宣律，張玉想，王佳興，顧焱，任衛(wèi)東，孫正中，馬運(yùn)亞

1河北北方學(xué)院研究生學(xué)院，河北張家口 075000；2解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心重癥醫(yī)學(xué)科，北京 100091；3河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，河北張家口 075000

熱射病(heat stroke，HS)是指在高強(qiáng)度的體力活動(dòng)下或高溫環(huán)境中長(zhǎng)時(shí)間暴露，機(jī)體核心溫度上升超過40 ℃，出現(xiàn)中樞神經(jīng)功能受損癥狀(如顱內(nèi)高壓、譫妄、驚厥甚至昏迷等)同時(shí)伴有多器官功能損害的臨床綜合征[1]。HS 可分為經(jīng)典型(classic heat stroke，CHS)及勞力型(exertional heat stroke，EHS)[2]。HS的發(fā)病率呈逐年遞增趨勢(shì)，其中超過30%的患者治療后遺留中樞神經(jīng)功能障礙[3]。大腦皮質(zhì)、海馬及下丘腦為HS最常見的3個(gè)中樞神經(jīng)易損傷區(qū)域[4]。其中下丘腦室旁核(paraventricular nucleus，PVN)直接控制下丘腦-垂體-腎上腺軸的活動(dòng)，熱打擊后，PVN區(qū)域小細(xì)胞神經(jīng)元受損，使機(jī)體的熱耐受性降低，體溫調(diào)節(jié)功能受損，嚴(yán)重影響預(yù)后[5]。在熱應(yīng)激模型中，抑制大腦皮質(zhì)自噬會(huì)加重神經(jīng)元變性，提示自噬在神經(jīng)元損傷中可能具有防御作用[6]。雷帕霉素(rapamycin，Rapa)是一種新型的高效免疫抑制劑，能夠特異性抑制哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of Rapamycin，mTOR)的活性，該靶蛋白包括mTORC1及mTORC2兩種亞型，Rapa變構(gòu)可抑制mTORC1[7]。Rapa 通過調(diào)控mTOR 信號(hào)通路，激活或抑制細(xì)胞內(nèi)各種蛋白磷酸化，調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞的存活及凋亡，并參與調(diào)節(jié)自噬[8]。在缺血缺氧性腦病中，Rapa 主要通過抑制mTOR 信號(hào)通路而增強(qiáng)自噬，從而減輕對(duì)神經(jīng)元的損傷[8]。研究表明，熱應(yīng)激類似缺血缺氧性腦病，表現(xiàn)為皮膚血流量增加，內(nèi)臟器官血流量減少，導(dǎo)致大腦缺血缺氧性損傷以及下丘腦區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞壞死[4]。在急性腦損傷中，Rapa 可通過增強(qiáng)自噬而提高損傷區(qū)域的神經(jīng)元存活率[6]，但其能否通過調(diào)控mTOR 信號(hào)通路而減輕HS導(dǎo)致的下丘腦神經(jīng)元損傷，目前鮮見報(bào)道。本研究通過建立EHS大鼠模型，探討Rapa對(duì)EHS大鼠下丘腦神經(jīng)元的保護(hù)作用及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)儀器及試劑 將6 跑道小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)跑臺(tái)(型號(hào)為XR-PT-10A，購(gòu)自上海欣軟信息科技公司)放置于外觀透明且功能為模擬高濕高溫的氣候艙內(nèi)[9]，該艙可以精準(zhǔn)地對(duì)艙內(nèi)的濕度及溫度進(jìn)行控制并維持恒定。大鼠肛溫儀(型號(hào)為TH212，購(gòu)自上海玉研科技儀器公司)，實(shí)驗(yàn)開始之前進(jìn)行校準(zhǔn)，確保其靈敏度為0.1 ℃，精確度為≤±0.2 ℃，用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)大鼠核心溫度。 Rapa、 聚乙二醇300(polyethylene glycol 300，PEG300)及吐溫-80 購(gòu)自美國(guó)MCE 公司；二甲基亞砜(DMSO)購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；兔抗大鼠多克隆抗體自噬效應(yīng)蛋白(Beclin-1)、mTOR 及兔抗大鼠單克隆抗體磷酸化mTOR(phosphorylated mTOR， pmTOR) 均 購(gòu) 自 美 國(guó)Proteintech公司；兔抗大鼠單克隆抗體微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein1 light chain 3，LC3)購(gòu)自美國(guó)CST 公司；兔抗大鼠單克隆抗體p62購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；小鼠抗大鼠單克隆抗體β-actin購(gòu)自美國(guó)的Affinity公司。一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢賽維爾生物有限公司；山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG(辣根過氧化物酶標(biāo)記)均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)、腦活性肽100β 蛋白(S100β)、白細(xì)胞介素-6(IL-6)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購(gòu)自美國(guó)瑞博奧生物科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 80 只SPF 級(jí)成年健康雄性Wistar 大鼠購(gòu)自北京斯貝福生物科技公司，體重300～350 g，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK(京)2019-0010。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均在軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院SPF 級(jí)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)，室內(nèi)溫度20～22 ℃，相對(duì)濕度50%～60%。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案獲解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 研究方法

