王春丹 張秀珊 王健蓉 林天友 蘇鎮(zhèn)祥 陳桂玲 曾寶珰

(汕頭市農(nóng)業(yè)科學研究所，廣東 汕頭 515021)

蝴蝶蘭(Phalaenopsis spp.)別名蝶蘭，蝴蝶蘭屬熱帶或亞熱帶的單莖性氣生蘭，其花形似蝴蝶飛舞，色彩艷麗且顏色多樣，有純色的紅、黃、白、綠、紫紅、深紅、粉紅、橙紅，也有白花黃心、黃花紅心、紫花白邊等。花朵的品種不同，花的大小也有差異。大花品種花朵甚至超過15cm，大小接近人的手掌，小花品種有的小于2cm，小巧玲瓏。唇瓣的花色及形狀變化也是十分豐富，極具觀賞價值。有些花種不僅顏色美，花型好，更是帶著淡淡的香味，讓人喜愛。蝴蝶蘭花期可長達數(shù)月，植株外型美觀，素有“洋蘭皇后”之稱，與卡特蘭、萬代蘭、石斛蘭并稱為4大觀賞蘭[1]。蝴蝶蘭常野生于熱帶高溫、多濕的中低海拔山林中，喜高溫、多濕、散射光及通風良好的環(huán)境，忌悶熱及強光。適宜的生長溫度白天為25～28℃，晚間為18～20℃。溫度高于35℃或低于10℃時，蝴蝶蘭停止生長。晝夜溫差最好達到5～8℃，有利于蝴蝶蘭的生長。蝴蝶蘭被視為“愛情、純潔、美麗”的象征，一直以來在花卉市場備受歡迎，每年春節(jié)都能看到其身影。顏色美、株形好的蝴蝶蘭備受寵愛，走入了千家萬戶。質(zhì)量高、品質(zhì)好的蝴蝶蘭更是市場所需求的，這就對蝴蝶蘭種苗的大規(guī)模生產(chǎn)起到推動作用。提高蝴蝶蘭優(yōu)良品種的繁殖速度，對培育大批量優(yōu)質(zhì)種苗意義重大，有利于進一步擴大生產(chǎn)規(guī)模。加強和完善蝴蝶蘭離體培植技術(shù)體系的研究，可更好為其提供有力條件。

蝴蝶蘭種子如灰塵，小而輕，沒有胚乳。在自然條件下，種子的萌發(fā)率極低，無法利用播種方式有效繁殖，植株也很少發(fā)育側(cè)芽，很難采用常規(guī)分株方式進行無性繁殖。蝴蝶蘭組培選取帶休眠芽的幼嫩花梗作為外植體誘導出不定芽，進而產(chǎn)生叢生芽，叢生芽經(jīng)過增殖可直接成苗。蝴蝶蘭叢生芽途徑的優(yōu)點，不僅僅是誘導率高，所用時間短，增殖率高，而且性狀穩(wěn)定，變異率低，可全年生產(chǎn)等，且所繁育的種苗能較好保持親本的優(yōu)良性狀，能滿足蝴蝶蘭規(guī)?；a(chǎn)的需求，因此已成為蝴蝶蘭種苗生產(chǎn)最有效的手段[2]。

植物組織培養(yǎng)是以植物生理學為基礎(chǔ)發(fā)展起來的一項技術(shù)。經(jīng)過各國科學家多年探索，當前幾乎所有的植物器官、組織或細胞都能離體培養(yǎng)成功[3]。目前，與蝴蝶蘭組織培養(yǎng)技術(shù)研究方面相關(guān)的文獻較多[4-8]，蝴蝶蘭組培技術(shù)比較成熟，但不同品種之間的組培條件差異較大，這就要求對于組織培養(yǎng)技術(shù)方面研究要更為細化。有關(guān)暗培養(yǎng)對增殖率影響的研究少有報道。本文以汕頭市農(nóng)業(yè)科學研究所自主選育的蝴蝶蘭優(yōu)良新品種“汕農(nóng)幸運女神”(粵評花20220007)、“汕農(nóng)福星”(粵評花20220004)在繼代階段的叢生芽為材料，初步探索暗培養(yǎng)時間對“汕農(nóng)幸運女神”“汕農(nóng)福星”蝴蝶蘭叢生芽繼代增殖的影響，為現(xiàn)有的蝴蝶蘭快速繁殖體系添磚加瓦，降低組培成本，為蝴蝶蘭相關(guān)生產(chǎn)企業(yè)提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗材料為汕頭市農(nóng)業(yè)科學研究所自主選育的“汕農(nóng)幸運女神”“汕農(nóng)福星”蝴蝶蘭經(jīng)叢生芽途徑的繼代材料。

