王大永，裴劍，洪銘巖，徐翔*，高云鶴，鄭宇，王凱杰，崔建忠*

1唐山市工人醫(yī)院神經(jīng)介入科，河北唐山 063000；2唐山市工人醫(yī)院神經(jīng)外科，河北唐山 063000

Kv7.4 通道是一種鉀離子通道，參與調節(jié)VTA 區(qū)DA能神經(jīng)元的興奮性，且在癲癇的治療中發(fā)揮重要作用[8]?？R西平(carbamazepine，CBZ)是一種抗癲癇藥物，研究顯示其能降低氯化鋰-匹羅卡品(lithiumpilocarpine，Li-Pc)誘發(fā)的癲癇發(fā)作頻率，減輕癲癇發(fā)作強度[9]。目前，有關CBZ對癲癇DA能神經(jīng)元影響的報道較少。本研究觀察CBZ對癲癇大鼠VTA區(qū)DA 能神經(jīng)元Kv7.4 通道的影響，旨在為癲癇發(fā)病機制和治療的相關研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 8 周齡SPF 級雄性Wistar 大鼠50 只，體重250 g 左右，購自湖北省實驗動物研究中心[實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(鄂)2015-0018]。大鼠飼養(yǎng)于唐山怡安生物工程有限公司實驗動物研究中心[實驗動物使用許可證號：SYXK(冀)2020-014]。飼養(yǎng)環(huán)境干凈、安靜，溫度18～25 ℃，濕度50%～80%，

自由進食水。大鼠適應性飼養(yǎng)1 周后進行實驗。本研究方案經(jīng)唐山市工人醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準(批準號：TSS58684)，大鼠實驗遵循3R原則。

1.2 主要試劑及儀器 鹽酸氯化鋰(批號：20200321)、鹽酸匹羅卡品(批號：20200415)購自美國Sigma 公司；卡馬西平片(規(guī)格：100 mg/片；國藥準字：H37020785；批號：20201124)，丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量檢測試劑盒(批號：20200617)、還原型谷胱甘肽 (reduced glutathione，GSH)含量檢測試劑盒(批號：20200129)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性檢測試劑盒(批號：20200512)購自北京索萊寶科技有限公司；抗酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)抗體(批號：20201011)、抗GAPDH 抗體(批號：20201101)、IgG(Alexa Fluor? 488)抗體(批號：20201007)、抗Kv7.4 抗體(批號：20200314)購自英國Abcam公司；辣根過氧化物酶標記的二抗(批號：20201101)購自北京博爾西科技有限公司；BCA 蛋白濃度檢測試劑盒(批號：20201102)購自上海碧云天公司；蛋白電泳及電轉移裝置(型號：AU5800)購自北京市六一儀器廠；酶聯(lián)免疫分析儀(型號：EVO75)購自澳大利亞Techan 公司；超低溫冰箱(型號：MDF-U32V)購自美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 實驗動物分組與癲癇大鼠模型構建[10]將50只雄性Wistar大鼠隨機分為5組：對照組、癲癇組和低、中、高濃度CBZ 組，每組10 只。癲癇組和低、中、高濃度CBZ組大鼠先用氯化鋰-匹羅卡品誘發(fā)癲癇構建癲癇大鼠模型：腹腔注射氯化鋰(127 mg/kg)，20 h后背部皮下注射匹羅卡品(20 mg/kg)。注射匹羅卡品后連續(xù)2 h觀察各組大鼠癲癇發(fā)作情況，并記錄癲癇發(fā)作等級、潛伏期、死亡等情況。按照Racine(1972 年)評級標準對癲癇發(fā)作情況進行分級：0 級，無發(fā)作；1級，口、鼻、面肌陣攣；2級，節(jié)律性點頭或濕狗樣抖動；3 級，全身震顫、前肢局限性陣攣；4級，前肢陣孿伴豎立；5級，全身強直陣攣發(fā)作伴摔倒。3級及以上定為癲癇發(fā)作。癲癇持續(xù)狀態(tài)后1 h，注射地西泮10 mg/kg 終止癲癇持續(xù)狀態(tài)。給藥：低、中、高濃度CBZ 組在給予氯化鋰、匹羅卡品前30 min，分別通過灌胃給予10、30、50 mg/kg CBZ；對照組、癲癇組灌胃給予等量生理鹽水；觀察各組大鼠一般行為學。次日后在同一時間點，低、中、高濃度CBZ 組通過灌胃分別給予10、30、50 mg/kg CBZ，對照組和癲癇組灌胃給予等量生理鹽水，每天1次，連續(xù)7 d。

