劉育妍，李云，胡婕，宣律，王陸，袁睿，鄧子輝，張玉想，康紅軍*

1解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 100853；2解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心重癥醫(yī)學(xué)科，北京 100853；3河北北方學(xué)院研究生學(xué)院，河北張家口 075000；4解放軍總醫(yī)院研究生院生物化學(xué)教研室，北京 100853；5解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心重癥醫(yī)學(xué)科，北京 100091

熱射病(heat stroke，HS)是一種危害性高且后果嚴(yán)重的熱致疾病，其中伴有多器官功能障礙綜合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)的經(jīng)典型熱射病(classic heat stroke，CHS)是由熱損傷因素直接作用于機(jī)體引發(fā)的、以核心體溫(core temperature，Tc)升高及中樞神經(jīng)系統(tǒng)異常為特征的臨床危重癥[1-2]。有數(shù)據(jù)顯示，經(jīng)過(guò)醫(yī)院救治的CHS患者病死率仍高達(dá)63.2%[1，3]。合適的動(dòng)物模型是深入研究HS損傷的重要基礎(chǔ)，并可為臨床救治工作的開展提供新思路。目前報(bào)道的CHS 動(dòng)物模型主要包括羊[4]、兔[5]、豬[6]、狒狒[7]、大鼠[8]及小鼠[9]等，其中大型動(dòng)物往往因配合度及操作性差，需進(jìn)行束縛、麻醉等處理。麻醉藥物會(huì)影響動(dòng)物的生理狀態(tài)，包括改變機(jī)體在熱環(huán)境中的體溫調(diào)節(jié)機(jī)制[10]，束縛也會(huì)影響動(dòng)物自發(fā)的體溫調(diào)節(jié)動(dòng)作，如在腹部涂抹唾液促進(jìn)蒸發(fā)降溫等，上述因素均會(huì)影響自發(fā)CHS的實(shí)驗(yàn)研究。因此，體型小、易操作、清醒且可自由活動(dòng)的小鼠成為近年來(lái)HS相關(guān)研究中最常使用的模型動(dòng)物。既往實(shí)驗(yàn)研究中建立CHS小鼠模型的方法不盡相同，造模終點(diǎn)體溫為35.0～43.5 ℃，熱暴露時(shí)間為60～180 min[9，11-15]。有團(tuán)隊(duì)使用高熱直接打擊法建立CHS 腦損傷[12，16]、肝損傷[17]、肺損傷[18]、腸損傷模型[19]，但該方法建立的CHS 模型造成的全身器官損傷似乎并不嚴(yán)重，死亡事件只發(fā)生在24 h 內(nèi)。另有報(bào)道顯示，采用逐步升溫法建立CHS 模型可導(dǎo)致包括神經(jīng)系統(tǒng)在內(nèi)的多器官嚴(yán)重受損，全身炎癥反應(yīng)水平較高，且24 h 后仍持續(xù)有小鼠死亡事件發(fā)生[20-22]，與伴MODS 的CHS 患者臨床表現(xiàn)相似。但目前尚無(wú)研究比較兩種熱打擊策略建立的CHS小鼠模型多器官損傷程度及全身炎癥反應(yīng)水平。本研究選擇高熱直接打擊法及逐步升溫法兩種方法，在濕度為60%的環(huán)境中建立CHS 小鼠模型，并使用多維評(píng)價(jià)指標(biāo)比較CHS 小鼠各器官損傷程度及全身炎癥反應(yīng)水平，以選擇更符合CHS 患者病理生理狀態(tài)的動(dòng)物模型，為HS后各器官損傷的研究及藥物研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及儀器 SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠66只，體重(28.52±2.1) g，均由解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案均通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)(編號(hào)：2022-X18-19)，并按照《NIH 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》(第4 版，2008)飼養(yǎng)1 周以上使其適應(yīng)環(huán)境。飼養(yǎng)條件為每籠5 只，室溫(22±1.6)℃，空氣相對(duì)濕度35%～45%，氣壓101.325 kPa，12 h 晝/夜循環(huán)，自由進(jìn)食及飲水。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，所有小鼠用戊巴比妥鈉(60 mg/kg)腹腔注射麻醉，采用頸椎脫臼法處死。主要儀器和材料為HWS-350B 模擬氣候艙(北京市恒諾利興科技有限公司)，BB-XGJ 小鼠肛溫計(jì)(北京搏貝科技有限公司)，ZG-TP101 小動(dòng)物電子秤(永康市松竫商貿(mào)有限公司)，Cobas?8000全自動(dòng)生化分析儀(日本株式會(huì)社日立制作所)，ProcartaPlex 多因子檢測(cè)試劑盒(貨號(hào)：PPX-07、 EPX01A-20608-901， 美 國(guó) ThermoFisher Scientific 公司)，Pannoramic MIDI Case Viewer 系統(tǒng)(匈牙利3DHISTECH有限公司)。