1.2 方法

選取芽體生長基本一致的單芽，每瓶接種11個芽，培養(yǎng)基為1/2MS加6-BA 7mg·L-1加Ad 5mg·L-1加白糖20g·L-1加椰汁100mg·L-1加瓊脂4g·L-1，pH5.8。

將接種后的材料進行暗培養(yǎng)，設(shè)7個處理，暗培養(yǎng)天數(shù)分別為0d(處理1)、10d(處理2)、20d(處理3)、30d(處理4)、40d(處理5)、50d(處理6)、60d(處理7)，每個處理設(shè)置3次重復，每個重復5瓶，共15瓶。在達到暗培養(yǎng)天數(shù)后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)溫度為26±2℃、光照強度為2000～2500lx的培養(yǎng)室中培養(yǎng)。繼代培養(yǎng)周期為60d，轉(zhuǎn)瓶時記錄每瓶芽數(shù)，計算每個處理每瓶平均芽數(shù)，計算平均增殖系數(shù)。

1.3 增殖系數(shù)計算

計算公式：

增殖系數(shù)=每瓶平均芽數(shù)/每瓶接種芽數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 “汕農(nóng)幸運女神”暗培養(yǎng)處理1～7叢生芽增殖情況

從圖1可知，處理1單芽基部長出新的叢生芽，新芽葉色濃綠，芽體較粗壯，但新芽數(shù)量較少；處理2～5萌發(fā)的新芽呈翠綠色，芽數(shù)比處理1明顯增加；處理6～7萌發(fā)的新芽呈嫩綠色，芽數(shù)比其它處理明顯增加。光照時間長短不同，各個處理的蝴蝶蘭苗顏色也略有差別，其中，處理6經(jīng)過50d的暗培養(yǎng)，新芽的顏色偏白，雖有10d光照，顏色尚未恢復為綠色。處理7在無光照的條件下，葉片得不到足夠的光照，不能形成葉綠素，使得新芽生長緩慢，芽體弱小，顏色偏白色，有的新芽更是略透明，但新芽數(shù)量最多，見圖2，之前所接的單芽和新生芽形成一簇，緊密相挨。

注：圖片編碼A1～A7分別對應不同暗培養(yǎng)天數(shù)。

圖2 處理7(暗培養(yǎng)60d)

2.2 “汕農(nóng)幸運女神”“汕農(nóng)福星”經(jīng)過不同暗培養(yǎng)天數(shù)后叢生芽的增殖情況

從表1、表2可知，隨著暗培養(yǎng)天數(shù)的增加，2個品種的增殖系數(shù)隨著增大，見圖3。當材料暗培養(yǎng)至60d時，增殖系數(shù)最高，“汕農(nóng)幸運女神”增殖系數(shù)達到6.73，而“汕農(nóng)福星”的增殖系數(shù)達到5.81。

表1 不同暗培養(yǎng)天數(shù)“汕農(nóng)幸運女神”叢生芽增殖情況

表2 不同暗培養(yǎng)天數(shù)“汕農(nóng)福星”叢生芽增殖情況

圖3 “汕農(nóng)幸運女神”和“汕農(nóng)福星”增殖系數(shù)折線圖

3 討論與結(jié)論

目前，蝴蝶蘭組織培養(yǎng)研究大多采用原球莖途徑[9，11]，相比原球莖途徑，叢生芽的報道較少。叢生芽的組織培養(yǎng)途徑誘導率高，性狀穩(wěn)定，同時所用時間短，節(jié)約了時間成本，蝴蝶蘭叢生芽的組織培養(yǎng)途徑的增殖率高，可達3～6倍，相比其他，技術(shù)難度低，性狀穩(wěn)定，這就避免了變異的產(chǎn)生，對大規(guī)模的生產(chǎn)意義重大。

