何榮軍,賀 丹,張安強,孫培龍

(浙江工業(yè)大學 食品科學與工程學院,浙江 杭州 310014)

失眠在現(xiàn)代社會尤為普遍[1],嚴重失眠還會增加高血壓、心血管疾病的死亡率及失眠患者的患癌風險[2]。中醫(yī)常用靈芝緩解病患的失眠癥狀[3]。近年來研究發(fā)現(xiàn)靈芝水提物可通過增加小鼠腦內(nèi)GABA、5-HT和TNF-α的含量來發(fā)揮鎮(zhèn)靜催眠作用[4-6]。在睡眠機制的研究上,證實睡眠肽、GABA、5-HT、褪黑素、谷氨酸和組胺等物質(zhì)能夠影響睡眠和覺醒[7]。而在失眠靶點的研究中,γ-氨基丁酸A(GABAA)[8]受體、褪黑素(MT)[9]受體、5-HT[10]受體和谷氨酸[11]受體的相關(guān)靶點不斷受到關(guān)注。斑馬魚是睡眠研究的新型生物,其基因及蛋白與人類相似度較高[12],除此之外還具有適應性強、繁殖周期短和繁殖能力強等特點[13]。斑馬魚在睡眠研究中具有較多優(yōu)勢:1) 與人類一樣,斑馬魚具有正常的睡眠周期;2) 斑馬魚在睡眠被剝奪后會增加睡眠時間[14];3) 興奮類藥物能夠使斑馬魚快速失眠[15]。Wang等[16]以斑馬魚為實驗動物,成功證實了五味子乙醇提取物和五味子苷對斑馬魚失眠的改善作用。

靈芝的化學成分復雜,而使用不同溶劑提取靈芝,得到的化學成分不同,難以對靈芝不同提取物改善睡眠的功效進行快速而科學的評價。因此,筆者采用咖啡因誘導斑馬魚造成失眠模型,給予靈芝提取物和奧沙西泮治療,考察靈芝提取物對失眠癥斑馬魚睡眠的改善作用。為了研究靈芝提取物中改善睡眠的化學成分,對兩種靈芝提取物進行萃取分離,篩選出靈芝萃取分離物中的有效助眠成分。筆者從靈芝提取物對GABRA1,GABRA3,GABRA5,GAD1,GRIN2A,HTR1A,HTR2A和MTNR1AmRNA相對表達水平的影響來探討其改善睡眠的生物靶點及作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

赤芝子實體由浙江方格藥業(yè)有限公司贈送;95%乙醇、石油醚(沸程60～90 ℃)、乙酸乙酯、正丁醇等購自國藥集團化學試劑有限公司,均為分析純;二甲基亞砜(DMSO)、亞甲基藍、異丙醇、二水氯化鈣、氯化鉀、氯化鈉、咖啡因、無水硫酸鎂購自阿拉丁生物科技有限公司;奧沙西泮購自北京益民藥業(yè)有限公司。

ChamQ Universal SYBY qPCR Master Mix試劑、HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)試劑、DEPC水、Trizol試劑均購自諾唯贊有限公司;96孔板、6孔板購自無錫耐思生命科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AL-104電子天平,Mettler Toledo有限公司;SW-CJ-1FD超凈工作臺,上海博訊實業(yè)有限公司;Video track 3行為分析儀,法國View Point Life Sciences有限公司;YXQ-LS-50S11立式壓力蒸氣滅菌器,上海博訊實業(yè)有限公司;ALPHA 2-4 LD冷凍干燥機,德國Christ公司;CR21N高速臺式離心機,日本日立株式會社;HWS-150恒溫恒濕培養(yǎng)箱,上海森信實驗儀器有限公司;Nano Drop lite核酸蛋白分析儀,賽默飛世爾科技(中國)有限公司;7300plus熒光定量PCR儀,賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.3 樣品制備

1.3.1 靈芝水提取物的制備

稱取100 g靈芝子實體,按照(1∶15) g/mL的料液比加入水,煎煮2 h,重復3次,合并上清液,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在50 ℃下去除水分得到水提物浸膏,冷凍干燥得到靈芝水提物粉末。

1.3.2 靈芝乙醇提取物的制備

用超微粉碎機將靈芝子實體粉碎,并過120目篩,稱取100 g粉碎后的粉末,按照一定的料液比加入85%的乙醇溶液,浸泡過夜,抽濾后收集濾液,重復3次,合并上清液,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在45 ℃下除去溶劑得到乙醇提取物浸膏,加入去離子水,繼續(xù)旋蒸,除去殘留乙醇,冷凍干燥得到乙醇提取物粉末。