1.2 動(dòng)物分組及處理 使用高溫直接打擊法及逐步升溫打擊法建立CHS小鼠模型。將66只C57BL/6J小鼠編號(hào)后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為室溫對(duì)照組(n=10)、直接熱打擊(DHS)組(n=28)及逐步升溫?zé)岽驌?SHS)組(n=28)。DHS、SHS 組按照不同熱打擊策略處理達(dá)到CHS 標(biāo)準(zhǔn)后恢復(fù)24 h 時(shí)，每組隨機(jī)抽取4只小鼠取材并檢測(cè)各項(xiàng)指標(biāo)。對(duì)照組在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)隨機(jī)抽取5 只取材。剩余全部小鼠進(jìn)行72 h 生存分析。

1.3 熱打擊策略 實(shí)驗(yàn)期間小鼠禁食禁水，置于常規(guī)飼養(yǎng)籠中(3～5 只/籠)。DHS 組模擬氣候艙溫度、濕度設(shè)置為41 ℃、60%后穩(wěn)定運(yùn)行1 h以上，將小鼠飼養(yǎng)籠直接放入艙中進(jìn)行熱暴露。SHS 則將模擬氣候艙溫度、濕度設(shè)置為25 ℃、60%，穩(wěn)定運(yùn)行1 h后將小鼠飼養(yǎng)籠放入艙中，在1 h 內(nèi)逐漸升溫到39.5 ℃，升溫速率約為0.25 ℃/min。對(duì)照組小鼠一直處于(22.0±1.6) ℃的室溫環(huán)境中。在既往有關(guān)CHS動(dòng)物模型的研究中，可能由于物種間的差異及研究方法不同，嚙齒類動(dòng)物的最低致死溫度為40.4～46.0 ℃[23-24]。本研究終點(diǎn)體溫主要參考CHS 小鼠模型的國(guó)際公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)42.7 ℃[15，20]，以滿足高溫對(duì)小鼠多器官產(chǎn)生損傷的最低體溫要求。

將小鼠放入實(shí)驗(yàn)艙后密切觀察其活動(dòng)規(guī)律與意識(shí)狀態(tài)，并監(jiān)測(cè)直腸溫度(rectal temperature，Tr)。當(dāng)小鼠出現(xiàn)以下任意一種情況即視為造模終點(diǎn)，需立即轉(zhuǎn)移出艙進(jìn)一步處理：(1)Tr≥42.7 ℃；(2)出現(xiàn)意識(shí)障礙，即無(wú)自主活動(dòng)(輕度無(wú)痛刺激不能驅(qū)趕動(dòng)物爬行或改變位置)時(shí)間＞5 s[25-26]；(3)瀕死，即出現(xiàn)明顯抽搐，呼吸節(jié)律明顯改變。

小鼠出艙后復(fù)測(cè)Tr并迅速轉(zhuǎn)移至(22.0±1.6) ℃的通風(fēng)環(huán)境中，腹腔注射生理鹽水(30 ml/kg)。復(fù)測(cè)時(shí)若Tr＜42.7 ℃則記錄為造模失??；若小鼠在模擬艙中死亡或在出艙后30 min 內(nèi)死亡則記錄為造模死亡；若Tr≥42.7 ℃，伴有意識(shí)障礙則判定為CHS 造模成功。

1.4 Tc 檢測(cè) Tc 以Tr 代替，將肛溫計(jì)軟頭部位插入小鼠直腸2～3 cm 后，按下開關(guān)(ON/OFF)鍵，“嘀”聲后開始測(cè)量，當(dāng)聽到持續(xù)“嘀....”聲后測(cè)量結(jié)束，取出肛溫計(jì)記錄結(jié)果。小鼠入實(shí)驗(yàn)艙后每30 min 測(cè)量1 次，熱 打擊90 min 后 轉(zhuǎn)為每10 min 測(cè)量1次。

1.5 脫水程度估計(jì) 造模開始前，所有小鼠在精確到0.1 g 的小動(dòng)物電子秤上稱重，得到熱打擊前體重(pre-heat stroke body weight，pre-BW)。達(dá)到造模終點(diǎn)后取出小鼠稱重，得到熱打擊后體重(post-heat stroke body weight，post-BW)。采用脫水百分比(percent dehydration，PD)評(píng)估脫水程度，估算方法為：PD=(pre-BW-post-BW)/pre-BW×100%[27]。