組織培養(yǎng)是蝴蝶蘭快速繁殖的主要途徑，在合理高效利用有限外植體的前提下，提高蝴蝶蘭不定芽的增殖率就可以提高蝴蝶蘭的繁殖速度。從試驗結(jié)果來看，通過增加暗培養(yǎng)時間明顯提高“汕農(nóng)幸運女神”“汕農(nóng)福星”不定芽的增殖率。在單一個繼代周期內(nèi)，隨著暗培養(yǎng)天數(shù)的增加增殖率逐漸提高，見圖3，經(jīng)過60d暗培養(yǎng)供試2個品種的叢生芽增殖率最高，達到6.73和5.81。從供試的2個品種試驗結(jié)果來看，暗培養(yǎng)天數(shù)在20～40d，增殖系數(shù)已達到4.14～6.01倍的較高水平，所以選擇暗培養(yǎng)天數(shù)為20～40d是較合適的?？紤]到蝴蝶蘭組培苗的繼代周期一般為50～60d，如果暗培養(yǎng)的天數(shù)達到50d和60d時，新萌發(fā)的芽體較為嫩綠，雖然增殖的新芽多，但沒有經(jīng)過光照培養(yǎng)，芽體較小，相對較弱，有的甚至出現(xiàn)玻璃化，在下一次繼代轉(zhuǎn)瓶初期又再一次進行暗培養(yǎng)，長時間處于暗培養(yǎng)至第2次繼代轉(zhuǎn)瓶時不排除會出現(xiàn)黃化或死芽情況，不利于正常增殖生長。所以，在本試驗中不將增殖率較高的暗培養(yǎng)天數(shù)50d和60d列為合適處理方法。在1個繼代周期內(nèi)，適當增加暗培養(yǎng)的天數(shù)，明顯有利于提高叢生芽增殖率。

影響蝴蝶蘭組織快速繁殖的因素有很多，包括蝴蝶蘭品種的不同、基礎(chǔ)培養(yǎng)基的選擇、外植體不同、消毒方式不同、調(diào)節(jié)物質(zhì)及添加量的不同、還有光照條件、溫度、濕度等培養(yǎng)條件的不同等。本文為暗培養(yǎng)時間對蝴蝶蘭叢生芽增殖影響的初步探索，旨在為蝴蝶蘭品種擴繁增殖階段科學暗培養(yǎng)提供參考，具體應用指導生產(chǎn)還有待進一步深入探索。此次試驗僅針對特定品種“汕農(nóng)幸運女神”“汕農(nóng)福星”所得出的結(jié)論，而不同蝴蝶蘭之間存在品種差異，對培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的要求也不同，具體品種的合適暗培養(yǎng)時間有待進一步探索；在設(shè)置暗培養(yǎng)時間上，本文以10d為間距，如縮短為5d間距，進一步觀察暗培養(yǎng)時間對蝴蝶蘭叢生芽的影響，更有利于準確掌握不同品種的適宜暗培養(yǎng)時間；此次試驗僅在單一個繼代周期內(nèi)進行，對其后續(xù)多代轉(zhuǎn)瓶情況仍未了解，連續(xù)幾個繼代周期(3代以上)進行試驗，并觀察對其以后生長如促根或移栽階段的影響，才能科學總結(jié)具體品種的暗培養(yǎng)需求；暗培養(yǎng)與褐變的關(guān)系。褐變現(xiàn)象是指在組織培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)材料向培養(yǎng)基中釋放褐色物質(zhì)，致使培養(yǎng)基逐漸變成褐色，培養(yǎng)材料也慢慢變褐而死亡的現(xiàn)象培養(yǎng)。外植體褐變是植物組織培養(yǎng)中遇到的重要問題。與褐變的相關(guān)研究表明，光照強度與褐變程度之間存在一定關(guān)系。如，許傳俊等通過培養(yǎng)基及光照對蝴蝶蘭葉片外植體褐變的影響試驗結(jié)果表明，光照強度增加，外植體褐變也嚴重[12]；趙伶俐等研究了不同光照強度培養(yǎng)下，蝴蝶蘭初代培養(yǎng)過程中外體內(nèi)多酚氧化酶(PPO)活性、總酚含量以及褐化百分率的變化規(guī)律[13]，也表明了光照強度與褐化程度之間的關(guān)系。那么，如何通過科學的暗培養(yǎng)減輕褐化程度有待于進一步深入探討研究，科學總結(jié)研究結(jié)果。

暗培養(yǎng)時間與蝴蝶蘭叢生芽增殖關(guān)系，此次試驗僅為初探，受品種、培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件等相關(guān)條件所限制，未能進一步全面探究，對于暗培養(yǎng)時間對蝴蝶蘭叢生芽的影響將有待進一步探索研究，為現(xiàn)有的蝴蝶蘭快速繁殖體系添磚加瓦，降低組培成本，以提高經(jīng)濟效益。