1.3.2 檢測各組大鼠血液中CBZ濃度 給藥結束4 h后經(jīng)靜脈取血，離心后使用熒光偏振免疫分析法測定各組大鼠血液中CBZ的濃度，即峰濃度。

1.3.3 檢測各組大鼠VTA區(qū)MDA、GSH含量及SOD活性 末次給藥后，每組隨機選取5 只大鼠，麻醉后根據(jù)大鼠腦立體定位圖取VTA 區(qū)組織，取一部分組織進行研磨，加入生理鹽水配制比例為10%的組織勻漿備用，另一部分組織提取組織蛋白備用。分別根據(jù)MDA、GSH、SOD檢測試劑盒說明書進行操作，檢測VTA 區(qū)組織中MDA、GSH 含量和SOD活性。

1.3.4 免疫熒光及激光共聚焦觀察各組大鼠VTA 區(qū)TH、Kv7.4 蛋白的表達 末次給藥后，每組隨機選取5 只大鼠，麻醉后用4%多聚甲醛溶液灌注固定，取腦組織放入4%多聚甲醛溶液固定2 h，移入30%蔗糖溶液，組織塊沉底后，行冠狀位連續(xù)冰凍切片，厚40 μm。選取VTA區(qū)切片行免疫熒光檢測，加TH抗體(1∶100)、Kv7.4 抗體(1∶100)，4 ℃孵育48 h，加熒光二抗(TH：1∶500，Alexa Fluor? 488 標記；Kv7.4：1∶1000，F(xiàn)ITC 標記)，室溫孵育2 h，漂洗后用熒光封片劑封片，在熒光顯微鏡下觀察。TH是一種表達于DA 能神經(jīng)元的DA 合成限速酶，隨著DA 能神經(jīng)元的丟失，TH含量會同時減少，因此，以TH含量作為反映DA能神經(jīng)元數(shù)量的指標。

8月8日，產(chǎn)品試生產(chǎn)成功后，河南客戶在云天化股份國內(nèi)營銷中心陪同下到天安化工生產(chǎn)現(xiàn)場實地查看含聚谷氨酸磷酸二銨產(chǎn)品。經(jīng)客戶確認，云天化股份含聚谷氨酸磷酸二銨產(chǎn)品外觀質量滿足銷售要求，該產(chǎn)品首批1.5萬噸目前已正式投入生產(chǎn)并于近期投放市場。

1.3.5 Western blotting 檢測各組大鼠VTA 區(qū)TH、Kv7.4蛋白的表達水平 提取大鼠剩余部分VTA區(qū)組織總蛋白，用BCA 法檢測蛋白濃度后，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜，加一抗(抗TH、Kv7.4 抗體，1∶1500)4 ℃孵育過夜；次日，洗膜加二抗(1∶5000)室溫孵育2 h，TBST 洗膜后，加ECL 發(fā)光液，在凝膠成像系統(tǒng)中拍照，并進行灰度值分析，以GAPDH蛋白為內(nèi)參。目的蛋白相對表達水平=目的蛋白灰度值/GAPDH蛋白灰度值。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料符合正態(tài)分布，以xˉ±s表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。計數(shù)資料以例(%)表示，組間比較采用χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠血藥濃度檢測結果 對照組和癲癇組由于未進行CBZ 給藥，故不進行血藥濃度檢測。低濃度CBZ組大鼠的血液CBZ濃度為(4.61±0.82) μg/ml，中濃度CBZ組大鼠的血液CBZ濃度為(8.75±1.46) μg/ml，高濃度CBZ組大鼠的血液CBZ濃度為(10.42±2.38) μg/ml。各濃度CBZ組血液CBZ濃度差異明顯(P＜0.05)。

