石雪燕李濤王虹云張瑞清曹守軍張麗莉姚建剛劉佳鳳黃代峰

(1.山東煙臺(tái)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，山東 煙臺(tái) 265599；2.煙臺(tái)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264005)

番茄(Solanum lycopersicum L.)果肉酸甜可口鮮嫩多汁，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，加工食用方法多樣，深受人們喜歡，栽培地區(qū)廣泛，是最具有經(jīng)濟(jì)效益的園藝作物之一。黃化曲葉病毒病是番茄的主要病害之一，被侵染后番茄葉片變小變厚變黃邊緣卷曲，植株無(wú)法正常發(fā)育，以帶有病毒的煙粉虱為主要媒介傳播，由于煙粉虱繁殖能力強(qiáng)，防治困難，進(jìn)而造成黃化曲葉病毒病發(fā)病加重[1]。番茄葉霉病是由病原體(Cladosporium fulvum)侵染造成的，葉片侵染后出現(xiàn)褐色的霉菌斑塊[2]嚴(yán)重時(shí)番茄果實(shí)上會(huì)出現(xiàn)黑色的斑點(diǎn)導(dǎo)致果實(shí)硬化不能食用[3]。番茄頸腐根腐病是由尖孢鐮孢菌番茄頸腐根腐病?；?Fusarium oxysporum f.sp. radicis-lycopersici，F(xiàn)orl)侵染引起的一種土傳病害[4]，幼苗期從發(fā)病部位折倒而亡，5片葉后發(fā)病植株直立但是莖基部壞死，導(dǎo)致植株萎蔫死亡[5]。番茄極易受到病害影響導(dǎo)致產(chǎn)量和果實(shí)品質(zhì)不佳，選育含有抗病基因的優(yōu)良品種是最直接有效避免病害的方法。

五引物擴(kuò)增受阻突變體系技術(shù)(PARMS)是在四引物擴(kuò)增受阻突變體系(ARMS)的基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)出的通過(guò)熒光檢測(cè)對(duì)SNPs或特定位點(diǎn)上的InDels進(jìn)行精準(zhǔn)的雙等位基因判斷[6，7]，在PARMS中，2種不同的通用引物被添加到引物的末端，通用熒光引物在擴(kuò)增系統(tǒng)的參與下，將不同的基因型擴(kuò)增以獲得不同的熒光基團(tuán)，檢測(cè)樣品僅通過(guò)PCR擴(kuò)增一次，無(wú)需電泳檢測(cè)，擴(kuò)增數(shù)據(jù)通過(guò)熒光掃描儀直接從原始板中獲得[8，9]。

本研究對(duì)番茄黃化曲葉病毒病抗病基因Ty-1、Ty-2、Ty-3，番茄葉霉病抗病基因Cf-9，番茄頸腐根腐病抗病基因Frl分別進(jìn)行PARMS鑒定，以對(duì)PARMS檢測(cè)方法在番茄育種材料中的應(yīng)用進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

1 實(shí)驗(yàn)材料及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料為山東省煙臺(tái)市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院蔬菜花卉所提供的134份番茄種質(zhì)資源材料，見(jiàn)表1，種植在煙臺(tái)農(nóng)科院蔬菜基地，采集新鮮健康的番茄葉片液氮固定，-80℃保存以備后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表1 PARMS檢測(cè)結(jié)果及田間鑒定

1.2 DNA的提取

使用的試劑為動(dòng)物及多糖多酚雙超mix試劑盒，購(gòu)自北京聚合美科技有限公司(Mei5 Biotechnology Co.，Ltd)。取番茄葉片0.5cm2，加入加強(qiáng)型擴(kuò)增最佳伴侶50μL充分研磨，沸水浴5min，12000rpm離心2min，得到番茄樣品DNA模板，-20℃保存。

1.3 PARMS檢測(cè)方法

反應(yīng)體系為10μL：1μL DNA模板(50ng·μL-1)，5μL PARMS mix(2×)，0.45μL引物，3.55μL ddH2O。 PARMS-PCR擴(kuò)增體系：94℃ 15min；94℃ 20s，65℃ 1min(-0.7℃/循環(huán))，10個(gè)循環(huán)；94℃ 20s，57℃ 1min，35個(gè)循環(huán)；35℃ 1min。利用Applied BiosystemsTMQuantStudioTM6讀取擴(kuò)增產(chǎn)物的終點(diǎn)信號(hào)，使用其自帶的軟件進(jìn)行分型分析。其中，連接FAM熒光標(biāo)簽序列的等位基因型聚合在X軸附近，連接HEX熒光標(biāo)簽序列的等位基因型聚合在Y軸附近，2種等位基因的雜合型在中間顯示。由武漢景肽生物科技有限公司(Gentides Biotech Co.，Ltd)檢測(cè)。