1.3.1 大鼠建模前的勞力性適應(yīng)性訓(xùn)練 在實(shí)施熱打擊實(shí)驗(yàn)前，大鼠先進(jìn)行1 周的勞力性適應(yīng)性跑步訓(xùn)練。訓(xùn)練采用階梯式鍛煉法，在室溫下進(jìn)行，前3 d 按如下程序訓(xùn)練：大鼠從飼養(yǎng)籠轉(zhuǎn)移到氣候艙后，初始按照5 m/min 的速度開始跑步(其坡度設(shè)定為0)，每隔2 min 速度增加1 m/min，在20 min 內(nèi)將其增加到15 m/min，之后以此速度勻速跑步，跑步過程中嚴(yán)密觀察，直到大鼠出現(xiàn)疲勞狀態(tài)(給予噪聲、輕推等無(wú)痛刺激驅(qū)趕后仍無(wú)法堅(jiān)持跑步至少5 s)，逐漸降速使其停止跑步，跑步時(shí)長(zhǎng)≤30 min。第4、5 天采用之前的訓(xùn)練方案，但跑步時(shí)長(zhǎng)延長(zhǎng)至≤60 min。第6、7天為休息日，只給予大鼠艙內(nèi)的環(huán)境適應(yīng)，不進(jìn)行跑步訓(xùn)練。訓(xùn)練過程中，不限制大鼠的飲水及進(jìn)食。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將80 只Wistar 大鼠分為對(duì)照組、雷帕霉素組(Rapa 組)、EHS組及EHS+Rapa組，每組20只。其中44只(每組隨機(jī)抽取11只)用于連續(xù)觀察大鼠自氣候艙中取出后的生存狀態(tài)，剩余36 只大鼠用于其余實(shí)驗(yàn)。Rapa(規(guī)格：25 mg)溶解于100% DMSO 溶液中，配制成濃度為2 g/L 的原液，將原液在-80 ℃凍存，15 μl 原液溶于PEG 300(600 μl)、吐溫-80(75 μl)及生理鹽水(810 μl)，配制為1.5 ml 的工作液，分別于Rapa 組及EHS+Rapa組大鼠建模前每日清晨8時(shí)以1 mg/kg 的劑量腹腔注射，1 次/d，連續(xù)4 d[10]，而對(duì)照組及EHS 組在同一時(shí)間點(diǎn)給予同體積生理鹽水腹腔注射。

