何睿，陳曉華，何峰，馬原軍，吳凡，段宇辰，苗輝，于世賓*，逄鍵梁*

1安徽醫(yī)科大學空軍臨床學院/安徽醫(yī)科大學第五臨床醫(yī)學院/空軍特色醫(yī)學中心口腔科，北京 100142；2空軍軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院解剖生理學教研室/軍事口腔醫(yī)學國家重點實驗室/口腔疾病國家臨床醫(yī)學研究中心/陜西省口腔疾病國際聯(lián)合研究中心，陜西西安 710032

顳下頜關節(jié)紊亂病(temporomandibular disorders，TMD)是指累及顳下頜關節(jié)(temporomandibular join，TMJ)和(或)咀嚼肌的一類口腔疾病，其患病率高達20%～40%，主要臨床表現(xiàn)為頜面部疼痛、關節(jié)雜音和下頜運動受限，嚴重影響患者的生活質(zhì)量。顳下頜關節(jié)骨關節(jié)炎(temporomandibular joint osteoarthritis，TMJOA)是TMD 的重癥表現(xiàn)形式，其主要病理表現(xiàn)為軟骨基質(zhì)降解、軟骨細胞死亡及軟骨下骨異常改建。據(jù)統(tǒng)計，約14.56%的TMD 患者具有TMJOA 的影像學表現(xiàn)[1]。由于髁突軟骨細胞數(shù)量有限，缺乏血管供應，軟骨再生能力相對較差，因而針對TMJOA 的治療手段有限[2]。 間充質(zhì)干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是具有自我更新和多向分化能力的多潛能前體細胞，臨床研究發(fā)現(xiàn)其具有促進關節(jié)軟骨再生、緩解癥狀和疼痛控制等作用，近年來已逐步應用于TMJOA 的治療[3-6]。人脫落乳牙牙髓間充質(zhì)干細胞(stem cells from human exfoliated deciduous teeth，SHED)是存在于牙髓血管周圍、能夠自我更新的一類MSCs。與其他MSCs相比，SHED具有倫理爭議少、容易獲得、微創(chuàng)收集以及容易保留高干細胞潛能等優(yōu)點[7]。大量研究發(fā)現(xiàn)，SHED可誘導骨和軟骨形成，具有修復關節(jié)軟骨、抑制炎癥反應等生物學潛能，有著良好的轉(zhuǎn)化應用前景[8-11]。本研究擬初步探討SHED 對TMJOA 動物模型中髁突軟骨退變轉(zhuǎn)歸的影響，以期為今后TMJOA的臨床治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器 腫瘤壞死因子-α(TNF-α)抗體(AF7014)，含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(cleaved-caspase 3， cleaved-CASP3) 抗 體(AF7022)，β-tubulin抗體(AF7011)(美國Affinity公司)；青鏈霉素雙抗溶液，DMEM 高糖培養(yǎng)基，α-MEM 培養(yǎng)基(美國Hyclone 公司)；Tripure 分離試劑(美國Roche 公司)；Ⅰ型、Ⅱ型膠原酶(美國Worthington公司)；碘乙酸鈉(德國Sigma-Aldrich 公司)；一步法TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒(上海碧云天公司)；DM2500生物顯微鏡(德國Leica 公司)；Chemi-Doc? XRS+WB 發(fā)光成像儀(美國Bio-Rad 公司)；核酸蛋白測定儀和酶標儀(德國Eppendorf公司)；聚焦激光掃描顯微鏡(美國Olympus公司)。

1.2 SHED的提取、培養(yǎng)和傳代 SHED為空軍軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院預防科軒昆教授團隊贈予，提取和鑒定過程見文獻[12]。脫落乳牙用PBS反復多次沖洗干凈，取出牙髓組織剪碎；加入Ⅰ型膠原酶，在37 ℃孵箱內(nèi)消化40 min～1 h，每隔5～10 min搖勻一次；經(jīng)過消化的細胞懸液800 r/min離心5 min，棄上清，加入2 ml 含10%胎牛血清和100 U/ml 青霉素、鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)液；將4×106/ml的細胞接種于75 ml培養(yǎng)瓶內(nèi)，置于37 ℃、5% CO2恒溫敷箱培養(yǎng)7～10 d，此代細胞標記為P0代。待細胞生長融合至80%左右時按照1∶3 傳代，傳至P6代細胞作為后續(xù)實驗所用細胞。