1.3.3 靈芝水提物的分離

靈芝水提物粉末以(1∶15) g/mL的料液比加入去離子水,首先使靈芝水提物粉末充分溶解于水中,然后加入一定量的95%乙醇,最終乙醇體積分數(shù)為85%。分別收集上清液和沉淀,用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器脫除各相浸膏中的乙醇,再進行冷凍干燥得到靈芝低分子量成分和粗多糖。

1.3.4 靈芝乙醇提取物的分離

將上述步驟得到的靈芝乙醇提取物干粉以(1∶10) g/mL的料液比加入去離子水,使干粉均勻地分散在去離子水中形成懸濁液,隨后分別加入3倍體積的石油醚和乙酸乙酯、1倍體積的正丁醇進行萃取,靜置過夜,重復3次,收集并合并上清液,最終得到水相、石油醚相、乙酸乙酯相和正丁醇相4個提取相。用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器脫除每一相提取物的溶劑,再冷凍干燥得到各個相的提取物干粉。

1.3.5 靈芝粗多糖中多糖和蛋白含量的測定

參考Cui等[5]的實驗方法,使用苯酚硫酸法測定靈芝粗多糖。通過BCA蛋白試劑盒測定靈芝粗多糖的蛋白含量[17]。

1.3.6 靈芝乙酸乙酯相提取物總?cè)坪康臏y定

參考鄒桂欣等[18]的實驗方法,總?cè)扑岷坎捎孟悴萑┍姿?高氯酸顯色法測定。

1.4 斑馬魚飼養(yǎng)方法

6個月AB型野生系斑馬魚購于上海費曦生物有限公司。斑馬魚的養(yǎng)殖溫度為28 ℃,使用自動計時器設(shè)置光照和黑暗交替循環(huán),光暗條件為14 h光照(08:00—22:00),10 h黑暗(22:00—第2天08:00)。10條斑馬魚雄魚和10條斑馬魚雌魚分別放入兩個7 L的魚缸中喂養(yǎng),pH保持在7.2,鹽度保持在500 plus/cm,每隔36 h換一次水,每天早中晚定時喂養(yǎng)豐年蝦2次。將雌、雄魚按照1∶1的比例放入產(chǎn)卵專用缸,第2天早晨雌雄魚開始追逐,2 h后收集魚卵,將魚卵放入燒杯或者其他容器中,去除死卵和雜物等,成年的雌魚、雄魚轉(zhuǎn)移回原來的魚缸中,并及時投喂魚食,更換水。斑馬魚每兩周交配一次。

斑馬魚的魚卵放入稀釋60倍的E3培養(yǎng)液中,在28.5 ℃條件下的恒溫培養(yǎng)箱中模擬晝夜交替培養(yǎng)。每天觀察2次,檢查胚胎發(fā)育狀況,若出現(xiàn)發(fā)白的死卵,及時清除,幼魚的養(yǎng)殖水每天更換2～3次,保持水質(zhì)干凈。魚卵培養(yǎng)孵化5 d后開始準備實驗。

1.5 實驗方法

1.5.1 確定藥物的最大耐受質(zhì)量濃度(MTC)

根據(jù)夏婧等[19]的方法并稍加修改。選取5 d野生型AB系斑馬魚,在顯微鏡下挑選發(fā)育正常的斑馬魚,對不同質(zhì)量濃度的各種靈芝提取物進行實驗,觀察統(tǒng)計5 d幼魚的存活情況,確定各種靈芝提取物的最大耐受質(zhì)量濃度。分別以各種靈芝提取物最大耐受質(zhì)量濃度的1/9,1/3,1倍設(shè)置為各種靈芝提取物的低劑量、中劑量和高劑量。根據(jù)預實驗確定咖啡因作為失眠模型造模藥物,給藥濃度為200 μmol/L。在設(shè)定質(zhì)量濃度梯度實驗中,顯示0.025 g/L為最低有效質(zhì)量濃度,故選用0.025 g/L作為奧沙西泮組的給藥質(zhì)量濃度。