1.6 標(biāo)本留取 采用隨機(jī)數(shù)字表法在DHS、SHS 組造模成功的CHS 小鼠中各抽取4 只，在熱打擊結(jié)束后24 h 腹腔注射戊巴比妥鈉(60 mg/kg)進(jìn)行快速麻醉，麻醉成功后頸椎脫臼處死，進(jìn)行開胸及心內(nèi)穿刺放血，置入1.5 ml 微離心管中。全血室溫(20～25 ℃)凝固20～30 min，1000 ×g離心10 min，取上層血清于-80 ℃凍存；分離肝、腎、腸、肺、脾組織，部分固定于4%多聚甲醛溶液，制作4 μm 石蠟切片，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin，HE)染色后，利用Case Viewer 系統(tǒng)進(jìn)行可視化及掃描；每只小鼠取固定的左上葉肺組織，稱量并記錄濕重(wet weight，W)，然后于80 ℃干燥24 h至恒重，再次稱量并記錄干重(dry weigh，D)，計(jì)算肺濕/干重比(W/D)。

1.7 主要器官損傷組織病理學(xué)評(píng)分 為進(jìn)一步評(píng)估HS 造成的器官組織損傷程度，參照以往的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，制定HS各器官損傷分級(jí)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，將所有組織學(xué)切片打亂分組順序后，由兩位經(jīng)驗(yàn)豐富的病理學(xué)醫(yī)師閱讀并評(píng)分。各器官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下。

1.7.1 肝損傷組織病理學(xué)評(píng)分 根據(jù)急性肝損傷的病理情況[28]制定兩項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)：肝實(shí)質(zhì)變性壞死嚴(yán)重程度及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度。每項(xiàng)按4 分量表(0～3)進(jìn)行評(píng)分，總分為兩項(xiàng)評(píng)分之和。

1.7.2 腎損傷組織病理學(xué)評(píng)分 根據(jù)急性腎損傷的病理情況[29]制定三項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)：腎小管損傷情況、腎小球損傷情況及微血栓含量。每項(xiàng)按4 分量表(0～3)進(jìn)行評(píng)分，總分為三項(xiàng)評(píng)分之和。

1.7.3 腸損傷組織病理學(xué)評(píng)分 根據(jù)Chiu's 評(píng)分[30]制定腸黏膜病變進(jìn)展標(biāo)準(zhǔn)，評(píng)估腸損傷情況，按6分量表(0～5)進(jìn)行評(píng)分。

1.7.4 肺損傷組織病理學(xué)評(píng)分 根據(jù)McGuigan 評(píng)分法[31]制定四項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)：肺泡間質(zhì)水腫增厚、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、肺泡及間質(zhì)出血以及透明膜形成。每項(xiàng)按4分量表(0～3)進(jìn)行評(píng)分，總分為四項(xiàng)評(píng)分之和。

1.7.5 脾損傷組織病理學(xué)評(píng)分 根據(jù)脾內(nèi)易染體巨噬細(xì)胞占白髓的比例評(píng)估脾臟損傷情況[20]，按4 分量表(0～3)進(jìn)行評(píng)分，其中＜10%記0分，10%～15%記1分，15%～20%記2分，≥20%記3分。

