狄傳遠(yuǎn),付道斌,陳 晨,劉 偉*

(1.揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院,江蘇揚(yáng)州 225009;2.江蘇高校動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇揚(yáng)州 225009)

沙門氏菌(Salmonella)屬腸桿菌科人獸共患革蘭氏陰性菌,其感染可以引起人和動(dòng)物的傷寒、副傷寒、胃腸炎和敗血癥,還可以造成懷孕母畜發(fā)生流產(chǎn),導(dǎo)致畜禽死亡,還會(huì)因畜禽生長遲緩、產(chǎn)量下降等原因造成重大經(jīng)濟(jì)損失。沙門氏菌也是人類食物中毒的主要病原之一,具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義[1]。目前,已確認(rèn)2 500多個(gè)沙門氏菌血清型,據(jù)估計(jì)每年沙門氏菌會(huì)引起9 300萬例腸道感染,導(dǎo)致15.5萬人死亡[2]。沙門氏菌致病性是由于大量毒力相關(guān)因子相互作用的結(jié)果從而導(dǎo)致機(jī)體感染,而這些與沙門氏菌毒力相關(guān)的因子主要分布在毒力島、毒性質(zhì)粒和菌毛等。沙門氏菌毒力基因存在其染色體和質(zhì)粒中,在沙門氏菌染色體中編碼毒力相關(guān)基因的特定區(qū)域被稱為沙門氏菌致病島(Salmonellapathogenicity island,SPI),含有許多與毒力相關(guān)的基因,還編碼與細(xì)菌侵襲力直接相關(guān)的Ⅲ型分泌系統(tǒng)(type Ⅲ secretion system,T3SS)[3]。T3SS是一種針狀結(jié)構(gòu),將效應(yīng)蛋白注入宿主細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)。SPI-1參與沙門氏菌入侵非吞噬細(xì)胞,而SPI-2則與沙門氏菌在宿主吞噬細(xì)胞中的生存和增殖有關(guān)[4]。當(dāng)沙門氏菌通過受污染的水或食物進(jìn)入宿主時(shí),它們會(huì)侵入宿主的胃腸上皮,并釋放由SPI編碼的效應(yīng)蛋白。這些細(xì)菌效應(yīng)物會(huì)改變宿主肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu),從而激活宿主的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,導(dǎo)致宿主上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜增大和皺折。這種改變的宿主細(xì)胞會(huì)以吞噬細(xì)胞的形式吞噬沙門氏菌,隨后由細(xì)胞膜組成的液泡將沙門氏菌包圍[5]。

沙門氏菌在從口腔到小腸的過程中會(huì)遇到各種環(huán)境變化,包括溫度、pH、滲透壓、營養(yǎng)物質(zhì)的變化,以及宿主免疫反應(yīng)的生化變化。而沙門氏菌則使用一個(gè)雙組分系統(tǒng)來調(diào)節(jié)與其毒力和生存相關(guān)的基因的表達(dá),從而適應(yīng)環(huán)境變化。這個(gè)雙組分系統(tǒng)由識別外部信號的組氨酸激酶和起轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的反應(yīng)調(diào)節(jié)器組成。當(dāng)組氨酸激酶被自動(dòng)磷酸化時(shí),這些磷酸化基團(tuán)隨后被轉(zhuǎn)移到反應(yīng)調(diào)節(jié)器上。磷酸化的反應(yīng)調(diào)節(jié)器隨后被激活并與DNA結(jié)合以調(diào)節(jié)蛋白轉(zhuǎn)錄[6]。細(xì)菌可以通過適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄和翻譯來識別和適應(yīng)變化的環(huán)境。然而,細(xì)菌的響應(yīng)性適應(yīng)是耗時(shí)和耗能的。相對而言,翻譯后修飾可以更快地調(diào)節(jié)細(xì)菌的生理功能。

翻譯后修飾(PTMs)是蛋白質(zhì)中氨基酸殘基共價(jià)修飾的生化機(jī)制。質(zhì)譜等新的試驗(yàn)技術(shù)幫助確定了大量的PTM位點(diǎn),并揭示了各種修飾的重要性。目前,已鑒定出200多種不同類型的翻譯后修飾,包括從小的化學(xué)修飾(例如磷酸化和乙?；?到添加完整的蛋白質(zhì)(例如泛素化)。對于某一種蛋白質(zhì),不同的PTM可以組合在一起,它們的開關(guān)狀態(tài)在不同的條件下會(huì)有所不同,從而微調(diào)它們的活性、定位以及與其他蛋白質(zhì)的相互作用。

