孫建強,田 露,張安平

(浙江工業(yè)大學(xué) 環(huán)境學(xué)院,浙江 杭州 310014)

鄰苯二甲酸酯(PAEs)因其增塑料效果好、生產(chǎn)成本低和易于加工等特點,被廣泛應(yīng)用于個人護理產(chǎn)品、食品包裝、醫(yī)療器械、農(nóng)用薄膜的制造與生產(chǎn)中[1-2]。PAEs通常以物理方式與塑料產(chǎn)品結(jié)合,在制造、儲存和使用過程中,很容易釋放到空氣、水以及土壤等自然環(huán)境里[3]。PAEs已被證明是農(nóng)業(yè)土壤中質(zhì)量分數(shù)最多的有機污染物[4],同時農(nóng)作物中也能檢測出PAEs,表明農(nóng)作物會從污染土壤中吸收PAEs,并通過食物鏈對人體健康構(gòu)成威脅[5]。此外,作為一種典型的內(nèi)分泌干擾物(EDC),PAEs及其代謝產(chǎn)物有生殖和發(fā)育毒性,PAEs長期暴露會導(dǎo)致人類生殖、神經(jīng)和免疫系統(tǒng)的功能障礙[6]。因此,如何有效去除環(huán)境中積累的PAEs已成為土壤修復(fù)的重點。

目前已有一些學(xué)者對土壤中PAEs的污染開展修復(fù)研究工作,主要應(yīng)用物理、化學(xué)和生物修復(fù)等技術(shù)來改變其特性以降低毒性和環(huán)境中的質(zhì)量濃度,其中生物修復(fù)法因其高效、安全和廉價等優(yōu)點,被認為是修復(fù)PAEs污染的主要技術(shù)[5]。微生物對PAEs的降解主要由多種酶和蛋白質(zhì)參與,其中加氧酶和水解酶起著關(guān)鍵作用[7]。脂肪酶可作為PAEs酯鍵的水解酶,在特定條件下提高對PAEs的降解[8],然而游離脂肪酶容易受pH和反應(yīng)溫度等環(huán)境條件影響,在實際應(yīng)用中很容易發(fā)生變性導(dǎo)致失活[9]。固定化技術(shù)作為一種實用且經(jīng)濟的綠色技術(shù),可以將酶附著到惰性、不溶材料上以保存酶的活性,提高酶的穩(wěn)定性和適應(yīng)性[10]。生物炭作為一種經(jīng)生物質(zhì)在限氧供應(yīng)下緩慢/快速熱解產(chǎn)生的富含芳香族碳的材料,表現(xiàn)出較強的疏水性,具有高比表面積、孔隙度以及碳質(zhì)量分數(shù)豐富等優(yōu)點,常被作為固定化酶的載體[11-12]。生物炭固定DnBP降解菌株T7,在6 h內(nèi)將DnBP的去除率從36.83%顯著提高到94.39%[13]。因此,研究制備固定化酶,對于提高降解酶的穩(wěn)定性和土壤中PAEs的去除率具有重要作用。筆者以鄰苯二甲酸二甲酯(Di-methy phthalate,DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(Di-ethyl phthalate,DEP)、鄰苯二甲酸二異丁酯(Di-iso-butyl phthalate,DiBP)、鄰苯二甲酸二正丁酯(Di-n-butyl phthalate,DnBP)、鄰苯二甲酸二(2-乙基己基)酯(Di-(2-ethylhexyl) phthalate,DEHP)和鄰苯二甲酸二正辛酯(Di-n-octyl phthalate,DnOP)這6種常見的PAEs作為目標污染物,以商品化脂肪酶作為PAEs降解酶,以生物炭作為固定化載體探究固定化脂肪酶的最佳制備條件。同時進一步探究不同環(huán)境條件對固定化脂肪酶去除土壤中PAEs的影響,為減少土壤PAEs污染問題提供解決思路。

1 材料和方法

1.1 儀器與設(shè)備

三重四級桿型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(TQ-8040,日本Shimadzu公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(德國Heidolph公司);氮吹儀(美國Organomation公司);超純水儀(美國密理博公司);分析天平(德國梅特勒-托利多公司);冷凍干燥機(山東博科生物);超聲波清洗器(SK3210HP,上?？茖?dǎo)超聲儀器);旋渦混勻儀(SK-1,常州華普達教學(xué)儀器有限公司)。