1.3.3 建立EHS 大鼠模型 4 組大鼠在實(shí)施熱打擊實(shí)驗(yàn)之前，禁食12 h，可自由飲水，在建模前的30 min 稱重并禁止飲水。當(dāng)氣候艙的相對(duì)濕度達(dá)到55%±5%、溫度達(dá)到(39.5±0.3) ℃時(shí)，將EHS 組及EHS+Rapa 組大鼠放入艙內(nèi)并置于跑道上[11]，按照1.3.1 的方式進(jìn)行跑步訓(xùn)練。入艙全程仔細(xì)觀察大鼠的精神改變及意識(shí)情況，3 次重復(fù)確認(rèn)大鼠已達(dá)到EHS 的診斷標(biāo)準(zhǔn)后，從氣候艙內(nèi)將其取出，在室溫下自然降溫，繼續(xù)對(duì)大鼠的形態(tài)學(xué)的改變、神志狀態(tài)、核心溫度及生存時(shí)間進(jìn)行監(jiān)測(cè)。EHS 診斷標(biāo)準(zhǔn)為大鼠出現(xiàn)嚴(yán)重的HS神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙表現(xiàn)，即無(wú)自主的活動(dòng)時(shí)長(zhǎng)在5 s 以上(正位反射、角膜反射以及強(qiáng)烈疼痛刺激仍然存在)[12-13]。對(duì)照組及Rapa組大鼠在室溫條件下進(jìn)行與EHS組及EHS+Rapa組同等強(qiáng)度的勞力型跑步運(yùn)動(dòng)[14]。

1.3.4 實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)大鼠核心溫度 在EHS 模型建立過程中，將涂有潤(rùn)滑油的大鼠肛溫儀傳感器插入其肛門，插入深度5～7 cm。為防止傳感器脫落，用醫(yī)用膠帶將其固定在鼠尾。入艙前大鼠核心溫度范圍為37～38 ℃[15]，入艙后每隔5 min 記錄1 次核心溫度。觀察各組大鼠核心溫度的變化情況，繪制核心溫度動(dòng)態(tài)曲線。

1.3.5 記錄大鼠生存情況 成功建模后，每組隨機(jī)抽取11 只大鼠，自氣候艙中取出后，分別于50、100、150、200、250 及300 min 觀察其生存情況，并計(jì)算各組生存率。

1.3.6 大鼠下丘腦組織大體形態(tài)學(xué)觀察 EHS 組及EHS+Rapa 組大鼠在入艙80 min后，從艙中取出，觀察300 min。將各組大鼠采用適量乙醚進(jìn)行安樂死。從腹主動(dòng)脈采集適量的動(dòng)脈血，解剖大鼠后取出下丘腦組織，對(duì)下丘腦的形狀、大小、光澤、顏色、腫脹及淤血情況進(jìn)行大體觀察。

1.3.7 大鼠下丘腦組織病理學(xué)觀察 分離出完整的下丘腦組織，用PBS沖洗干凈，置于4%多聚甲醛溶液中固定，梯度濃度乙醇脫水、石蠟包埋、切片(厚度3～4 μm)，然 后 進(jìn) 行 蘇 木 精-伊 紅(hematoxylineosin，HE)及尼氏染色，樹膠封片、固定，觀察下丘腦的組織病理學(xué)改變。在光學(xué)顯微鏡(×400)下隨機(jī)選取5 個(gè)視野，參照Thoresen 等[16]的神經(jīng)元損傷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，由兩名病理學(xué)專家通過盲法評(píng)估各組的形態(tài)學(xué)變化。0 分，無(wú)明顯損傷；1 分，損傷面積＜10%，僅可觀察到個(gè)別的損傷神經(jīng)元；2 分，損傷面積為20%～30%，可觀察到局部損傷；3分，損傷面積40%～60%，可觀察到局部損傷；4 分，損傷面積＞75%，大量神經(jīng)元出現(xiàn)損傷，組織完全崩解。