1.5.2 斑馬魚失眠模型的建立

參考何東方等[20]建立的斑馬魚失眠模型方法。分組:每組22孔,依次分為空白對照組、咖啡因組、奧沙西泮組、低中高質(zhì)量濃度靈芝治療組。靈芝治療組1分為靈芝水提物、靈芝粗多糖和靈芝低分子量成分;靈芝治療組2分為靈芝乙醇提取物、靈芝石油醚相提取物、靈芝乙酸乙酯相提取物、靈芝正丁醇相提取物和靈芝水相提取物。

1.5.3 評價藥物對失眠癥斑馬魚睡眠的改善作用

行為參數(shù)根據(jù)文獻[21-23]方法并稍加修改,觀察時間為1 h。斑馬魚的數(shù)據(jù)15 s采集一次,這些原始數(shù)據(jù)也代表著幼魚的睡眠和運動時間。行為軌跡儀的設(shè)定程序如下:速度小于0.5 cm/s被認定為是慢速運動,速度0.5～2.0 cm/s被認定為是中速運動,速度大于2 cm/s被認定為是快速運動;助眠篩選分析基于總活動量、睡眠總時間、覺醒活動量以及睡眠回合次數(shù)等睡眠/覺醒行為參數(shù);如果每15 s幼魚為慢速運動,運動時間不超過0.1 s,則定為睡眠[24]。一個睡眠回合指的是發(fā)生一次的睡眠序列。具體定義如下:

1) 睡眠總時間(Rest total):1 h內(nèi)平均睡眠時間的總和。

2) 總的活動量(Activity total):1 h內(nèi)運動和睡眠時間的總和。

3) 覺醒活動量(Waking activity):1 h內(nèi)平均運動量的總和。

4) 睡眠回合次數(shù)(Rest bouts):1 h內(nèi)發(fā)生多少睡眠次數(shù)。

1.5.4 靈芝粗多糖和靈芝乙酸乙酯相提取物對GABAA和5-HT相關(guān)受體mRNA相對表達水平的影響

各取30 條經(jīng)0.600 g/L靈芝粗多糖、0.125 g/L靈芝乙酸乙酯相提取物、0.025 g/L奧沙西泮和200 μmol/L咖啡因處理24 h后的斑馬魚,用Trizol試劑提取總RNA,擴增生成cDNA。PCR反應條件:94 ℃預變性2 min,94 ℃變性30 s,57 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共40個循環(huán),分別測定GABRA1,GABRA3,GABRA5,GAD1,GRIN2A,HTR1A,HTR2A,MTNR1A及β-Actin的吸光值。以β-Actin作為內(nèi)參基因。基因序列如表1所示。

表1 基因序列表

采用Ct對比目的基因表達水平。選用β-Actin作為內(nèi)參基因進行參照,將目的基因的Ct減去內(nèi)參基因的Ct得到目的基因mRNA的相對表達量,記為2-▲Ct。相較于空白對照組,給藥組目的基因的表達變化倍數(shù)為2-▲▲Ct,其中,▲▲Ct=(目的基因的Ct-內(nèi)參基因的Ct)給藥組-(目的基因的Ct-內(nèi)參基因的Ct)空白對照組。

1.5.5 統(tǒng)計學方法

每個測試組22條魚,每個樣品質(zhì)量濃度獨立進行3次實驗,取平均值。計算標準誤差,顯著性設(shè)定在P<0.05(*),使用單因素方差分析處理數(shù)據(jù),顯著性分析通過SPSS 20.0完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 藥物的最大耐受質(zhì)量濃度(MTC)

經(jīng)測定提取的靈芝粗多糖的多糖質(zhì)量分數(shù)為86.7%,蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)為3.8%,提取的靈芝乙酸乙酯的總?cè)瀑|(zhì)量分數(shù)為32.6%。用不同質(zhì)量濃度的藥物和靈芝處理斑馬魚24 h,斑馬魚致死率見圖1。奧沙西泮的MTC為0.060 g/L,靈芝水提物的MTC為1.700 g/L,靈芝粗多糖的MTC為1.800 g/L,靈芝乙醇提取物的MTC為0.600 g/L,靈芝乙酸乙酯相提取物的MTC為0.125 g/L。由圖1可知:隨著奧沙西泮質(zhì)量濃度的增加,斑馬魚的死亡數(shù)量逐漸增多。這是由于奧沙西泮在生物體內(nèi)具有生物蓄積性和毒性。研究表明魚類肌肉中奧沙西泮的質(zhì)量濃度是奧沙西泮污染水的6倍以上[25]。而高質(zhì)量濃度的靈芝乙醇提取物、靈芝乙酸乙酯相提取物導致斑馬魚快速死亡。這是由于靈芝乙醇提取物中含有酚類、酮類和三萜類等不溶于水的物質(zhì),乙酸乙酯相提取物主要含有三萜類等不溶于水的物質(zhì)。由此推測,這類不溶于水的物質(zhì)易沉淀,形成大顆粒物質(zhì),而這類大顆粒物質(zhì)會引起幼魚的胃腸道消化吸收和呼吸等功能異常。靈芝石油醚提取物對斑馬魚毒性最大,其原因可能是靈芝石油醚提取物主要是油脂類物質(zhì),油脂類物質(zhì)不溶于水,石油醚相提取物配制時要經(jīng)過超聲波處理,油脂顆粒懸浮于水中[26],而斑馬魚長時間處于油脂顆粒的環(huán)境會影響其呼吸。