2.2 各組大鼠一般行為學觀察 對照組大鼠行為學表現(xiàn)無異常；匹羅卡品注射后癲癇組大鼠出現(xiàn)抽搐、咀嚼、流涎等癥狀，低、中、高濃度CBZ 組大鼠上述癥狀均有所緩解。與癲癇組大鼠比較，低、中、高濃度CBZ 組大鼠癲癇發(fā)作潛伏期均明顯延長(P＜0.05)，中、高濃度CBZ組大鼠癲癇發(fā)作率均明顯降低(P＜0.05，表1)。

表1 各組大鼠一般行為學觀察結果(n=10)Tab.1 General behavioral observation results of rats in each group (n=10)

2.3 各組大鼠VTA 區(qū)MDA、GSH 含量及SOD 活性比較 與對照組比較，癲癇組大鼠VTA區(qū)MDA含量明顯升高(P＜0.05)，GSH 含量及SOD 活性明顯降低(P＜0.05)；與癲癇組大鼠比較，低、中、高濃度CBZ組大鼠MDA 含量依次降低(P＜0.05)，GSH 含量及SOD活性均明顯升高(P＜0.05，表2)。

表2 各組大鼠VTA區(qū)MDA、GSH含量及SOD活性比較(xˉ±s, n=10)Tab.2 Comparison of MDA, GSH content and SOD activity in VTA area of rats in each group (xˉ±s, n=10)

2.4 各組大鼠VTA區(qū)TH、Kv7.4免疫熒光及激光共聚焦觀察結果 與對照組比較，癲癇組大鼠VTA 區(qū)DA 能神經(jīng)元數(shù)明顯減少(P＜0.05)；與癲癇組比較，低、中、高濃度組大鼠VTA 區(qū)DA 能神經(jīng)元數(shù)均明顯增多(P＜0.05，圖1)。

圖1 各組大鼠VTA區(qū)TH、Kv7.4免疫熒光及激光共聚焦觀察結果比較Fig.1 Comparison of the level of TH and Kv7.4 in VTA area of rats in each group (immunofluorescence and laser confocal)

2.5 各組大鼠VTA 區(qū)TH、Kv7.4 蛋白表達水平比較 與對照組比較，癲癇組大鼠VTA 區(qū)TH、Kv7.4蛋白表達水平均明顯降低(P＜0.05)；與癲癇組大鼠相比，低、中、高濃度組大鼠VTA 區(qū)TH、Kv7.4 蛋白表達水平依次增高(P＜0.05，圖2)。

圖2 各組大鼠VTA區(qū)TH、Kv7.4蛋白表達水平比較Fig.2 Comparison results of TH and Kv7.4 protein expression in VTA area of rats in each group

3 討 論

癲癇是常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，發(fā)作時出現(xiàn)肌陣攣、失神、強直、全面強直-陣攣等癥狀[11]。本研究采用Li-Pc 誘發(fā)大鼠癲癇模型，模型大鼠出現(xiàn)抽搐、咀嚼、流涎等癥狀，與人類癲癇發(fā)作有相似的臨床病理特征，且與Huang 等[12]的報道一致，提示癲癇大鼠模型構建成功。本研究結果顯示，CBZ 干預治療后大鼠癲癇發(fā)作癥狀有所緩解，發(fā)作潛伏期依次延長，癲癇發(fā)作率、癲癇發(fā)作分級依次降低，提示CBZ 可延長癲癇發(fā)作潛伏期，有效緩解癲癇發(fā)作癥狀，與CBZ 在抗癲癇臨床治療中的作用一致[13-14]，但其具體作用機制尚未完全明了。