1.3.8 免疫熒光法測(cè)定神經(jīng)元凋亡情況 大鼠下丘腦組織石蠟切片梯度濃度乙醇脫蠟后蒸餾水沖洗，滴入蛋白酶工作液，37 ℃孵育20 min，PBS 沖洗3次，每次5 min；破膜液常溫下孵育30 min，再次PBS 沖洗。按照一步法TUNEL 試劑盒說明書進(jìn)行TUNEL 染色及DAPI 染色，PBS(pH7.4)沖洗后封片，光鏡下觀察。采用Image J軟件對(duì)各組TUNEL染色切片圖像進(jìn)行分析，綠色熒光為凋亡細(xì)胞染色，藍(lán)色熒光為細(xì)胞核定位。顯微鏡下每張切片中任意隨機(jī)選取10個(gè)視野(×400)，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。凋亡率=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.3.9 Western blotting檢測(cè)大鼠下丘腦組織自噬相關(guān)蛋白的表達(dá) 將50 mg大鼠下丘腦組織加入4 ℃的組織裂解液中，完全裂解后測(cè)定蛋白濃度，然后行SDS-PAGE 電泳，電轉(zhuǎn)至PVDF 膜，脫脂奶粉室溫封閉。一抗為兔抗大鼠單克隆抗體LC3(1∶1000)、p62(1∶5000)、pmTOR(1∶1000)，小鼠抗大鼠單克隆抗體β-actin(1∶1000)，兔抗大鼠多克隆抗體Beclin-1(1∶1000)及mTOR(1∶5000)，二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔及山羊抗小鼠IgG(1∶600)，室溫孵育2 h，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯色。以β-actin 為內(nèi)參照，采用Image J 軟件進(jìn)行目的條帶灰度值分析，計(jì)算蛋白相對(duì)表達(dá)量，以及pmTOR/mTOR、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值。

1.3.10 ELISA 法檢測(cè)大鼠血清NSE、S100β、IL-6及TNF-α 的表達(dá)水平 按照ELISA 試劑盒說明書，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處的光密度(OD)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算大鼠血清NSE、S100β、IL-6 及TNF-α 的表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用GraphPad Prism 9軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布的計(jì)量資料以xˉ±s表示，多組間比較采用ANOVA單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；生存率采用Kaplan-Meier 法分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 建立EHS模型過程中大鼠核心溫度的變化 在入艙0 min 時(shí)，4 組大鼠的核心溫度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.634，P＞0.05)。在入艙80 min 時(shí)，4 組大鼠的核心溫度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1158，P＜0.01)；與對(duì)照組相比，EHS 組的核心溫度明顯升高[(42±0.4) ℃vs.(37.4±0.3) ℃，P＜0.001]；與Rapa 組相比，EHS+Rapa 組的核心溫度明顯升高[(42.8±0.3) ℃vs.(37.6±0.1) ℃，P＜0.001，圖1)。

圖1 EHS建模過程中大鼠核心溫度的變化(n=20)Fig.1 Changes of core temperature in rats during the development of an EHS model (n=20)

2.2 雷帕霉素對(duì)EHS大鼠生存率的影響 對(duì)照組及Rapa組300 min生存率均為100%，EHS組300 min生存率降低至28.3%(P＜0.01)，EHS+Rapa 組大鼠300 min 生存率升高至50.0%(P＜0.01，圖2)。

圖2 雷帕霉素對(duì)EHS大鼠生存率的影響(n=11)Fig.2 Effect of Rapamycin on survival rate of exertional heat stroke rats (n=11)

2.3 雷帕霉素對(duì)EHS大鼠下丘腦大體形態(tài)的影響對(duì)照組大鼠下丘腦呈淡粉紅色，色澤光亮，位于第三腦室底中央；Rapa 組下丘腦近似對(duì)照組；EHS 組大鼠下丘腦明顯腫脹增大，色澤暗淡，呈暗紅色，明顯向兩側(cè)擴(kuò)張，呈圓球形；與EHS組比較，EHS+Rapa 組大鼠下丘腦腫脹情況明顯減輕，表面顏色近似淡粉紅色，且外觀形態(tài)近似對(duì)照組(圖3)。

圖3 各組大鼠下丘腦標(biāo)本肉眼觀Fig.3 The morphological changes of hypothalamus were observed by naked eye