圖1 靈芝不同提取物處理斑馬魚的致死率

2.2 靈芝提取物的睡眠改善藥效篩選

在研究斑馬魚睡眠實驗中,一般選用睡眠時間和活動量作為研究指標,其大小意味著睡眠的長短,也代表著對失眠的改善程度[6,27]。藥物對斑馬魚的睡眠改善作用如圖2所示,其中:對照組1為水;對照組2為0.1% DMSO;ns表示差異不顯著,P>0.05;*表示差異顯著,P<0.05;**表示差異極顯著,P<0.01,以下同。由圖2可知:與空白組相比,咖啡因能明顯縮短斑馬魚睡眠回合次數(shù)、縮短斑馬魚睡眠時間和增加斑馬魚活動量;與空白組相比,陽性對照品奧沙西泮能明顯提高斑馬魚睡眠回合次數(shù)、延長斑馬魚睡眠時間和減少斑馬魚活動量。

圖2 藥物對斑馬魚的睡眠改善作用

經(jīng)靈芝提取物處理的斑馬魚行為參數(shù)見圖3。與咖啡因相比,低、中劑量靈芝水提物和中、高劑量靈芝粗多糖均能顯著增加斑馬魚睡眠回合次數(shù)和睡眠總時間,而高劑量靈芝水提物和低劑量靈芝粗多糖則無此效果。與咖啡因相比,低、中、高劑量靈芝粗多糖和靈芝水提物均能顯著減少斑馬魚覺醒活動量。此外,Chu等[4]利用小鼠模型證實靈芝水提取物能顯著增加睡眠時間,間接證明靈芝水提取物可以通過增加睡眠時間來改善斑馬魚睡眠。此外,低、中劑量靈芝水提物組處理的斑馬魚睡眠回合次數(shù)和睡眠總時間均大于靈芝粗多糖組,而覺醒活動量小于靈芝粗多糖組,說明靈芝水提物助眠效果優(yōu)于靈芝粗多糖,由此推測靈芝水提物中可能還含有其他助眠成分。

圖3 靈芝水提物和靈芝粗多糖對斑馬魚睡眠改善的影響

靈芝提取物對斑馬魚睡眠的影響見圖4。與咖啡因相比,中劑量靈芝乙醇提取物均能顯著增加斑馬魚的睡眠回合次數(shù)和睡眠總時間。與咖啡因相比,3個劑量靈芝乙醇提取物3組試驗均能顯著減少斑馬魚覺醒活動量。與咖啡因相比,低、中劑量靈芝乙酸乙酯相提取物均能顯著增加斑馬魚睡眠回合次數(shù)和睡眠總時間,顯著減少斑馬魚覺醒活動量。此外,中、高劑量靈芝乙醇提取物處理的斑馬魚睡眠回合次數(shù)和睡眠總時間均大于靈芝乙酸乙酯相提取物處理組,而覺醒活動量小于靈芝乙酸乙酯相提取物處理組,說明靈芝乙醇提取物的助眠效果優(yōu)于靈芝乙酸乙酯相提取物,由此推測靈芝乙醇提取物可能還含有其他助眠成分。