癲癇發(fā)作使神經(jīng)元異常放電，導致腦內(nèi)氧化與抗氧化作用紊亂[15-16]。MDA 是脂質過氧化反應的產(chǎn)物，可作為過氧化指標，而SOD、GSH 可作為抗氧化指標。本研究結果顯示，與對照組比較，癲癇組大鼠VTA 區(qū)MDA 含量顯著升高，GSH 含量及SOD活性顯著降低，提示腦內(nèi)氧化應激活性變化與癲癇發(fā)作密切相關。癲癇發(fā)作時，腦內(nèi)過氧化反應增強，抗氧化能力減弱，導致MDA大量產(chǎn)生，對神經(jīng)元結構和功能造成損傷[17-18]。本研究還顯示，不同濃度CBZ干預組大鼠VTA區(qū)MDA含量依次降低，GSH含量及SOD 活性依次升高，與王麗[19]的研究結果一致，提示CBZ可抑制癲癇大鼠腦內(nèi)的氧化應激反應，但其對神經(jīng)元的作用尚需進一步研究。

有研究顯示，癲癇發(fā)作時腦部神經(jīng)元興奮性異常增強，可引發(fā)過度放電，導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常[20]。TH 是DA 能神經(jīng)元的標記物，可反映DA能神經(jīng)元的功能狀態(tài)和活動能力。DA能神經(jīng)元功能障礙與癲癇發(fā)作關系密切。因此，增強DA能神經(jīng)元功能有助于緩解癲癇。本研究結果顯示，癲癇組大鼠VTA區(qū)TH蛋白表達水平顯著降低，DA能神經(jīng)元數(shù)顯著減少，與Tripathi和Bozzi[21]的報道一致，提示癲癇大鼠腦內(nèi)DA能神經(jīng)元功能活性降低。不同濃度CBZ 干預組大鼠VTA 區(qū)TH 蛋白表達均顯著升高、DA能神經(jīng)元數(shù)依次增多，提示CBZ可調控癲癇大鼠腦內(nèi)VTA 區(qū)TH 蛋白表達，增強DA 能神經(jīng)元活性。有研究顯示，氧化應激與DA能神經(jīng)元系統(tǒng)功能密切相關，癲癇發(fā)作時氧化應激增強，抗氧化能力減弱，導致DA 能神經(jīng)元功能下降[22]；推測CBZ 可能通過抑制癲癇大鼠腦內(nèi)氧化應激反應而增強DA能神經(jīng)元的功能活性。

離子通道在神經(jīng)元調節(jié)中發(fā)揮重要作用。Kv7.4通路屬于Kv7/KCNQ 家族，是重要的K+通道，參與調節(jié)VTA 區(qū)DA 能神經(jīng)元的興奮性。Kv7.4 通路開放時，神經(jīng)元興奮性被抑制。研究顯示，Kv7.4與癲癇等神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病密切相關[23]。Li 等[24]報道，Kv7.4 通道下調是VTA 區(qū)DA 能神經(jīng)元興奮性改變的原因。本研究結果顯示，與對照組比較，癲癇組大鼠VTA區(qū)Kv7.4蛋白表達水平顯著降低，提示癲癇發(fā)作引起VTA區(qū)DA能神經(jīng)元功能活性降低(TH陽性神經(jīng)元數(shù)減少)與Kv7.4 蛋白表達水平改變有關。與癲癇組比較，低、中、高濃度CBZ組大鼠VTA區(qū)Kv7.4蛋白表達依次升高，提示CBZ可調節(jié)Kv7.4蛋白表達水平；推測CBZ可激活Kv7.4通路，促進TH蛋白表達，增強癲癇大鼠VTA 區(qū)DA 能神經(jīng)元功能活性，對癲癇發(fā)作癥狀有緩解作用。

綜上所述，CBZ可能通過激活癲癇大鼠Kv7.4通路，促進TH蛋白表達，增強癲癇大鼠VTA區(qū)DA能神經(jīng)元活性，減輕癲癇大鼠腦內(nèi)氧化應激反應，緩解癲癇發(fā)作癥狀。上述結果為臨床癲癇治療提供了一定參考。但本研究也存在一定的不足，如未對癲癇潛伏期與急性發(fā)作期大鼠機體氧化應激水平進行比較，且CBZ對Kv7.4通路的具體作用機制還有待后續(xù)使用通路激活劑或抑制劑處理來進一步研究。另外，本研究未進行肝功能及血常規(guī)檢測，可能忽視了CBZ臨床應用的安全性，需要進一步深入研究。