1.8 生化標(biāo)志物及細(xì)胞因子檢測(cè) 使用全自動(dòng)生化分析儀測(cè)定血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)、肌 酐(creatinine， CREA)、 血 尿 素 氮(blood urea nitrogen，BUN)、堿 性 磷 酸 酶(alkaline phosphatase，ALP)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)及肌酸激酶同工酶MB(creatine kinase-MB，CK-MB)水平。使用多因子檢測(cè)試劑盒測(cè)定血清中白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6、腫 瘤 壞 死 因 子(tumor necrosis factor，TNF)-α、單核細(xì)胞趨化蛋白(monocyte chemotactic protein， MCP) -1 及 轉(zhuǎn) 化 生 長(zhǎng) 因 子(transforming growth factor，TGF)-β的水平。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 21.0、GraphPad 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以x±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步組間兩兩比較采用LSD-t法；計(jì)數(shù)資料以例(%)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier曲線分析小鼠生存情況，組間比較采用Log-rank檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩種熱打擊策略的造模結(jié)果 實(shí)驗(yàn)流程見圖1。兩組小鼠對(duì)高溫反應(yīng)較激烈，表現(xiàn)為入艙后躁動(dòng)不安、在艙內(nèi)自發(fā)運(yùn)動(dòng)增多、向籠頂攀爬尋找通風(fēng)口、在皮毛上涂抹唾液等。隨著熱暴露時(shí)間延長(zhǎng)，小鼠自發(fā)運(yùn)動(dòng)減少，艙內(nèi)運(yùn)動(dòng)軌跡從復(fù)雜繞路運(yùn)動(dòng)變?yōu)橘N邊緣或沿對(duì)角直線前進(jìn)，攀爬籠頂?shù)男袨橹饾u減少甚至消失，呼吸短促。DHS 組及SHS 組小鼠pre-BW 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，SHS 組post-BW 明顯低于DHS 組(P＜0.05)，PD 明顯高于DHS 組(P＜0.001)，在模擬艙中熱暴露時(shí)長(zhǎng)明顯高于DHS 組(P＜0.001)，出艙時(shí)Tr 也明顯高于DHS 組(P＜0.001，表1)。終止實(shí)驗(yàn)時(shí)，DHS組有3只小鼠在模擬艙中死亡，15只(包括死亡的3 只)出艙時(shí)Tr 未達(dá)42.7 ℃；SHS 組5 只小鼠死亡，其余Tr均達(dá)到42.7 ℃。因此，DHS組成功造模13 只，SHS 組成功造模23 只，SHS 組造模成功率明顯高于DHS 組(82.1%vs.46.4%，P＜0.01)。對(duì)照組實(shí)驗(yàn)期間無(wú)小鼠死亡，DHS 組造模成功小鼠24 h內(nèi)死亡2 只，SHS 組24、48 及72 h 分別死亡8、4 及2 只。Kaplan-Meier 曲 線 顯 示，DHS 組72 h 生 存 率 為77.78%，SHS 組為26.32%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖2)。

表1 兩組小鼠熱打擊前后基本情況比較Tab.1 Comparison of basic information between the two groups of mice before and after heat stroke

圖1 小鼠熱打擊實(shí)驗(yàn)流程Fig.1 Flow chart of heatstroke experimental process in mice

圖2 熱打擊小鼠Kaplan-Meier生存曲線Fig.2 Kaplan-Meier survival curve of heat shock mice

2.2 肝損傷指標(biāo)、組織病理學(xué)變化及損傷評(píng)分 對(duì)照組ALT、AST均處于較低水平，肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，無(wú)異常炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。經(jīng)熱打擊后，DHS 組及SHS組ALT、AST 均有上升，但DHS 組與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。SHS 組ALT、AST 均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(875.63±241.24) U/Lvs.(39.67±9.54) U/L，P＜0.05；(2406.75±1008.69) U/Lvs.(179.00±130.44) U/L，P＜0.001]，且明顯高于DHS 組(P＜0.05)。病理學(xué)檢查結(jié)果顯示，DHS組小鼠部分肝細(xì)胞水腫，有點(diǎn)狀壞死，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)較少，恢復(fù)24 h 后生化指標(biāo)改變并不明顯；而SHS 組部分沿肝小葉分布的肝細(xì)胞有明顯變性壞死，且壞死部位伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，其余部分有明顯的肝細(xì)胞水腫，病理?yè)p傷評(píng)分明顯高于DHS 組(3.93±1.16vs.2.73±1.34，P＜0.05，圖3A)。

圖3 HS小鼠各臟器功能指標(biāo)、組織病理學(xué)變化及損傷評(píng)分Fig.3 Function indicators, histopathological changes and damage scores of various organs in mice with heat stroke

2.3 腎損傷指標(biāo)、組織病理學(xué)變化及損傷評(píng)分 對(duì)照組CREA、BUN均處于較低水平，腎小管上皮細(xì)胞排列有序，而熱打擊后DHS 組和SHS 組發(fā)生了明顯的急性腎損傷改變。DHS 組CREA、BUN 變化不大，與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(18.75±10.51) μmol/Lvs.(17.00±7.00) μmol/L，P＞0.05；(177.5±73.1) mg/Lvs.(239.9±37.2) mg/L，P＞0.05]；病理學(xué)檢查顯示部分腎小管上皮細(xì)胞壞死，管腔內(nèi)可見少量管型，腎小球充血，且出現(xiàn)包括皮、髓交界處腎小管上皮細(xì)胞壞死、腎小管擴(kuò)張、大量管型，另外還可見腎小球毛細(xì)血管及腎間質(zhì)血管擴(kuò)張、血管內(nèi)血栓及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。SHS組CREA、BUN分別為(79.88±41.39) μmol/L、(1343.3±525.4) mg/L，均明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì) 學(xué) 意 義(P＜0.05)，且 明 顯 高 于DHS 組(P＜0.05)。SHS 組腎損傷評(píng)分明顯高于DHS 組(5.53±1.06vs.3.60±0.83，P＜0.001，圖3B)。

