗免疫是有效的措施之一。PCV2疫苗主要包括滅活疫苗、弱毒活疫苗及基因工程苗三大類,其中,PCV2弱毒活疫苗存在毒力返強(qiáng)的風(fēng)險[15],Fenaux M等人將PCV2在PK-15細(xì)胞上連續(xù)傳代培養(yǎng),結(jié)果驗證了毒力返強(qiáng)的事實[16],而且PCV2弱毒疫苗免疫引起的疑似PCV的案例已被報道[17],可見PCV2商業(yè)化弱毒活疫苗的選擇需謹(jǐn)慎。疫苗免疫也是防控PRRS的核心手段[18]。用于PRRSV防控的主流疫苗為PRRSV弱毒疫苗和PRRSV滅活疫苗。有學(xué)者研究了PRRSV-2弱毒疫苗對PRRSV-1和PRRSV-2異種單獨(dú)攻毒和聯(lián)合攻毒的保護(hù)力,發(fā)現(xiàn)弱毒疫苗免疫可產(chǎn)生較好的抗體,并能降低PRRSV的病毒血癥[19],PRRSV特異性IFN-γ的高水平分泌能降低病毒攻毒后對肺臟的損傷,說明弱毒疫苗免疫可在一定程度上提高豬的免疫保護(hù)作用。PRRSV滅活疫苗具有安全性好、免疫力差的特點[20],其使用效果也倍受爭議。有學(xué)者稱[21]雖然PRRSV滅活疫苗的保護(hù)效率并不高,但滅活疫苗新型佐劑的研發(fā)(山藥多糖、黃芪多糖等)可提高PRRSV滅活疫苗的保護(hù)率。弱毒疫苗和滅活疫苗的聯(lián)合使用是PRRSV疫苗免疫防控的新趨勢[22-23]。

該豬場此次疫情發(fā)生,產(chǎn)房仔母豬的PRRSV水平傳播是主要原因,轉(zhuǎn)群應(yīng)激是引起疾病波動的次要原因。在本次疫情中,通過藥物保健后PRRSV弱毒疫苗和PCV2滅活疫苗的緊急免疫,大群2周內(nèi)基本趨于穩(wěn)定。在以往的PRRSV和PCV2的混合感染案例中,大家傾向于提高管理水平、病弱豬隔離飼養(yǎng)及添加抗生素防止細(xì)菌的繼發(fā)感染[24-25]等綜合防控措施,疫苗緊急免疫的措施采取較少,但從筆者的疾病臨床防控經(jīng)驗來看,豬群在發(fā)生PRRSV波動早期時,弱毒活疫苗的緊急免疫有利于豬群微生態(tài)平衡的重新建立,短時期內(nèi)使大群趨于穩(wěn)定,減少豬傷亡。PCV2做為最小的動物病毒之一,在自然界中廣泛存在,PCV2單獨(dú)感染仔豬不會出現(xiàn)嚴(yán)重的臨床癥狀,PCV2與PRRSV的混合感染可彼此促進(jìn)感染進(jìn)程和加重臨床癥狀,本案例發(fā)現(xiàn)PCV2疫苗免疫能降低豬群PCV2的病毒血癥發(fā)生率,受野毒刺激的影響,康復(fù)的豬會再次感染出現(xiàn)PCV2病毒血癥;PCV2疫苗免疫后6周抗體S/P均值從1.55降至0.7,8周以后PCV2抗體水平持續(xù)增高到豬出欄,說明豬群中一直有PCV2的循環(huán)感染。為了提高豬場經(jīng)濟(jì)效益,建議養(yǎng)殖戶從引種源頭把好健康關(guān),杜絕PRRSV和PCV2陽性豬群的引入。從環(huán)境控制、飼養(yǎng)管理水平、預(yù)防用藥及合理免疫四方面協(xié)同提高豬健康度,避免疾病困擾造成的經(jīng)濟(jì)損失。