1.3 動物分組及模型建立 60只8周齡雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，體重250～280 g，購自空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心。將大鼠隨機分為對照組、碘乙酸鈉(MIA)誘導TMJOA 模型組(MIA 組)和SHED 治療TMJOA 組(SHED 組)，每組20 只。1%戊巴比妥鈉腹腔注射深度麻醉大鼠，刮除大鼠TMJ 區(qū)域的毛發(fā)，碘伏消毒。MIA 組和SHED 組大鼠使用微量注射器在兩側(cè)TMJ 上腔內(nèi)注入50 μl 4 mg/kg 的MIA 建立TMJOA 模型，對照組則以同樣方法注射等體積的PBS。SHED組在造模后7 d注射50 μl 4×106/ml SHED細胞懸液，對照組和MIA 組注射等體積的PBS。各組大鼠分別于注射SHED 懸液或PBS 后2、4 周每組各處死10只并取材，左側(cè)TMJ用于形態(tài)學檢測，右側(cè)TMJ髁突軟骨用于分子生物學檢測。

1.4 HE 染色 大鼠左側(cè)TMJ 固定、脫礦后，常規(guī)石蠟包埋切片，HE 染色，顯微鏡下觀察并采集圖像，Photoshop軟件測量軟骨纖維層厚度。

1.5 番紅O-固綠染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，進行番紅O-固綠染色：1%固綠染色1 min，1%醋酸乙醇分化30 s，待切片自然干燥后，1%番紅O 染色5 min，95%乙醇漂洗15 s。顯微鏡下觀察并采集圖像，每個樣本隨機選取3 個視野，用Photoshop 軟件計算番紅O 陽性面積百分比，觀察髁突軟骨基質(zhì)中蛋白多糖的表達變化。

1.6 免疫組化染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，按照試劑盒說明書中描述的SP法進行軟骨基質(zhì)主要成分Ⅱ型膠原的免疫組化染色(抗體濃度1∶200)。采集圖像后，在軟骨區(qū)域隨機選取3 個視野，計算髁突軟骨中Ⅱ型膠原陽性面積百分比。

1.7 TUNEL 染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，按照TUNEL試劑盒說明書操作。蛋白K工作液室溫下孵育20 min，PBS 洗3 次；TUNEL 反應液37 ℃下避光孵育90 min，PBS 洗3 次；滴加含DAPI 的抗熒光淬滅封片劑進行封片，4 ℃避光保存。聚焦激光掃描顯微鏡采集圖像，在軟骨區(qū)域隨機選取3 個視野，計算TUNEL陽性細胞率。

1.8 Western blotting 檢測 取右側(cè)髁突軟骨，冷凍搗碎后使用Tripure 裂解液裂解并提取總蛋白，采用BCA 法進行蛋白定量。聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，半干電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)膜后封閉1 h，加入一抗(TNF-α抗體1∶500，cleaved-CASP3抗體1∶1000)，4 ℃孵育過夜。次日加入辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG室溫孵育1 h，加入化學發(fā)光液曝光顯影。采集圖像后采用Image Lab 5.2.1軟件進行分析。

1.9 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 21.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料均滿足正態(tài)分布和方差齊性，以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用Tukey檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 SHED 治療對MIA 誘導所致TMJ 髁突軟骨退變的影響

2.1.1 HE染色結(jié)果 2、4周時，對照組TMJ髁突軟骨各層(纖維層、增殖層、前肥大層、肥大層)排列規(guī)則，層次清晰，肥大層占軟骨總厚度的50%左右。MIA 組四層軟骨嚴重不連續(xù)，層次紊亂，部分肥大層中斷，軟骨中出現(xiàn)大量無細胞區(qū)，基質(zhì)網(wǎng)絡紊亂，且髁突軟骨纖維層較對照組和SHED 組明顯增厚，改良Mankin組織學評分明顯高于對照組和SHED組，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.001)。SHED組髁突軟骨盡管仍然存在軟骨各層細胞界限不明及少量無細胞區(qū)，但形態(tài)基本恢復正常，其纖維層厚度、改良Mankin組織學評分與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(圖1)。

圖1 各組大鼠TMJ髁突軟骨HE染色結(jié)果Fig.1 HE staining results of condylar cartilage in each group of rat