2.4 腸組織病理學(xué)變化及損傷評(píng)分 對(duì)照組小鼠腸黏膜內(nèi)壁平整，可見杯狀細(xì)胞，未見明顯損傷。在熱打擊之后，DHS 組腸絨毛間隙增寬，絨毛頂端上皮下Gruenhagen 空間增大，且伴有毛細(xì)血管充血。SHS 組的損傷評(píng)分明顯高于DHS 組(1.60±0.74vs.0.27±0.46，P＜0.001)，損傷更嚴(yán)重，視野中已出現(xiàn)上皮下間隙明顯增寬、固有層與上皮層分離、部分腸細(xì)胞脫落、絨毛中央乳質(zhì)擴(kuò)張以及毛細(xì)血管出血等改變，還可見中性粒細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖3C)。

2.5 肺濕/干重比、肺組織病理學(xué)變化及損傷評(píng)分三組間W/D 差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(4.94±0.03vs.4.84±0.49vs.4.45±0.20，P＞0.05)。對(duì)照組小鼠肺泡及間質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰，未見明顯病理?yè)p傷改變；經(jīng)熱打擊后，部分肺泡間隔及肺泡中含有大量紅細(xì)胞，可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)肺間質(zhì)，肺間質(zhì)增厚，部分肺泡結(jié)構(gòu)無(wú)法辨認(rèn)，且SHS 組肺損傷組織病理學(xué)評(píng)分明顯高于DHS組(3.00±1.13vs.1.33±0.98，P＜0.001，圖3D)。

2.6 脾組織病理學(xué)變化及損傷評(píng)分 對(duì)照組小鼠脾臟未見明顯異常，白髓、紅髓之間界限清晰。經(jīng)熱打擊后，白髓內(nèi)可見明顯的、由易染體巨噬細(xì)胞吞噬的核碎裂淋巴細(xì)胞及部分細(xì)胞碎片。SHS 組脾損傷病理評(píng)分明顯高于DHS 組(2.80±0.56vs.1.80±0.86，P＜0.01)，且發(fā)生壞死的淋巴細(xì)胞更多，易染體巨噬細(xì)胞占白髓的比例更高(圖3E)。

2.7 熱打擊對(duì)生化指標(biāo)及外周血炎性因子的影響DHS 組IL-6 明顯高于對(duì)照組(P＜0.01)，IL-1β 明顯低于對(duì)照組(P＜0.001)。SHS 組ALP、LDH、CK-MB、MCP-1、IL-6 明 顯 高 于 對(duì) 照 組(P＜0.05)，IL-1β 及TGF-β明顯低于對(duì)照組(P＜0.001)；SHS組LDH、CKMB、MCP-1 明顯高于DHS 組(P＜0.05)，TGF-β 明顯低于DHS組(P＜0.001，圖4)。

圖4 HS小鼠生化指標(biāo)及炎性因子水平比較Fig.4 Comparison of biochemical indicators and inflammatory factors in mice with heatstroke

3 討 論

HS 是以Tc 升高、中樞神經(jīng)系統(tǒng)紊亂為典型特征，常造成多器官損傷的一種嚴(yán)重?zé)嵯嚓P(guān)疾病[32]。經(jīng)過(guò)重癥監(jiān)護(hù)病房(intensive care unit，ICU)救治后，CHS患者的病死率仍高于60%[3]，且早期ICU患者的死因多為并發(fā)無(wú)法逆轉(zhuǎn)的MODS，一旦MODS開始，臨床常用治療措施很難阻止這一過(guò)程[33]。因此，及早應(yīng)對(duì)、阻止HS發(fā)病早期的器官損傷是降低病死率的重要手段。建立一個(gè)與HS患者實(shí)際情況相符且較穩(wěn)定的動(dòng)物模型，對(duì)HS發(fā)病機(jī)制及藥物干預(yù)效果的研究具有重要意義。