1.4 田間鑒定

134份種質(zhì)資源材料分別于2020年、2021年、2022年春秋兩季在田間進(jìn)行種植，拉秧期對(duì)番茄黃化曲葉病、番茄葉霉病、番茄頸腐根腐病的發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查。

2 結(jié)果及分析

對(duì)134份番茄材料進(jìn)行PARMS檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

注：橫縱坐標(biāo)值表示HEX與FAM熒光信號(hào)強(qiáng)度值；每1個(gè)圓點(diǎn)代表1份檢測(cè)材料，藍(lán)色代表抗性純合材料，綠色代表沒(méi)有抗性純合材料，紅色代表雜合材料，灰色代表游離在外無(wú)法判定，黑色代表沒(méi)有擴(kuò)增信號(hào)。

經(jīng)檢測(cè)含有Ty-1純合基因的番茄材料43份，含有Ty-1雜合基因的番茄材料14份，不含Ty-1基因的番茄材料69份，未檢出Ty-1基因的番茄材料8份；含有Ty-2純合基因的番茄材料36份，含有Ty-2雜合基因的番茄材料2份，不含Ty-2基因的番茄材料90份，未檢出Ty-2基因的番茄材料6份；不含Ty-3基因的番茄材料100份，未檢出Ty-3基因的番茄材料34份。含有Cf-9純合基因的番茄材料44份，含有Cf-9雜合基因的番茄材料19份，不含Cf-9基因的番茄材料59份，未檢出Cf-9基因的番茄材料12份。含有Frl純合基因的番茄材料50份，含有Frl雜合基因的番茄材料5份，不含F(xiàn)rl基因的番茄材料73份，未檢出Frl基因的番茄材料6份。

結(jié)合田間鑒定及表1中PARMS檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用PARMS方法檢測(cè)Ty-1抗病基因有8份材料未檢出，分別是CH-20、CT-4、TY-26、TY-24、HY-2、SM-5、EP-7、ML-54；Ty-2抗病基因有6份材料未檢出，分別是CH-5、CM-17、RS-12、FW-34、MS-85、SG-56；Ty-3有34份材料未檢出，Ty-1和Ty-3為1對(duì)復(fù)等位基因，理論上只存在1個(gè)，攜帶Ty-1抗性為智利番茄LA1969來(lái)源，攜帶Ty-3抗性為智利番茄LA2779來(lái)源。根據(jù)田間鑒定結(jié)果表明，CT-4、TY-26、TY-24、HY-2、SM-5、EP-7為抗病材料，CH-20、ML-54為感病材料。綜合田間調(diào)查及Ty分子標(biāo)記檢測(cè)，Ty-1標(biāo)記與番茄Ty抗性有很大相關(guān)性。Cf-9抗病基因有12份材料未檢出，分別是CL-11、CM-17、CS-22、PJ-2、CT-45、CM-33、SN-3、SN-78、SM-5、MK-43、ML-13、SD-6，根據(jù)田間鑒定結(jié)果顯示，CS-22、CT-45、SN-3、SN-78、SM-5、MK-43抗葉霉病，CL-11、CM-17、PJ-2、CM-33、ML-13、SD-6為感病材料。Frl抗病基因有6份材料未檢出，分別是CH-20、CS-21、TY-19、SG-43、JF-14、DF-56，根據(jù)田間鑒定結(jié)果顯示，TY-19、SG-43、JF-14、DF-56為抗病材料，CH-20、CS-21為感病材料。

3 討論

隨著分子生物學(xué)在農(nóng)學(xué)領(lǐng)域的大量應(yīng)用，分子標(biāo)記輔助育種成為一種有效的育種手段，與傳統(tǒng)育種方式相比，分子育種便捷準(zhǔn)確能縮短育種年限[10]，是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。與普通PCR技術(shù)相比，常規(guī)PCR成本較低，一般實(shí)驗(yàn)室內(nèi)均可操作，但實(shí)驗(yàn)結(jié)果受操作方法影響大，檢測(cè)步驟繁瑣、效率低，無(wú)法快速完成大量的檢測(cè)任務(wù)，使得大批量常規(guī)PCR檢測(cè)受到限制[11]，而通過(guò)熒光檢測(cè)的PARMS技術(shù)可進(jìn)行批量檢測(cè)，周期短、檢測(cè)效率高，檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確率比常規(guī)PCR高[9，12]。

本研究利用PARMS分子標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)，對(duì)134份番茄材料的5個(gè)抗病基因進(jìn)行了檢測(cè)，并通過(guò)田間調(diào)查對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行了驗(yàn)證。經(jīng)綜合評(píng)價(jià)，PARMS技術(shù)準(zhǔn)確性為95%以上，檢測(cè)效率高，適于大批量檢測(cè)，可作為今后番茄育種材料抗病性檢測(cè)的輔助手段。