1.2 實驗試劑與材料

6種PAEs標準品購自上海阿拉丁公司;2種氘代物質(zhì)DnBP-d4和DEHP-d4購自上海J&K百靈威公司;色譜純的正己烷、丙酮,分析純的無水硫酸鈉(Na2SO4,分析純)、弗羅里硅土(60～100目)購自國藥集團化學(xué)試劑公司。

實驗所用玉米秸稈生物炭由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供,通過限氧控溫炭化法在500 ℃環(huán)境中熱解3 h制得玉米秸稈生物炭,其理化性質(zhì)如表1所示。脂肪酶(EC 3.1.1.3)購自上海麥克林生化科技有限公司。所用土壤為天然荷塘泥土,經(jīng)陽光暴曬后,挑選出大顆粒雜質(zhì)并過40目篩網(wǎng)備用,pH為7.69,密度為1.22 g/cm3,土壤有機質(zhì)為18.39 g/kg。

表1 玉米秸稈生物炭的理化性質(zhì)

1.3 實驗方法

1.3.1 固定化脂肪酶的制備、優(yōu)化及表征

在100 mL的三角瓶中加入20 mL溶于磷酸鹽緩沖液的脂肪酶溶液和2.0 g生物炭,攪拌均勻后將其振蕩培養(yǎng)一定時間(轉(zhuǎn)速為120 r/min),之后用真空泵抽濾去除表面水分,并用磷酸鹽緩沖液對固定化脂肪酶表面進行少量多次淋洗,在室溫條件下干燥后儲存于4 ℃冰箱內(nèi)備用。為了考察不同pH、反應(yīng)溫度、脂肪酶溶液質(zhì)量濃度以及固定化時間對酶活的影響,按照表2采用L9(34)正交表設(shè)計正交組合實驗,確定獲得最佳固定化酶的制備條件,采用對硝基苯酚法測定固定化脂肪酶活性[14]。

表2 正交實驗因素水平表

通過掃描電子顯微鏡(SEM,Hitachi SU-8020)對生物炭和固定化脂肪酶樣品進行表征分析,首先將樣品分別固定于電膠帶上,進行噴金預(yù)處理,然后用10 kV加速電壓的場發(fā)射掃描電子顯微鏡觀察拍照。

1.3.2 不同條件下固定化脂肪酶對PAEs降解效果實驗

不同土壤pH對PAEs降解效果的影響:使用醋酸、氧化鈣和不同pH的磷酸鹽緩沖液將土壤pH分別調(diào)至5.5,6.5,7.5,8.5,干燥24 h后稱取10 g土壤放置40 mL玻璃離心管中,加入100 mg/L的PAEs混合標準品儲備液50 μL[15]。待有機溶劑揮發(fā)干后,添加磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)土壤中水的質(zhì)量分數(shù)至45%,在20 ℃黑暗環(huán)境中老化24 h后[16],向離心管中加入2%的固定化脂肪酶,旋渦混勻儀120 r/min搖動10 min將土壤與固定化脂肪酶混合均勻,于30 ℃,120 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中反應(yīng)5 d后取出,向土壤中加入1 mL丙酮終止反應(yīng)。將玻璃離心管中的土壤冷凍干燥48 h,等待提取分析,每組處理設(shè)置3個平行樣。

不同反應(yīng)溫度對PAEs降解效果的影響:稱取10.0 g pH為7.5的土壤放置于玻璃離心管中,將其分別置于10,20,30,40 ℃,120 r/min的恒溫振蕩培養(yǎng)箱中反應(yīng)5 d后取出,其他操作同上。

不同固定化酶施加量對PAEs降解效果的影響:稱取10.0 g pH為7.5的土壤放置于玻璃離心管中,分別加入1%,2%,5%(酶與土壤的質(zhì)量分數(shù))固定化脂肪酶,其他操作同上。

不同土壤中水的質(zhì)量分數(shù)對PAEs降解效果的影響:稱取10.0 g pH為7.5的土壤放置于玻璃離心管中,用磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)離心管內(nèi)水的質(zhì)量分數(shù)至30%,45%,60%,其他操作同上。