賴氨酸是一種帶有疏水側(cè)鏈的兩親性殘基,具有一個(gè)正電荷的N?基團(tuán)。賴氨酸的?；饔弥泻土税被恼姾?可能會(huì)改變蛋白質(zhì)的構(gòu)象。目前已鑒定出多種?；?但是研究最多的賴氨酸酰化修飾是乙?；?。這種修飾首先在組蛋白上被發(fā)現(xiàn)。后來,更多的真核非組蛋白被鑒定可以發(fā)生乙?；＿@些乙?；瘏⑴c細(xì)胞代謝、細(xì)胞周期、衰老、生長、血管生成和癌癥[7]。相比之下,原核生物中的乙?；芯枯^少,有限的研究主要集中在少數(shù)微生物物種上。在這篇綜述中,我們主要集中在蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式之一乙?；c沙門氏菌感染的關(guān)系。

1 沙門氏菌中的賴氨酸乙酰化系統(tǒng)

沙門氏菌有兩種類型的蛋白質(zhì)賴氨酸乙?；到y(tǒng)。第1種是酶系統(tǒng),其中蛋白質(zhì)賴氨酸殘基被蛋白質(zhì)乙酰轉(zhuǎn)移酶(protein acetyltransferase,Pat)乙?；痆8]。GNAT(gcn5-related N-acetyltransferase)家族是重要的賴氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(lysine acetyltransferase,KATs)之一,是大多數(shù)細(xì)菌KATs的組成部分[9]。Pat屬于GNATs家族,以乙酰輔酶A為底物。它的首次報(bào)道發(fā)現(xiàn)Pat與依賴NAD+的去乙酰化酶CobB一起調(diào)節(jié)乙酰輔酶A合成酶的活性[10-11]。第2種類型的蛋白質(zhì)賴氨酸乙?；w系依靠乙酰磷酸(acetyl phosphate,ACP)的非酶反應(yīng)。ACP是參與Pta-AckA途徑的高能中間體,可以提供磷酸基和乙?；鵞12]。通過敲除AckA基因獲得的ACP過量的突變體與通過同時(shí)敲除Pta和AckA基因獲得的ACP生產(chǎn)缺陷的突變體之間的比較表明,ACP可以乙?；S多蛋白質(zhì)[9]。

2 乙?；€(wěn)態(tài)對細(xì)菌耐酸性的影響

一般情況下,腸道病原體鼠傷寒沙門氏菌必須在胃的強(qiáng)酸性環(huán)境中生存,直到它們能夠進(jìn)一步侵入腸道上皮和其他器官,包括脾臟和肝臟。耐酸性對于巨噬細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的生存和復(fù)制是必要的,而破壞參與酸反應(yīng)調(diào)控的基因則會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌毒性的衰減。因此,沙門氏菌對酸性環(huán)境的感知和反應(yīng)能力對其毒力和致病作用至關(guān)重要。酸脅迫可以全面下調(diào)乙酰化水平,RNA轉(zhuǎn)錄組圖譜顯示,酸脅迫信號可能通過調(diào)控Pat的轉(zhuǎn)錄和細(xì)胞內(nèi)NAD+/NADH的比例來降低乙?；?。該研究構(gòu)建了沙門氏菌株的Pat突變體和CobB突變體,與野生型菌株在對數(shù)期和生長靜止期比較耐酸性相比,酸脅迫的突變菌株中會(huì)下調(diào)Pat的正調(diào)節(jié)因子基因CyaA和Crp的轉(zhuǎn)錄水平,同時(shí)與酸脅迫下的野生型菌株和CobB缺失株相比,Pat突變株的細(xì)胞內(nèi)pH更穩(wěn)定,并顯示出更高的存活率[13]。這些研究表明,較低的乙?；接欣谠鰪?qiáng)沙門氏菌的耐酸性,并提示乙?；赏ㄟ^促進(jìn)耐酸性來調(diào)節(jié)病原在腸道中的毒力水平。