目前，建立CHS 動(dòng)物模型主要包括3 個(gè)要素：高溫誘導(dǎo)條件、動(dòng)物體溫測(cè)量及動(dòng)物種類選擇[34]。本研究使用兩種不同熱打擊策略建立CHS 小鼠模型，通過(guò)比較多項(xiàng)指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，使用逐步升溫法造模的小鼠在高溫高濕環(huán)境中所受熱打擊時(shí)間較長(zhǎng)，造模成功率較高，且造模成功的小鼠各器官損傷較重，72 h 死亡率較高。造成兩種熱打擊策略出現(xiàn)損傷程度差異的內(nèi)在機(jī)制可能有以下幾點(diǎn)。(1)體溫調(diào)節(jié)中樞的反應(yīng)及效應(yīng)時(shí)間不同：小鼠皮膚無(wú)汗腺，降溫的主要方法是擴(kuò)張皮膚血管，增加對(duì)流散熱及唾液分泌，加強(qiáng)蒸發(fā)散熱。DHS 組小鼠受到短期、劇烈的環(huán)境熱刺激，會(huì)導(dǎo)致體溫調(diào)節(jié)中樞迅速得到信號(hào)并及時(shí)做出降溫反應(yīng)，此時(shí)小鼠的Tc尚處于正常范圍內(nèi)，暫時(shí)處于“健康”狀態(tài)，體溫調(diào)節(jié)引起的自發(fā)動(dòng)作多；SHS 組小鼠在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)環(huán)境溫度無(wú)異常，并未激發(fā)降溫反應(yīng)，緩慢升溫過(guò)程中體溫調(diào)定點(diǎn)會(huì)隨環(huán)境溫度逐漸上調(diào)，待突破體溫調(diào)定點(diǎn)的最高溫度后，才開始進(jìn)行被動(dòng)的降溫反應(yīng)[35]，此時(shí)小鼠已進(jìn)入“病理狀態(tài)”，分泌、涂抹唾液的自主活動(dòng)明顯減少，與CHS患者的少汗癥相似。(2)與機(jī)體脫水程度有關(guān)：本研究中，SHS 組小鼠較DHS 組在熱環(huán)境中的時(shí)間較長(zhǎng)，出艙后體重較低，機(jī)體的脫水程度較高。嚴(yán)重脫水會(huì)造成循環(huán)血量明顯降低，組織器官血液流量及灌注量不足，繼發(fā)缺血-氧化應(yīng)激反應(yīng)。(3)與熱應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)：熱應(yīng)激是指機(jī)體受到超過(guò)自身體溫調(diào)節(jié)能力的過(guò)高溫度刺激時(shí)產(chǎn)生的非特異性應(yīng)答反應(yīng)的總和[3]。DHS 組小鼠直接進(jìn)入極端高溫環(huán)境后，機(jī)體快速出現(xiàn)對(duì)高熱的反射性調(diào)節(jié)，如機(jī)體自身產(chǎn)熱減少、Tc 及心率下降、呼吸加快，以及產(chǎn)生熱休克蛋白等反應(yīng)[36]，對(duì)組織器官及細(xì)胞均有一定的保護(hù)作用，促進(jìn)熱量流失恢復(fù)至正常體溫的保護(hù)性反應(yīng)可能使DHS 組小鼠各器官損傷較輕[37-38]。(4)與熱負(fù)荷總量有關(guān)：由熱負(fù)荷公式(℃·min)=核心體溫≥39 ℃的熱暴露時(shí)間×(最大Tc-39 ℃)[10]可知，熱負(fù)荷總量與機(jī)體的熱暴露時(shí)間及最大Tc 密切相關(guān)。SHS 組小鼠在≥39 ℃環(huán)境中的熱暴露時(shí)間明顯長(zhǎng)于DHS組，出艙時(shí)最大Tc較高，這導(dǎo)致SHS 組小鼠的熱負(fù)荷總量高于DHS 組，因此其各器官受損較嚴(yán)重。

由于小鼠皮膚沒(méi)有汗腺，唾液分泌能力也有限，熱量損失無(wú)法與高溫環(huán)境被動(dòng)輸入的熱量相匹配，持續(xù)一段時(shí)間后體溫調(diào)節(jié)失敗，小鼠Tc 迅速上升，且血液重新分布時(shí)會(huì)導(dǎo)致器官血管持續(xù)收縮，造成組織缺血，上述持續(xù)性損傷會(huì)誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)，并最終導(dǎo)致MODS。在不同的升溫策略下，機(jī)體的體溫調(diào)節(jié)反應(yīng)不同，因此造成器官損傷的嚴(yán)重程度存在差異。大型動(dòng)物往往因配合度、操作性差，需進(jìn)行麻醉、束縛等處理，影響自發(fā)CHS 的實(shí)驗(yàn)研究，本研究選用體型小、清醒且可自由活動(dòng)的雄性C57BL/6J 小鼠，排除了雌鼠體內(nèi)雌激素水平波動(dòng)對(duì)高溫暴露的可能影響[39-40]，且C57BL/6 小鼠在空間學(xué)習(xí)記憶能力方面較其他品系小鼠更有優(yōu)勢(shì)[41]，有利于后續(xù)開展CHS 長(zhǎng)期神經(jīng)后遺癥及其治療的相關(guān)研究。