1.3.3 固定化脂肪酶對PAEs的降解動力學(xué)實驗

在1.3.2節(jié)的最佳實驗條件下施加固定化脂肪酶(IL)處理土壤中的PAEs,同時設(shè)置對照組(CK),分別在0,1,3,5,7,10,14 d取樣并測定PAEs的質(zhì)量分數(shù)。以PAEs剩余的質(zhì)量分數(shù)C表示固定化脂肪酶對PAEs的影響,其計算式為

(1)

式中:C0為t=0時PAEs的質(zhì)量分數(shù),μg/kg;Ct為t時PAEs的質(zhì)量分數(shù),μg/kg。

1.3.4 土壤中PAEs的提取

每份凍干土壤樣品加入DnBP-d4、DEHP-d4以確定土壤中PAEs的回收率,按照V(丙酮)∶V(正己烷)=1∶1的比例加入20 mL提取試劑,經(jīng)旋渦混勻儀(2 000 r/min,5 min)混合均勻后,靜置于黑暗處12 h以保證充分混合。將該混合物超聲(20 ℃,30 min),離心(2 500 r/min,8 min)以收集上清液,該步驟重復(fù)3次。將60 mL上清液混合在燒瓶中,旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)并用正己烷濃縮至2 mL。濃縮樣品用經(jīng)正己烷預(yù)處理的玻璃層析柱(填料自下而上為2.0 g無水硫酸鈉,10 g佛羅里硅土)純化。在2 mL棕色進樣小瓶中用平穩(wěn)的氮氣吹掃洗脫液,最后用正己烷定容至1 mL。在-20 ℃冰箱內(nèi)密封保存,等待GC-MS/MS進樣分析。

1.4 儀器方法

使用SHIMADZU GC-MS/MS-TQ8040和SH-RXi-5SilMS(30 m×0.25 mm×0.25 μm)色譜柱對6種PAEs進行定量分析。樣品(1 μL)以不分流模式注入,載氣(高純氦氣)流速設(shè)定為1 mL/min,進樣溫度設(shè)置為280 ℃,升溫程序:80 ℃保持1 min;10 ℃/min升溫至180 ℃并保持1 min;8 ℃/min升溫至260 ℃并保持1 min;10 ℃/min升溫至300 ℃并保持5 min。檢測器為電子轟擊離子源(EI源),質(zhì)譜參數(shù)設(shè)定:傳輸線溫度280 ℃,離子源溫度230 ℃。以多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式對PAEs進行檢測分析,相關(guān)分析參數(shù)如表3所示。

表3 PAEs GC-MS/MS參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 固定化脂肪酶的制備、優(yōu)化及表征

采用正交實驗法對影響固定化脂肪酶活性的因素進行組合優(yōu)化,結(jié)果如表4所示。對正交實驗結(jié)果進行分析,由極差R可以看出固定化脂肪酶制備的主次影響因素:脂肪酶質(zhì)量濃度>反應(yīng)溫度>pH>固定化時間。比較k值大小確定最佳制備條件為A2B2C3D2,即最佳制備條件:緩沖溶液pH為7.5,反應(yīng)溫度為30 ℃,脂肪酶質(zhì)量濃度為2 g/L,固定化時間為9 h。為了評價固定化酶酶活的穩(wěn)定性,對最佳制備條件A2B2C3D2進行重復(fù)性實驗,固定化脂肪酶酶活分別為1 496,1 501,1 475 μg/g,平均酶活為(1 491±14) μg/g,說明該條件下固定化酶酶活較為穩(wěn)定。

表4 不同條件下固定化脂肪酶酶活的正交實驗結(jié)果

通過掃描電子顯微鏡對實驗所用玉米秸稈生物炭及上述固定化脂肪酶進行表征,結(jié)果如圖1所示。生物炭橫截面和側(cè)面均觀察到良好的孔隙結(jié)構(gòu),將脂肪酶進行固定化處理后,在圖1(c,d)中均能觀察到較多小球狀顆粒物,證明脂肪酶通過物理吸附能被有效固定在生物炭的表面、孔隙和裂縫中。

