潘烽平 張明明 陳一鵬

據(jù)統(tǒng)計(jì)，結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）發(fā)病率和致死率分別居第3 位和第2 位，是全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一[1]。預(yù)計(jì)2040 年全球?qū)⑿略?00 多萬(wàn)例新CRC 患者[2-4]。目前治療CRC 的標(biāo)準(zhǔn)仍是手術(shù)切除，但約1/3 的患者術(shù)后存在遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和抗腫瘤藥物耐藥的問(wèn)題[3]。因此，積極探索CRC 發(fā)生和發(fā)展機(jī)制是當(dāng)前迫切需要解決的難題。研究表明，多聚胞嘧啶結(jié)合蛋白（polycytidine-binding protein，PCBP）可以特異性結(jié)合RNA 多聚胞嘧啶區(qū)域[4]。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，PCBP 可分為兩類(lèi)：第一類(lèi)是核內(nèi)不均一核糖核蛋白，包括核內(nèi)不均一核糖核蛋白K/J；第二類(lèi)為α-復(fù)合物蛋白，包括4 種亞型，即PCBP1～4[5]。PCBP 家族具有一個(gè)重要特征，其包含3 個(gè)hnRNP K 同源（KH）結(jié)構(gòu)域，即約70 個(gè)氨基酸組成的RNA 結(jié)合模塊。其中PCBP1、PCBP2 具有高度的氨基酸序列相似性（89%），而PCBP3、PCBP4 氨基酸序列的差異較大，其中PCBP4氨基酸序列的差異最大[6]。PCBP 家族可通過(guò)多聚胞嘧啶結(jié)合能力來(lái)發(fā)揮多種功能[7-9]，包括mRNA 穩(wěn)定、翻譯沉默和翻譯增強(qiáng)等。PCBP4 可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其表達(dá)可通過(guò)延緩細(xì)胞周期進(jìn)展進(jìn)而抑制體內(nèi)外肺癌細(xì)胞的增殖[7]。最重要的是，PCBP 家族可通過(guò)與基因啟動(dòng)子上的特定元件結(jié)合，在真核細(xì)胞中起到信號(hào)依賴(lài)性和協(xié)調(diào)性的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用。另有文獻(xiàn)報(bào)道，μ 阿片受體啟動(dòng)子區(qū)可與PCBP3 結(jié)合，從而調(diào)控μ 阿片受體的轉(zhuǎn)錄[10-11]，這說(shuō)明PCBP3 具有RNA 結(jié)合蛋白的功能。那么PCBP3 是否參與CRC 的發(fā)生、發(fā)展，目前尚無(wú)相關(guān)報(bào)道。因此，本研究就PCBP3 過(guò)表達(dá)對(duì)CRC 細(xì)胞增殖和遷移的影響作一探討，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象 收集2022 年5 至6 月在嘉興市第一醫(yī)院行CRC 切除術(shù)患者的CRC 組織及癌旁正常組織標(biāo)本各10 份。所有患者術(shù)前均未接受過(guò)放化療且無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過(guò)（批準(zhǔn)文號(hào)：LS2021-KY-043），所有患者知情同意。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 人CRC 細(xì)胞系HCT116、HT29均購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司。（1）細(xì)胞培養(yǎng)：將HCT116、HT29 細(xì)胞置于含10% FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，加入青霉素100 U/mL、鏈霉素100 mg/mL，在37 ℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1～2 d，更換新鮮培養(yǎng)液；待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)至70%～80%時(shí)，加入乙二胺四乙酸（0.02%）和胰蛋白酶（0.25%）消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。（2）構(gòu)建含有PCBP3 CDS 區(qū)序列的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（PCBP3-pcDNA3.1，上海吉?jiǎng)P基因），分別轉(zhuǎn)染HCT116 和HT29 細(xì)胞（設(shè)為HCT116 過(guò)表達(dá)組、HT29 過(guò)表達(dá)組），放至培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，均經(jīng)qRTPCR、Western blot 法驗(yàn)證轉(zhuǎn)染成功，繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)；而未經(jīng)轉(zhuǎn)染的HCT116 和HT29 細(xì)胞分別設(shè)為HCT116 對(duì)照組、HT29 對(duì)照組。