本研究在造模過(guò)程發(fā)現(xiàn)，兩組小鼠出艙時(shí)達(dá)到的最高體溫越高、熱打擊持續(xù)時(shí)間越長(zhǎng)，各器官的損傷越重，后續(xù)死亡率也越高。Leon 等[27]設(shè)置終點(diǎn)體溫相差0.3 ℃的三組小鼠，生存率分別為100%、92%、46%，且小鼠出艙前達(dá)到的最高體溫也越高，恢復(fù)低體溫所需時(shí)間就越長(zhǎng)，死亡風(fēng)險(xiǎn)也越高。因此對(duì)小鼠Tc的精準(zhǔn)監(jiān)測(cè)也是造模成功的要點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)中衡量造模終點(diǎn)的指標(biāo)除Tr外，還綜合了小鼠的意識(shí)狀態(tài)及生命體征，避免了間斷監(jiān)測(cè)Tr時(shí)已達(dá)到出艙標(biāo)準(zhǔn)卻漏判的情況。模擬氣候艙的溫度、濕度均可控，能夠較好地模擬CHS發(fā)生時(shí)高溫高濕的自然環(huán)境，且造模過(guò)程中小鼠處于清醒狀態(tài)，與CHS患者自然發(fā)病的狀態(tài)類似，從可視窗中還可以觀察小鼠的精神及活動(dòng)狀態(tài)。