圖1 玉米秸稈生物炭及固定化脂肪酶的掃描電鏡圖

2.2 不同條件下固定化脂肪酶對PAEs的降解效果

圖2(a)顯示了不同pH土壤環(huán)境中固定化脂肪酶對PAEs的降解情況。由圖2(a)可知:固定化脂肪酶在pH為7.5和8.5的土壤中均具有較高降解活性,其中當pH=7.5時,DMP,DEP,DiBP,DnBP,DEHP,DnOP的去除率分別可達84.25%,64.88%,66.82%,58.75%,49.00%,34.37%。推測不同PAEs降解快慢的差異可能與其側(cè)鏈長度及污染物本身性質(zhì)有關(guān)[17],Peng等[18]發(fā)現(xiàn)比起具有相對較長烷基側(cè)鏈的DnBP,烷基側(cè)鏈較短的DMP和DEP更容易被細菌降解,因此在同樣的環(huán)境條件下,固定化脂肪酶可能對結(jié)構(gòu)相對簡單的化合物有更好的促進降解效果,DEHP,DnOP等辛醇水分配系數(shù)高的長鏈PAEs則降解較慢。在土壤pH為5.5和6.5的條件下,PAEs的去除率急劇下降,推測土壤pH可能會影響固定化脂肪酶的降解活性。Kaushal等[19]證明了游離和固定化脂肪酶當pH為4～5時均沒有活性,并表明較低pH環(huán)境下脂肪酶的結(jié)構(gòu)會發(fā)生改變,進而影響脂肪酶的催化活性。此外,土壤pH會影響吸附劑的電荷密度,直接影響污染物在土壤中的去除效果[20]。因此,固定化脂肪酶更適合在中性或偏堿性的土壤中施用,最佳pH為7.5。

a,b,c—不同字母代表不同處理之間具有顯著性差異。

圖2(b)顯示了在10,20,30,40 ℃的反應(yīng)溫度下固定化脂肪酶對PAEs的降解情況。由圖2(b)可知:隨著反應(yīng)溫度從10 ℃升高到30 ℃,PAEs去除率得到顯著提高(p<0.05),并在30 ℃達到最高;去除率為34.33%～84.25%。當反應(yīng)溫度繼續(xù)升高到40 ℃時,去除率下降到23.65%～74.79%。推測可能與不同反應(yīng)溫度下脂肪酶的活性及其反應(yīng)程度有關(guān)。已知不同酶的最佳催化溫度范圍有所差異,低于或超過最佳溫度范圍時,污染物的去除效果會因為酶催化活性的下降而受到影響[21]。Sri等[22]對不同溫度殼聚糖固定化脂肪酶(來源于假絲酵母)的水解活性進行了探究,發(fā)現(xiàn)當反應(yīng)溫度高于最適條件后,即使稍有升高,也會導(dǎo)致脂肪酶大量失活并減弱對底物的水解活性。Kobayashi等[23]發(fā)現(xiàn)在脂肪酶降解物質(zhì)時,不適宜的反應(yīng)溫度會使酶無法保持良好的蛋白質(zhì)活性,造成酶催化時間縮短,導(dǎo)致降解效果下降。因此固定化脂肪酶降解PAEs的適宜反應(yīng)溫度為30 ℃。

圖2(c)顯示了施加1%,2%,5%的固定化脂肪酶對PAEs降解情況的影響。由圖2(c)可知:當酶施加量從1%升高到2%時,PAEs去除率得到顯著提升(p<0.05),以DnBP和DEHP為例,兩者的最高去除率分別可達53.24%和40.72%。隨著固定化酶施加量繼續(xù)增大到5%,發(fā)現(xiàn)去除率反而隨著酶量的增大而稍有下降。Choi等[24]在0.5%～3.0%酶施加量范圍內(nèi),發(fā)現(xiàn)隨著酶施加量的增加初始去除率顯著增大,經(jīng)4 h反應(yīng)后,酶施加量2%和3%獲得了97%的相似最大去除率。雖然也有一些研究為了獲得更高的物質(zhì)去除率采用了更高的酶施加量[25-26],但是在本實驗中考慮固定化脂肪酶的施用效益及去除效果,選用2%為最佳固定化酶施加量。