圖4 靈芝乙醇提取物和靈芝乙酸乙酯相提取物對斑馬魚睡眠的影響

2.3 靈芝提取物對GABAA受體mRNA相對表達水平的影響

γ-氨基丁酸(GABA)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中的主要抑制性神經(jīng)遞質(zhì),GABA有著多種受體亞基,而GABAA受體能打開氯離子的跨膜通道。GABAA受體與GABA結(jié)合,控制大腦的神經(jīng)元活動,一旦受體功能障礙就容易出現(xiàn)失眠、焦慮、抑郁和癲癇等癥狀[28]。此外,GABAA受體α亞基對其藥理作用也至關(guān)重要。GABAA受體α1亞單位具有鎮(zhèn)靜效應,α2和α3亞單位具有抗焦慮、抗驚厥和肌松作用,而含α5受體的選擇性反激活劑能夠治療癡呆癥,因此選擇GABAA相關(guān)受體作為研究基因[19]。各組GABAA相關(guān)受體的相對表達量如圖5所示。與咖啡因組相比,靈芝粗多糖組斑馬魚幼魚下調(diào)了基因GABRA1和GAD1的表達水平,同時上調(diào)了基因GABRA5的表達水平。與咖啡因組相比,靈芝乙酸乙酯相提取物組斑馬魚幼魚也顯著下調(diào)了基因GAD1的表達水平,同時顯著上調(diào)了基因GABRA3和GABRA5的表達水平。說明靈芝粗多糖和靈芝乙酸乙酯相提取物是通過影響GABAA受體部分基因的表達來緩解斑馬魚失眠癥狀的。

圖5 各組GABAA相關(guān)受體的相對表達量

2.4 靈芝提取物對其他神經(jīng)遞質(zhì)受體mRNA相對表達水平的影響

谷氨酸對神經(jīng)細胞具有興奮作用,谷氨酸受體過度激活容易引起興奮毒性[29]。5-HT及其受體能夠調(diào)節(jié)睡眠和覺醒[30]。研究發(fā)現(xiàn)不表達5-HT1A受體的突變小鼠比野生型小鼠出現(xiàn)更多的快動眼睡眠(REMS)時間[31]。血清素通過血清素-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(NAT)和羥基吲哚-O-甲基轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)化為褪黑激素[32]。褪黑素(MTN)是由松果體分泌的一種吲哚類神經(jīng)內(nèi)分泌激素,它能將日常光照和黑暗循環(huán)的信息傳遞給身體,從而間接調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律系統(tǒng)[32]。有報道指出,褪黑素受體MT1和MT2可能與睡眠障礙有關(guān)[31],故選擇GRIN2A,HTR1A,HTR2A,MTNR1A作為研究基因。各組5-HT相關(guān)受體的相對表達量如圖6所示。與咖啡因組相比,靈芝粗多糖組斑馬魚幼魚顯著下調(diào)了基因GRIN2A的表達,顯著上調(diào)了基因MTNR1A,HTR1A,HTR2A的表達。同時與咖啡因組相比,靈芝乙酸乙酯相提取物組斑馬魚幼魚均顯著上調(diào)了基因GRIN2A,MTNR1A,HTR1A的表達。說明靈芝粗多糖下調(diào)了基因GRIN2A的表達,上調(diào)了基因MTNR1A,HTR1A,HTR2A的表達,從而改善了斑馬魚的睡眠;靈芝乙酸乙酯相提取物上調(diào)了基因GRIN2A,MTNR1A,HTR1A的表達,從而增加了斑馬魚的睡眠時間。

圖6 各組5-HT相關(guān)受體的相對表達量

3 結(jié) 論

研究證實了靈芝水提物、靈芝乙醇提取物、靈芝粗多糖和靈芝乙酸乙酯相提取物均對睡眠剝奪斑馬魚具有睡眠改善作用。在助眠效果上,靈芝水提物大于靈芝粗多糖,靈芝乙醇提取物大于靈芝乙酸乙酯相提取物。推測靈芝水提物和乙醇提取物中還有其他未知的助眠成分。此外,研究發(fā)現(xiàn)靈芝粗多糖能顯著降低斑馬魚GABRA1,GRIN2A,GAD1mRNA的表達,上調(diào)GABRA5,MTNR1A,HTR1A和HTR2A基因的表達水平,從而改善斑馬魚的睡眠。靈芝乙酸乙酯相提取物能顯著降低斑馬魚GAD1mRNA的表達水平,上調(diào)GABRA3,GABRA5,GRIN2A,MTNR1A和HTR1A基因的表達水平,從而緩解失眠。研究結(jié)果為進一步開發(fā)靈芝新藥以及探索中藥改善睡眠的新途徑提供理論依據(jù),同時對食用菌的生物活性研究具有重要意義。