1.3 mRNA 表達(dá)水平檢測(cè) 采用qRT-PCR 法。分別取CRC 組織標(biāo)本、癌旁正常組織標(biāo)本，加入Trizol 試劑（批號(hào)：15596018，Thermo Fisher 公司）抽提總RNA。經(jīng)定量分析后，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將1 mg RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA；取1 μL cNDA 在ABI 7500 qRT-PCR 儀上進(jìn)行PCR，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為 內(nèi) 參 進(jìn) 行 校正。所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，取平均值。引物序列如下：GAPDH 正 義：5'-GCGGGGCTCTCCAGAACATC-3'，反義：5'-TCCACCACTGACACGTTGGC-3'；PCBP3 正 義：5'-AGCCAGTGTGGGTCCCTGAT-3'，反 義：5'-TGGGGACTCCAGCATGACCA-3'。采用2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因mRNA 表達(dá)水平。

1.4 蛋白表達(dá)水平檢測(cè) 采用Western blot法。分別取CRC 組織標(biāo)本、癌旁正常組織標(biāo)本、HCT116 細(xì)胞、HT29細(xì)胞，加入RIPA 裂解液（批號(hào)：WB0101，上海威奧生物科技有限公司），采用BCA 法測(cè)定蛋白濃度。加入10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜。使用5%脫脂牛奶在室溫下孵育2 h，再加入對(duì)應(yīng)的一抗PCBP3 抗體（批號(hào)：ab154252，英國(guó)Abcam 公司）1∶500、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）（批號(hào)：ab231303，英國(guó)Abcam公司）1∶500、裂解的胱天蛋白酶3（cleaved cysteine aspartic acid specific protease-3，Cleaved Caspase-3）（批號(hào)：#9661，美 國(guó)CST 公 司）1∶500、GAPDH（批 號(hào)：ab8245，英國(guó)Abcam 公司）1∶1 000，4 ℃孵育過(guò)夜；加入適當(dāng)?shù)睦备^(guò)氧化物酶結(jié)合的抗兔或抗小鼠二抗（批號(hào)：ab6728 或ab6721，英國(guó)Abcam 公司）1∶20 000 孵育1 h 后，檢測(cè)結(jié)合的一級(jí)抗體。使用Thermo Scientific增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光儀檢測(cè)蛋白條帶灰度值，以目的蛋白灰度值與GAPDH 灰度值的比值作為目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 細(xì)胞增殖能力檢測(cè) 采用CCK-8法。取HCT116、HT29 細(xì)胞，按照4×107個(gè)/L 的密度分別接種至96 孔板，100 μL/孔。每隔24 h 分別加入CCK-8 試劑10 μL，于0、24、48、72 h 用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 處的吸光度（optical density，OD）值。

1.6 細(xì)胞侵襲能力檢測(cè) 采用Transwell 實(shí)驗(yàn)。將HCT116、HT29 細(xì)胞分別稀釋成1×109個(gè)/L 的細(xì)胞懸液；取100 μL 置于上室，300 μL 置于下室。待細(xì)胞培養(yǎng)72 h 后加入4%甲醛溶液固定10 min，吉姆薩染色，在Leica DMi8 S 顯微鏡下計(jì)數(shù)并拍照。通過(guò)計(jì)算兩組細(xì)胞數(shù)量來(lái)估算細(xì)胞侵襲能力。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CRC 組織與癌旁正常組織中PCBP3 mRNA 及蛋白表達(dá)水平比較 CRC 組織和癌旁正常組織中均有PCBP3 表達(dá)，其中CRC 組織中PCBP3 mRNA 及蛋白表達(dá)水平均明顯低于癌旁正常組織（均P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 CRC 組織與癌旁正常組織中PCBP3 mRNA 及蛋白表達(dá)水平比較（A：mRNA 表達(dá)水平比較，a P＜0.05；B：PCBP3 蛋白表達(dá)的電泳圖；C：蛋白表達(dá)水平比較，a P＜0.05）