圖2(d)顯示了在土壤中水的質(zhì)量分數(shù)分別為30%,45%,60%的條件下固定化脂肪酶對PAEs去除情況的影響。由圖2(d)可知:PAEs的去除率與土壤中水的質(zhì)量分數(shù)呈正相關(guān)。以DnBP和DEHP為例,發(fā)現(xiàn)水的質(zhì)量分數(shù)從30%增加到60%的過程中,去除率分別從24.01%和26.15%提高到51.24%和50.72%,且在不同條件下PAEs的去除率有顯著性差異(p<0.05)。這可能是由于土壤中水的質(zhì)量分數(shù)增加會使土壤孔徑增大,促進污染物和固定化脂肪酶在土壤中的分布與結(jié)合[27]。Zhang等[28]通過對比玉米、小麥和水稻對土壤中的PAEs的耐受性,發(fā)現(xiàn)淹水條件下土壤中的PAEs有更高的去除率,使得水稻對PAEs更具耐受性。此外,土壤中水的質(zhì)量分數(shù)升高還能促進水解反應(yīng),提高土壤微生物的活性并加速污染物質(zhì)的水解[29]。因此,去除PAEs最佳土壤中水的質(zhì)量分數(shù)為60%。

2.3 PAEs降解動力學(xué)分析

根據(jù)2.2節(jié),在pH為7.5,反應(yīng)溫度為30 ℃,固定化脂肪酶施加量為2%,土壤中水的質(zhì)量分數(shù)為60%的條件下,探究14 d內(nèi)固定化脂肪酶對土壤中PAEs的降解,結(jié)果如圖3所示。

圖3 固定化脂肪酶對PAEs的降解效果

為了更深入了解固定化脂肪酶對PAEs的降解行為,采用一級降解動力學(xué)模型(Ct=C0×e-kt)對PAEs的殘留質(zhì)量濃度和時間t進行擬合分析[30],其半衰期計算式為

(2)

式中:T1/2為PAEs的半衰期;k為降解速率常數(shù),d-1。降解動力學(xué)參數(shù)如表4所示。實驗結(jié)果表明:固定化脂肪酶(IL)對PAEs表現(xiàn)出良好的去除能力。經(jīng)固定化脂肪酶處理,14 d后土壤中PAEs的殘留量為初始的15.93%～48.62%。相比長鏈PAEs,短鏈PAEs的去除率更高,這可能是由于PAEs側(cè)酯鏈的空間效應(yīng)不同,較長的側(cè)酯鏈會阻礙固定化脂肪酶與PAEs的結(jié)合,從而抑制水解反應(yīng)[17],因此短鏈PAEs更容易發(fā)生生物降解,而具有較長酯鏈的PAEs則不易被生物降解。由表5可知:固定化脂肪酶對6種PAEs的降解均符合一級降解動力學(xué)模型,經(jīng)固定化脂肪酶處理,土壤中PAEs的降解速率常數(shù)k從0.019～0.035 d-1(CK)顯著增大到0.058～0.145 d-1(IL),降解半衰期從19.80～36.48 d顯著縮短到了4.78～11.95 d,表明固定化脂肪酶的使用可以提高土壤中PAEs的去除率,尤其是短鏈PAEs,對于長鏈PAEs可以考慮先用微生物降解為短鏈PAEs后,再用固定化酶來處理。

3 結(jié) 論

以生物炭為固定化載體,通過物理吸附制備固定化脂肪酶,采用正交實驗法確定了固定化脂肪酶的最佳制備條件:pH為7.5,反應(yīng)溫度為30 ℃,脂肪酶質(zhì)量濃度為2 g/L,固定化時間9 h,此時固定化脂肪酶酶活最高,平均酶活為(1 491±14) μg/g。將此條件制備的固定化脂肪酶施用到PAEs污染土壤中,發(fā)現(xiàn)不同的土壤pH、反應(yīng)溫度、固定化酶施加量和土壤中水的質(zhì)量分數(shù)都會對PAEs的去除產(chǎn)生影響,實驗結(jié)果顯示:在pH為7.5,反應(yīng)溫度為30 ℃,固定化脂肪酶施加量為2%,土壤中水的質(zhì)量分數(shù)為60%的條件下,PAEs去除效果最好;14 d后土壤中PAEs的殘留量為初始的15.93%～48.62%,降解半衰期從19.80～36.48 d縮短到4.78～11.95 d。實驗結(jié)果表明:生物炭固定化脂肪酶具有良好的PAEs去除能力,為固定化脂肪酶在實際污染土壤中的應(yīng)用提供了依據(jù)。后續(xù)考慮開展田間實驗探究固定化脂肪酶在實際土壤環(huán)境中對PAEs去除的影響,并通過土壤理化性質(zhì),土壤微生物種群等指標的變化,進一步證明固定化脂肪酶的應(yīng)用潛力。