2.1.2 番紅O-固綠染色結(jié)果 TMJ 髁突番紅O-固綠染色顯示，2、4 周時，對照組番紅O 染色陽性的蛋白多糖均勻、規(guī)則地分布于軟骨肥大層及前肥大層，少量分布于增殖層，且與固綠著色的纖維層、增殖層及軟骨下骨分界清晰；MIA 組髁突軟骨中番紅O著色、分布不均勻，不規(guī)則排列的軟骨細胞染色嚴重缺失，周邊染色增強，且番紅O 染色陽性面積百分比明顯低于對照組(P＜0.001)；SHED組番紅O染色基本恢復正常，2周時番紅O染色陽性面積百分比與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，圖2)。

圖2 大鼠髁突軟骨番紅O-固綠染色結(jié)果Fig.2 Safranin O-fast green staining results of rat condylar cartilage

2.1.3 Ⅱ型膠原免疫組化染色結(jié)果 免疫組化染色顯示，2、4 周時，對照組Ⅱ型膠原陽性細胞染色均勻、規(guī)則，主要分布于肥大層及前肥大層；MIA 組Ⅱ型膠原著色、分布不均勻，且Ⅱ型膠原陽性面積百分比明顯低于對照組(P＜0.01)；SHED 組的Ⅱ型膠原著色基本恢復正常，Ⅱ型膠原陽性面積百分比明顯高于MIA組(P＜0.01)，而4周時與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，圖3)。

圖3 大鼠髁突軟骨Ⅱ型膠原免疫組化染色結(jié)果(SP法)Fig.3 Immunohistochemical staining results of collagen Ⅱ in rat condylar cartilage (SP)

2.2 SHED 治療對MIA 誘導所致TMJ 髁突軟骨細胞凋亡的影響 TUNEL染色結(jié)果顯示，2、4周時，對照組中幾乎未見TUNEL陽性的死亡細胞；MIA組髁突軟骨中TUNEL陽性細胞大量出現(xiàn)在增殖層和肥大層，其陽性細胞率明顯高于對照組(P＜0.001)；SHED組髁突軟骨中TUNEL陽性細胞率與MIA組比較明顯降低(P＜0.001)，與對照組比較差異也有統(tǒng)計學意義(2周時P＜0.01，4周時P＜0.001，圖4)。

圖4 大鼠髁突軟骨TUNEL染色結(jié)果Fig.4 TUNEL staining results in rat condylar cartilage

2.3 SHED 治療對TMJOA 軟骨中cleaved-CASP3 和TNF-α 水平的影響 Western blotting 檢測結(jié)果顯示，2、4 周時，與對照組比較，MIA 組TMJ 髁突軟骨中cleaved-CASP3和TNF-α蛋白表達量明顯上調(diào)(P＜0.001)；而經(jīng)SHED 治療后，SHED 組TMJ 髁突軟骨中的TNF-α 和cleaved-CASP3 蛋白表達量較MIA 組明顯下降(P＜0.001)，而2 周時TNF-α 蛋白表達量與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05，圖5)。

圖5 各組大鼠髁突軟骨中cleaved-CASP3、TNF-α蛋白的表達變化(n=3)Fig.5 Changes of protein expression of cleaved-CASP3 and TNF-α in rat condylar cartilage (n=3)

3 討 論

TMJOA是口腔領域第4大疾病TMD的重癥表現(xiàn)形式，其致病機制截至目前尚不完全清楚，構(gòu)建TMJOA動物模型是探索其機制的關鍵環(huán)節(jié)之一。當前誘導TMJOA的動物模型不少，主要分為化學藥物誘導、機械應激刺激、外科手術(shù)誘導和心理應激誘導等4 類[13]。TMJ 關節(jié)腔內(nèi)注射MIA 誘導骨關節(jié)炎樣病變已被廣泛用于誘發(fā)TMJOA[14]。MIA 主要通過抑制3-磷酸甘油醛脫氫酶的活性，使軟骨細胞發(fā)生凋亡，進而誘導軟骨退變。MIA 可在TMJ 中引起典型的OA樣病變，軟骨破壞呈時間依賴性，早期軟骨細胞發(fā)生凋亡，后期為軟骨基質(zhì)紊亂，軟骨下骨質(zhì)侵蝕、纖維化，軟骨下骨硬化，晚期則是骨贅形成[15]。MIA 腔內(nèi)注射可建立一種技術(shù)可靠、病變明顯、操作簡便的TMJOA 大鼠模型，為TMJOA 的相關研究提供參考。本研究MIA 造模后TMJ 髁突軟骨層次紊亂，局部軟骨基質(zhì)丟失，并出現(xiàn)大量無細胞區(qū)，改良Mankin 組織學評分也明顯增高，提示TMJ上腔內(nèi)注射MIA成功誘導了TMJOA樣變，該模型有效、可靠。