2.4 雷帕霉素對(duì)EHS大鼠下丘腦組織病理學(xué)改變的影響 HE染色結(jié)果顯示，對(duì)照組及Rapa組大鼠下丘腦組織結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞形態(tài)正常；與對(duì)照組比較，EHS 組大鼠下丘腦組織病理學(xué)損傷評(píng)分增加[(3.83±0.41)分vs.(1.17±0.41)分，P＜0.001]，可見大量神經(jīng)元細(xì)胞核深染、固縮伴膠質(zhì)細(xì)胞增生；與EHS組比較，EHS+Rapa組大鼠有少量膠質(zhì)細(xì)胞增生，神經(jīng)元細(xì)胞核深染、固縮程度減輕，病理學(xué)損傷評(píng)分降低[(2.5±0.55)分vs.(3.83±0.41)分，P＜0.001]。對(duì)照組及Rapa組病理學(xué)損傷評(píng)分比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(1.17±0.41)分vs.(1.17±0.41)分，P＞0.05，圖4A、B)。尼氏染色結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠下丘腦組織結(jié)構(gòu)清晰，尼氏體均勻分布于胞質(zhì)中；與對(duì)照組比較，EHS 組大鼠下丘腦組織尼氏體消失，神經(jīng)元細(xì)胞核固縮、深染；與EHS組比較，EHS+Rapa組大鼠下丘腦組織尼氏體結(jié)構(gòu)清晰，神經(jīng)元細(xì)胞核固縮、深染程度減輕(圖4C)。

圖4 各組大鼠的下丘腦組織學(xué)形態(tài)改變(n=10)Fig.4 Histological and morphological changes in hypothalamus of rats in each group (n=10)

2.5 雷帕霉素對(duì)EHS 大鼠下丘腦神經(jīng)元凋亡的影響 與對(duì)照組相比，EHS 組下丘腦神經(jīng)元凋亡率明顯升高(0.90%±0.06%vs.0.46%±0.15%，P＜0.05)；而EHS+Rapa組(0.66%±0.05%)大鼠下丘腦神經(jīng)元凋亡率低于EHS 組(P＜0.05)。Rapa 組下丘腦神經(jīng)元凋亡率(0.39%±0.07%)與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖5)。

圖5 各組大鼠下丘腦神經(jīng)元凋亡情況比較(n=15)Fig.5 Comparison of apoptosis of rat hypothalamic neurons in each group (n=15)

2.6 雷帕霉素對(duì)EHS 大鼠下丘腦組織中mTOR 及pmTOR 表達(dá)的影響 EHS 組大鼠下丘腦組織中pmTOR/mTOR 比值明顯高于對(duì)照組(1.03±0.01vs.0.09±0.03，P＜0.001)；與EHS 組相比，EHS+Rapa 組pmTOR/mTOR 比值明顯降低(0.53±0.02，P＜0.001)；Rapa 組pmTOR/mTOR 比值(0.11±0.06)與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖6)。

圖6 各組大鼠下丘腦組織pmTOR、mTOR的表達(dá)(Western blotting, n=10)Fig.6 pmTOR and mTOR expression levels of rat hypothalamus tissues in each group (Western blotting, n=10)

2.7 雷帕霉素對(duì)EHS 大鼠的下丘腦組織中LC3、Beclin-1 及p62 表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，EHS 組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比 值 升 高(3.74±0.44vs.1.65±0.01，P＜0.01)，而p62表達(dá)水平降低(0.49±0.06vs.0.76±0.03，P＜0.01)，Beclin-1 表 達(dá) 水 平 升 高(0.75±0.05vs.0.43±0.03，P＜0.01)。與EHS組相比，EHS+Rapa組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值(14.94±0.92)及Beclin-1 表達(dá)水平(1.12±0.02)升高，p62 表達(dá)水平降低(0.29±0.01)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。對(duì)照組與Rapa 組間LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及Beclin-1、p62 表達(dá)水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖7)。