2.2 PCBP3 過(guò)表達(dá)對(duì)CRC 細(xì)胞增殖能力的影響 與對(duì)照組比較，PCBP3 過(guò)表達(dá)可明顯減弱HCT116 和HT29 細(xì)胞增殖能力（均P＜0.05），見(jiàn)圖2。

圖2 PCBP3 過(guò)表達(dá)對(duì)CRC 細(xì)胞增殖能力的影響（A：HCT116細(xì)胞，與HCT116 對(duì)照組比較，aP＜0.05；B：HT29 細(xì)胞，與HT29對(duì)照組比較，aP＜0.05）

2.3 PCBP3 過(guò)表達(dá)對(duì)CRC 細(xì)胞侵襲能力的影響 與對(duì)照組比較，PCBP3 過(guò)表達(dá)可明顯減弱HCT116 和HT29 細(xì)胞侵襲能力（均P＜0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 PCBP3 過(guò)表達(dá)對(duì)CRC 細(xì)胞侵襲能力的影響（A：HCT116 細(xì)胞，吉姆薩染色，×20，aP＜0.05；B：HT29 細(xì)胞，吉姆薩染色，×40，aP＜0.05）

2.4 PCBP3 過(guò)表達(dá)對(duì)CRC 細(xì)胞E-cadherin、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平的影響 與對(duì)照組比較，PCBP3過(guò)表達(dá)可明顯上調(diào)HCT116 和HT29 細(xì)胞E-cadherin、Cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平（均P＜0.05），見(jiàn)圖4-5。

圖4 PCBP3 過(guò)表達(dá)對(duì)HCT116 細(xì)胞E-cadherin、Cleaved Caspase-3 蛋白表達(dá)水平的影響（A：電泳圖；B：E-cadherin 蛋白表達(dá)水平比較，aP＜0.05；C：Cleaved Caspase-3 蛋白表達(dá)水平比較，aP＜0.05）

圖5 PCBP3 過(guò)表達(dá)對(duì)HT29 細(xì)胞E-cadherin、Cleaved Caspase-3 蛋白表達(dá)水平的影響（A：電泳圖；B：E-cadherin 蛋白表達(dá)水平比較，aP＜0.05；C：Cleaved Caspase-3 蛋白表達(dá)水平比較，aP＜0.05）

3 討論

CRC 是全球第三大癌癥死亡原因，其發(fā)病率在發(fā)展中國(guó)家逐年上升[12]。隨著社會(huì)人口老齡化加劇，CRC 發(fā)病率和病死率可能繼續(xù)升高[13-14]。因此，深入探討CRC 的發(fā)生、轉(zhuǎn)移機(jī)制具有一定的臨床意義。

PCBP 家族在人和小鼠胃腸道組織中廣泛表達(dá)，其中PCBP1、PCBP2 能調(diào)控腫瘤的發(fā)生[7]。但PCBP3 在CRC 發(fā)生、發(fā)展中的生物學(xué)功能和調(diào)節(jié)機(jī)制，目前尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究作了初步探討，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PCBP3 在人癌旁正常組織中呈高表達(dá)，但在CRC 組織中表達(dá)水平明顯降低，筆者推測(cè)其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用可能與PCBP4 相似[15]。進(jìn)一步開(kāi)展細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)PCBP3 能明顯減弱CRC 細(xì)胞增殖和侵襲能力，同時(shí)明顯上調(diào)腫瘤轉(zhuǎn)移抑制蛋白分子E

cadherin 和凋亡分子Cleaved Caspase-3 蛋白表達(dá)水平。以上結(jié)果驗(yàn)證了PCBP3 在CRC 細(xì)胞増殖、侵襲過(guò)程中表現(xiàn)出的生物學(xué)特征，同時(shí)揭示其對(duì)CRC 發(fā)生、發(fā)展的影響。

綜上所述，PCBP3 過(guò)表達(dá)能抑制CRC 細(xì)胞增殖和侵襲，可能通過(guò)上調(diào)E-cadherin、Cleaved Caspase-3 蛋白表達(dá)水平發(fā)揮作用。