近年來，干細胞療法的開發(fā)和建立為有效治療TMJOA 提供了新的希望。SHED 是一種具有高度增殖能力的克隆形成細胞群，具有明顯的多向分化潛能[16]。與骨髓等其他來源的間充質(zhì)干細胞相比，SHED 具有與顱面組織相同的胚胎學來源和相似的基因表達模式，與顱面組織具有更高的親和力。與牙髓間充質(zhì)干細胞相比，SHED 具有更高的增殖活性和成骨分化潛能[10]。2019年Luo等[17]采用SHED的外泌體(SHED-Exos)或SHED 細胞上清(SHED-CM)預處理軟骨細胞，然后用10 ng/ml 白細胞介素(IL)-1β刺激，提取細胞裂解物后進行檢測分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SHED-Exos可通過miR-100-5p抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)，進而抑制IL-6、IL-8、基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP-1)、MMP-3、MMP-9、MMP-13 及血小板反應蛋白解整合素金屬肽酶5(ADAMTS5)等促炎降解因子的表達。但該研究僅涉及體外實驗，缺乏體內(nèi)實驗的驗證。2020年Ogasawara等[18]經(jīng)尾靜脈注射SHED 無血清條件培養(yǎng)液(SHED-CM)治療強迫張口誘導的TMJOA 模型小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SHED-CM 可通過下調(diào)IL-1β、誘導型一氧化氮合酶(iNOS)和MMP-13等促炎降解因子，特異性增加PCNA抗原陽性細胞數(shù)量，并改善TMJOA髁突軟骨的完整性和表面光滑度，從而促進TMJ 的再生修復。尾靜脈注射一方面不易將發(fā)揮作用的起效細胞/因子精準靶向于目標位點，另一方面靜脈注射外源性干細胞或相關物質(zhì)對全身的影響未知，而局部注射較傳統(tǒng)的全身靜脈注射的藥物劑量更低，引起的全身和局部不良反應更少，因此，關節(jié)腔內(nèi)局部注射的針對性更強，不良反應更少。本研究發(fā)現(xiàn)，MIA 造模后TMJ 髁突軟骨層次嚴重紊亂，部分肥大層中斷，局部軟骨基質(zhì)(蛋白多糖、Ⅱ型膠原)大量丟失；SHED 治療后TMJ 髁突軟骨形態(tài)趨于正常，軟骨基質(zhì)丟失得到明顯逆轉(zhuǎn)。因此，SHED 治療可明顯減少髁突軟骨細胞外基質(zhì)的降解，基本恢復軟骨的形態(tài)。

軟骨細胞是髁突軟骨中唯一的細胞類型，軟骨細胞凋亡是MIA 所致OA 早期軟骨的重要病理表現(xiàn)[19-20]。本研究TUNEL 染色顯示，MIA 組髁突軟骨中TUNEL陽性細胞數(shù)目明顯增多，細胞凋亡關鍵蛋白cleaved-CASP3 的表達水平也明顯升高，而SHED治療后髁突軟骨中TUNEL 陽性細胞數(shù)目減少，cleaved-CASP3 表達水平明顯降低，提示SHED 細胞懸液可有效抑制MIA 所致的髁突軟骨細胞凋亡。此外，TNF-α 是髁突軟骨退變過程中的關鍵炎性因子之一[21-22]，已被證實可抑制軟骨細胞中蛋白多糖、連接蛋白和Ⅱ型膠原的合成[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，MIA組髁突軟骨中TNF-α 蛋白表達水平明顯升高，而在SHED治療后即明顯降低，提示SHED細胞懸液可明顯抑制髁突退變軟骨中TNF-α等炎性因子的表達。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)，TMJ 腔內(nèi)局部注射SHED細胞懸液可減少軟骨細胞外基質(zhì)的降解、抑制軟骨細胞早期凋亡、下調(diào)退變軟骨中TNF-α 等炎性因子的表達，最終有效逆轉(zhuǎn)TMJOA進程中髁突軟骨的退變，為臨床治療TMJOA提供了一種新策略。但本研究仍存在一定的局限性：TUNEL染色時未行大鼠軟骨細胞標志物的共染色，未能進一步對比說明；只檢測了髁突軟骨中cleaved caspase 3 的表達水平，而未檢測總caspase 3 的表達水平；未檢測關節(jié)液中TNF-α 的表達水平。因此，SHED 細胞懸液治療TMJOA的具體作用機制仍需進一步研究。