圖7 各組大鼠下丘腦組織LC3、Beclin-1及p62表達(dá)水平比較(Western blotting, n=10)Fig.7 Expression levels of LC3, Beclin-1 and p62 of hypothalamic tissue of rats in each group (Western blotting, n=10)

2.8 雷帕霉素對(duì)EHS大鼠血清NSE、S100β、IL-6及TNF-α表達(dá)的影響 ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，EHS 組大鼠血清NSE [(3683±690) ng/Lvs.(1881±97.73) ng/L，P＜0.01)]、S100β [(310.30±85.0) ng/Lvs.(156.40±15.53)ng/L，P＜0.05]、IL-6 [(24.94±7.72) ng/Lvs.(15.62±2.04)ng/L，P＜0.05]及TNF-α [(71.36±24.26) ng/Lvs.(27.73±10.37) ng/L，P＜0.05]表達(dá)水平明顯升高；與EHS 組相比，EHS+Rapa 組大鼠血清NSE (1851±42.71) ng/L、S100β (162.4±16.2) ng/L、TNF-α (21.08±9.41) ng/L、IL-6 (8.87±4.61) ng/L 表達(dá)水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；對(duì)照組與Rapa 組間上述分子表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖8)。

圖8 各組大鼠血清NSE、S100β、TNF-α及IL-6表達(dá)水平比較(n=10)Fig.8 Protein expressions of NSE, S100β, TNF-α and IL-6 of rat serum in each group (n=10)

3 討 論

EHS的突出表現(xiàn)為高熱及中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害[17]。隨著熱應(yīng)激程度的加深，下丘腦神經(jīng)元明顯損傷，可見核深染及固縮[18]。中樞神經(jīng)炎癥參與了HS的中樞神經(jīng)損傷，IL-1β、IL-6及TNF-α等在HS小鼠皮質(zhì)及海馬下丘腦組織中明顯升高[19-20]，與腦血管水腫、神經(jīng)元凋亡的嚴(yán)重程度高度相關(guān)[21]。Sharma 等[22]發(fā)現(xiàn)，熱暴露后，大鼠的血腦屏障受損，腦組織缺血缺氧；小鼠皮質(zhì)及海馬等腦組織中炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6 的基因表達(dá)也同時(shí)顯著增高[23]。Watson等[24]發(fā)現(xiàn)在高溫環(huán)境下劇烈運(yùn)動(dòng)時(shí)，外周循環(huán)血液中S100β蛋白濃度增高；而HS腦損傷患者的NSE及S100β 蛋白表達(dá)會(huì)隨著腦損傷程度加重而增高[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，在勞力型熱射病模型建立過程中，EHS 大鼠核心溫度迅速升高，模型建立后大鼠生存率降低，下丘腦神經(jīng)元病理?yè)p傷明顯，血清中炎性因子水平增高，神經(jīng)元凋亡明顯，與既往研究結(jié)果一致，提示IL-6 及TNF-α 可介導(dǎo)EHS 大鼠全身炎癥反應(yīng)，加重下丘腦神經(jīng)元凋亡及組織損傷，且會(huì)影響大鼠的預(yù)后。

下丘腦被稱為人體的“恒溫器”，可通過調(diào)節(jié)機(jī)體代謝速率及體溫來(lái)維持核心溫度，使機(jī)體處于一種動(dòng)態(tài)平衡中。在正常狀態(tài)下，下丘腦視前區(qū)(preoptic anterior hypothalamus，POAH)可通過增加血流量及汗腺分泌來(lái)降溫，并通過降低代謝速率來(lái)減少熱量產(chǎn)生[26]。同時(shí)，下丘腦室旁核(paraventricular nucleus，PVN)區(qū)域可通過調(diào)節(jié)下丘腦、垂體及腎上腺皮質(zhì)等來(lái)協(xié)調(diào)其他生理反應(yīng)，如心率、血壓等，以維持熱穩(wěn)態(tài)[27]。研究發(fā)現(xiàn)，高溫能促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞凋亡，隨著熱應(yīng)激時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞凋亡率增高[28]。本研究結(jié)果顯示，EHS 組大鼠下丘腦神經(jīng)元凋亡率增高，提示EHS 可促進(jìn)神經(jīng)元的凋亡，這可能是EHS下丘腦發(fā)生損傷的原因之一。