中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙是HS的主要特征。神經(jīng)細(xì)胞對(duì)高溫?fù)p傷極為敏感，HS后神經(jīng)損傷及長(zhǎng)期神經(jīng)后遺癥的問(wèn)題引起了廣泛關(guān)注[12，42-43]。本研究中DHS 組及SHS 組小鼠在出艙時(shí)均有嚴(yán)重意識(shí)障礙，對(duì)外界刺激幾乎無(wú)反應(yīng)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)嚴(yán)重受損。臨床研究表明，急性肝損傷是HS 后最嚴(yán)重的并發(fā)癥，若發(fā)展為難治性肝衰竭并發(fā)多器官損傷，還需考慮肝移植治療[44]。本研究結(jié)果顯示，SHS 組小鼠的肝臟損傷較DHS組更重；DHS組小鼠部分肝細(xì)胞水腫，出現(xiàn)點(diǎn)狀壞死，其ALT、AST 與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示該程度熱打擊造成的肝損傷較輕；而SHS 組中沿肝小葉分布的肝細(xì)胞有明顯大片壞死及大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，病理?yè)p傷評(píng)分明顯高于DHS 組，肝功能指標(biāo)較對(duì)照組明顯升高，提示逐步升溫造成的小鼠肝損傷較高熱直接打擊更嚴(yán)重。本研究發(fā)現(xiàn)，在恢復(fù)24 h 后DHS 組小鼠CREA、BUN水平與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而SHS 組小鼠較對(duì)照組明顯增高，且BUN水平已達(dá)小鼠急性腎損傷的診斷標(biāo)準(zhǔn)[29]。病理檢查結(jié)果顯示，SHS 組造模后小鼠腎臟皮、髓交界處腎小管上皮細(xì)胞大量壞死，腎小管明顯擴(kuò)張，可見大量管型形成，腎小球毛細(xì)血管及腎間質(zhì)血管擴(kuò)張，腎髓質(zhì)內(nèi)可見大量血栓及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腎臟病理?yè)p傷評(píng)分明顯高于DHS組，提示逐步升溫造成的小鼠腎損傷更嚴(yán)重。腸道屏障損傷是引發(fā)CHS后SIRS的關(guān)鍵機(jī)制。高熱首先破壞腸黏膜屏障，導(dǎo)致腸內(nèi)各種細(xì)菌對(duì)腸細(xì)胞的損傷加重，細(xì)菌釋放的毒素又從破壞的腸黏膜屏障處入血，造成繼發(fā)性膿毒癥。本研究熱打擊后DHS組、SHS 組小鼠腸內(nèi)有不同程度的損傷，但DHS 組腸損傷評(píng)分明顯低于SHS 組。SHS 組小鼠腸段明顯水腫，不排便或排稀便，表明此時(shí)腸道炎癥反應(yīng)較強(qiáng)，腸黏膜受到過(guò)度刺激后全段充血水腫，甚至發(fā)生腸壞死，但DHS組小鼠腸道水腫不明顯。經(jīng)熱打擊后，DHS組及SHS組小鼠均出現(xiàn)肺損傷病理改變，但三組W/D差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明恢復(fù)24 h時(shí)HS小鼠未發(fā)生肺水腫。引發(fā)HS后急性肺損傷的原因既包含熱打擊直接損傷肺組織及細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能，也有繼發(fā)的內(nèi)毒素血癥及炎性因子風(fēng)暴對(duì)肺組織的間接損傷[45]。臨床研究顯示，CHS 后免疫系統(tǒng)受損嚴(yán)重，外周血免疫球蛋白水平明顯下降，常有繼發(fā)感染[46]，而脾臟作為促使B 細(xì)胞成熟的關(guān)鍵器官，對(duì)產(chǎn)生具有正常功能的抗體非常重要。本研究表明，SHS 組壞死淋巴細(xì)胞及易染體巨噬細(xì)胞比例明顯高于DHS組。因此盡早控制CHS后脾臟損傷，防止免疫細(xì)胞進(jìn)一步凋亡、壞死，對(duì)維持機(jī)體正常免疫功能至關(guān)重要。CHS小鼠在恢復(fù)24 h時(shí)全身多器官損傷較重，體內(nèi)炎癥反應(yīng)明顯失衡。本實(shí)驗(yàn)中DHS 組、SHS 組小鼠全身?yè)p傷指標(biāo)ALP、趨化因子MCP-1及細(xì)胞因子IL-6 水平較對(duì)照組均明顯上升，抗炎因子TGF-β 水平則明顯下降。有研究表明，IL-6 是判斷HS 患者臨床危重程度的指標(biāo)[47]，在HS 前低劑量使用外源性IL-6有利于保護(hù)腸黏膜屏障，可降低HS后的全身炎癥水平[48]。IL-1β作為早期促炎因子，在本實(shí)驗(yàn)中卻明顯低于正常值，似乎與常規(guī)認(rèn)為的HS后發(fā)生高炎癥反應(yīng)狀態(tài)并不相同。事實(shí)上，IL-1β在HS 發(fā)生時(shí)常呈現(xiàn)時(shí)相性變化趨勢(shì)，其水平在恢復(fù)1 h時(shí)即快速上升，3～5 h達(dá)到峰值，后續(xù)內(nèi)源性補(bǔ)充不足導(dǎo)致下降，到恢復(fù)24 h 時(shí)已降至正常水平[49-50]。Leon等[20]的研究也觀察到HS小鼠在恢復(fù)24 h后循環(huán)血漿內(nèi)的TNF-α 與IL-1β 無(wú)法檢測(cè)到或低于正常值，狒狒模型中也出現(xiàn)類似結(jié)果[7]。造成這種現(xiàn)象可能的機(jī)制是HS后骨骼肌(以及其他可能的實(shí)質(zhì)細(xì)胞)為應(yīng)對(duì)體溫過(guò)高早期產(chǎn)生急性應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致小鼠血漿中IL-6 及IL-10 在體溫升高階段就已明顯上升[51]。而這種應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞因子反應(yīng)可能具有抑制隨后局部或全身促炎癥信號(hào)的功能，因?yàn)镮L-6 的抗炎作用能抑制TNF-α、IL-1β 及刺激抗炎的IL-1ra、IL-10的產(chǎn)生[52-55]。TGF-β 檢測(cè)對(duì)HS 患者的預(yù)后判斷有重要價(jià)值，TGF-β 越低，預(yù)后越差[56]。SHS 組小鼠LDH、CK-MB、MCP-1 水平均明顯高于DHS 組，TGF-β 水平明顯低于DHS 組，表明采用逐步升溫法造模的CHS 小鼠較直接熱打擊法全身?yè)p傷更嚴(yán)重，全身炎癥水平更高。

本研究仍存在局限性：只選擇了恢復(fù)24 h 這一個(gè)時(shí)間點(diǎn)來(lái)評(píng)價(jià)HS對(duì)小鼠的損傷，尚不能掌握損傷的時(shí)程規(guī)律，且HS對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的損傷除需根據(jù)小鼠的精神及行為狀態(tài)初步判定外，還應(yīng)同時(shí)使用組織病理學(xué)檢查及動(dòng)物行為學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行判定。另外，SHS 組中達(dá)到造模條件但出艙后死亡的小鼠呼吸節(jié)律改變、咯血、窒息等肺損傷表現(xiàn)更嚴(yán)重，也具有研究?jī)r(jià)值。

綜上所述，無(wú)論是使用直接熱打擊法還是逐步升溫法，均能成功構(gòu)建CHS 小鼠模型。但使用逐步升溫法造模的小鼠更接近真實(shí)的CHS 發(fā)生環(huán)境，后續(xù)可造成多器官功能損傷（特別是肝臟和腎臟的急性損傷）及體內(nèi)炎癥反應(yīng)失衡的狀態(tài)，兩種造模方式結(jié)果的差異可能與小鼠體溫調(diào)節(jié)能力有關(guān)，但具體的作用機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。