在正常的生理?xiàng)l件下，機(jī)體細(xì)胞會(huì)維持基礎(chǔ)的自噬及凋亡水平，以維持細(xì)胞的自我更新及細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)。當(dāng)受到熱打擊時(shí)，細(xì)胞的自噬及凋亡水平會(huì)適度增強(qiáng)，以應(yīng)對(duì)熱損傷應(yīng)激反應(yīng)[29-30]。自噬及凋亡之間存在復(fù)雜的交互調(diào)控作用，主要?dú)w納為合作關(guān)系、對(duì)抗關(guān)系及推動(dòng)關(guān)系[31]。其中自噬及凋亡的對(duì)抗關(guān)系已有較多報(bào)道，如在腦缺血再灌注損傷及缺血性神經(jīng)元損傷等研究中均已證實(shí)[32-33]。熱打擊使神經(jīng)元細(xì)胞在短時(shí)間內(nèi)產(chǎn)生大量的蛋白變性產(chǎn)物、細(xì)胞器碎片等聚集物，且無(wú)法及時(shí)有效地清除，過多的自噬體在神經(jīng)元中蓄積，產(chǎn)生細(xì)胞毒性效應(yīng)，從而加速了神經(jīng)元的變性及凋亡[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，Rapa 可誘導(dǎo)自噬增強(qiáng)，但并未加重神經(jīng)元的凋亡，而EHS 大鼠自噬及凋亡程度均增加。究其原因，可能與雷帕霉素增強(qiáng)自噬并抑制凋亡信號(hào)有關(guān)。

自噬是普遍存在于真核生物細(xì)胞內(nèi)的一種自穩(wěn)機(jī)制，可利用溶酶體的消化分解途徑清除受損細(xì)胞器，是錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的一種“自我”分解代謝途徑。自噬的起始階段由Beclin-1介導(dǎo)形成，啟動(dòng)自噬的成核過程[34]。自噬體膜的形成是由Atg4 將LC3 的C 末端水解，并經(jīng)過泛素化修飾形成LC3-Ⅱ與自噬體膜結(jié)合，在自噬過程中，LC3-Ⅱ始終穩(wěn)定地特異性定位于自噬雙層膜上，因此LC3-Ⅱ或LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值已成為檢測(cè)自噬體數(shù)量的經(jīng)典方法。p62可將蛋白聚合物轉(zhuǎn)運(yùn)到自噬體并運(yùn)輸至溶酶體，當(dāng)自噬體與溶酶體融合時(shí)，p62及大分子將被水解，故p62 的表達(dá)與自噬活性成反比[35]。因此，通常以LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值聯(lián)合p62 表達(dá)評(píng)估自噬流的通暢性。自噬在清除受損細(xì)胞器及異常聚集的毒性蛋白中發(fā)揮著重要作用，Rapa 能改善阿爾茨海默病小鼠的認(rèn)知能力，主要是通過抑制pmTOR表達(dá)，增加自噬標(biāo)志物L(fēng)C3-Ⅱ的表達(dá)[36]。既往研究發(fā)現(xiàn)，自噬在HS大腦皮質(zhì)中作為對(duì)抗神經(jīng)元變性的保護(hù)機(jī)制，而3-MA預(yù)處理可加重HS大鼠腦神經(jīng)元的變性[6]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在EHS 大鼠下丘腦組織中，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值以及Beclin-1 表達(dá)水平顯著增高，p62 表達(dá)水平明顯降低，而給予Rapa 干預(yù)可明顯增強(qiáng)這一現(xiàn)象，提示EHS 大鼠下丘腦神經(jīng)元自噬水平增高，而Rapa 可通過抑制下丘腦組織中的mTOR 通路，上調(diào)其下游分子Beclin-1的表達(dá)，從而進(jìn)一步增強(qiáng)自噬水平，起到對(duì)抗神經(jīng)元凋亡、減輕EHS 大鼠下丘腦損傷的作用。

mTOR 作為自噬的負(fù)調(diào)控因子，參與抑制自噬進(jìn)程并具有對(duì)抗凋亡的作用。當(dāng)PI3K/AKT/mTOR通路被激活時(shí)，可加速mTOR 的磷酸化，應(yīng)用Rapa阻斷該通路后，mTOR 的磷酸化相應(yīng)減少[37]。研究發(fā)現(xiàn)，在帕金森病模型中，Rapa 可通過抑制mTOR激活來(lái)促進(jìn)自噬，清除α-突觸核蛋白，保護(hù)神經(jīng)元[38]。在缺氧/缺血性損傷中，Rapa可通過增強(qiáng)自噬來(lái)清除細(xì)胞及組織，提高神經(jīng)元的存活率，改善缺氧/缺血性腦損傷以及神經(jīng)行為改變和意識(shí)障礙[39]。在缺血性腦卒中的大鼠大腦皮質(zhì)中，磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B，pAkt)、pmTOR、低氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)及NF-κB 的表達(dá)上調(diào)，表明在腦缺血急性期，mTOR 參與了組織抗凋亡、抗炎的病理生理過程[20]。本研究發(fā)現(xiàn)，EHS 大鼠下丘腦中的pmTOR 表達(dá)增加，給予Rapa 干預(yù)能夠減輕下丘腦的病理改變，減少神經(jīng)元細(xì)胞凋亡，降低mTOR磷酸化及TNF-α、IL-6的表達(dá)水平。另外，近期研究發(fā)現(xiàn)，S100β 及NSE 可作為診斷HS 患者腦損傷及血腦屏障受損的生物標(biāo)志物[40]。本研究發(fā)現(xiàn)，Rapa 干預(yù)明顯降低了EHS 模型大鼠下丘腦組織中NSE、S100β蛋白的表達(dá)水平，提示Rapa可逆轉(zhuǎn)熱應(yīng)激導(dǎo)致的神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞損傷，延長(zhǎng)大鼠的生存時(shí)間。由此可見，Rapa 能夠誘導(dǎo)神經(jīng)元自噬，在一定程度上緩解缺血所產(chǎn)生的損傷，從而發(fā)揮神經(jīng)元保護(hù)作用。該結(jié)果也證實(shí)了Rapa 能夠通過調(diào)控mTOR 通路誘導(dǎo)神經(jīng)元自噬、抗炎及抗凋亡，對(duì)EHS大鼠下丘腦組織具有保護(hù)作用。

本研究仍存在局限性。筆者已經(jīng)從分子機(jī)制上證實(shí)了雷帕霉素治療的有效性，即雷帕霉素可以通過抑制EHS大鼠下丘腦組織mTOR通路來(lái)增強(qiáng)自噬，從而減輕EHS 大鼠下丘腦的神經(jīng)元損傷以及機(jī)體的炎癥反應(yīng)。后續(xù)研究應(yīng)在電鏡下直接觀察下丘腦神經(jīng)元自噬囊泡的形成，以進(jìn)一步驗(yàn)證自噬在EHS 下丘腦損傷中的保護(hù)作用。

綜上所述，雷帕霉素能改善EHS 大鼠下丘腦組織損傷，降低炎性因子TNF-α 及IL-6 的表達(dá)水平，下調(diào)外周血中神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞損傷標(biāo)志物NSE、S100β，促進(jìn)下丘腦神經(jīng)元的自噬，從而對(duì)抗凋亡，機(jī)制主要為抑制mTOR 活化、激活LC3 介導(dǎo)的自噬通路。因此，雷帕霉素是一種潛在的EHS 治療藥物，具有較好的臨床應(yīng)用前景。