3 乙?；{(diào)節(jié)沙門氏菌致病性島1(SPI-1)調(diào)節(jié)因子HilD的活性和穩(wěn)定性

沙門氏菌通過表達(dá)SPI-1編碼T3SS-1基因以穿透宿主上皮細(xì)胞。在T3SS-1基因中,SPI-1編碼關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子,如HilD、HilA和InvF。HilD是一種AraC型顯性調(diào)控因子,不僅影響HilA的轉(zhuǎn)錄,還影響SPI-1以外的許多基因的轉(zhuǎn)錄[4,14]。研究表明,乙?；投玖χg關(guān)系的其他直接證據(jù)是來自沙門氏菌Pat缺失株的毒力表型[15]。Pat的缺失減少了SPI-1的表達(dá),降低了沙門氏菌對HeLa細(xì)胞的侵襲,并削弱了沙門氏菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。在小鼠模型中,盡管CobB缺失株似乎沒有毒力缺陷,但與野生型相比,Pat缺失株的毒力有所減弱。乙?；嚓P(guān)的毒力調(diào)節(jié)可能是由在SPI-1內(nèi)占據(jù)調(diào)控級聯(lián)的頂端位置的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子HilD介導(dǎo)的。此外,Pat對HilD的乙酰化保障了HilD的穩(wěn)定性,這對SPI-1的激活是必不可少的。賴氨酸297(K297)是Pat的底物殘基,位于HilD的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋基序中。有研究證明K297的乙?；鰪?qiáng)了HilD的穩(wěn)定性,但降低了它與DNA結(jié)合的能力。與K297去乙?；纳抽T氏菌相比,K297乙?；纳抽T氏菌在HeLa細(xì)胞中的侵襲性減弱,在小鼠模型中的毒力減弱,這表明K297的去乙?；瘜ι抽T氏菌的毒力是必不可少的[16]。因此,賴氨酸殘基K297的乙?；日{(diào)節(jié)了HilD的蛋白穩(wěn)定性,又調(diào)節(jié)了其與DNA的結(jié)合能力。這種新的調(diào)控機(jī)制維持了細(xì)胞中適量的HilD的數(shù)量和活性,因?yàn)榇罅康腍ilD不利于細(xì)菌在宿主細(xì)胞內(nèi)的生長,而適當(dāng)?shù)娜ヒ阴；腍ilD保證了其與DNA的結(jié)合活性,從而提高了細(xì)菌的致病性。然而,乙?；{(diào)節(jié)HilD的穩(wěn)定性的潛在機(jī)制仍未被完全闡明。

4 乙?；{(diào)節(jié)Phop/PhoQ的活性以影響毒力基因的表達(dá)

細(xì)菌使用多種雙組分系統(tǒng)來識別外部環(huán)境信號,并調(diào)節(jié)各種基因的表達(dá)以適應(yīng)這些信號。其中雙組分系統(tǒng)PhoP/PhoQ是由位于細(xì)菌細(xì)胞膜上的組氨酸激酶PhoQ和在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮作用的反應(yīng)調(diào)節(jié)因子PhoP組成[6]。在宿主巨噬細(xì)胞中,當(dāng)細(xì)胞膜上的PhoQ組氨酸激酶接收到低鎂離子濃度、酸性應(yīng)激和抗菌肽等信號時(shí),它會(huì)自磷酸化并被激活。隨后自磷酸化的PhoQ會(huì)引起細(xì)胞質(zhì)中的PhoP響應(yīng)調(diào)節(jié)器的磷酸化。磷酸化的PhoP通過與靶基因啟動(dòng)子結(jié)合來啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄,以促進(jìn)RNA聚合酶的募集,調(diào)節(jié)約5%的鼠傷寒沙門氏菌基因的轉(zhuǎn)錄[17]。已知PhoP/PhoQ系統(tǒng)可調(diào)節(jié)諸如鼠疫耶爾森氏菌、銅綠假單胞菌以及沙門氏菌等革蘭氏陰性病原體毒力基因的表達(dá)[18-20]。而PhoP/PhoQ在發(fā)揮作用時(shí)受到各種因素的影響,例如在弱酸條件下RNA伴侶CspC會(huì)促進(jìn)PhoP的激活[21];甲基轉(zhuǎn)移酶CheR通過對PhoP的甲基化負(fù)調(diào)控來調(diào)節(jié)其活性[22];抑制蛋白 EIIANtr通過干擾 PhoP 與 DNA 的結(jié)合來阻礙 PhoP對其調(diào)節(jié)基因的激活[23]。此外,一項(xiàng)沙門氏菌PhoP的研究表明乙酰化在沙門氏菌毒力中起著重要作用。PhoP可以分別被Pat和CobB乙?；腿ヒ阴；?。尤其是位于PhoP 羧基端DNA結(jié)合域的賴氨酸201(K201)能夠被Pat乙酰化。當(dāng)沙門氏菌處于低濃度Mg2+、酸脅迫環(huán)境或由于宿主細(xì)胞吞噬而出現(xiàn)在巨噬細(xì)胞中時(shí),PhoP的K201乙酰化水平迅速下降。當(dāng)沙門氏菌缺失Pat基因后,PhoP與DNA的結(jié)合活性增加。此外,與野生型菌株相比,用谷氨酰胺替代賴氨酸201殘基來模擬乙?；癄顟B(tài)可降低細(xì)菌的致病性[24]。這些結(jié)果表明PhoP的 DNA結(jié)合域的賴氨酸乙?；种屏似渑cDNA的結(jié)合活性,從而抑制了其對沙門氏菌致病基因表達(dá)的促進(jìn)作用。

有研究表明,無論在革蘭氏陽性菌還是革蘭氏陰性菌中,PhoP受體結(jié)構(gòu)域中的賴氨酸102殘基(K102)都是保守的。但在富含乙酰磷酸(ACP)的條件下,鼠傷寒沙門氏菌的PhoP中共有5個(gè)賴氨酸殘基可以乙?；?其中包括賴氨酸102。該殘基的乙酰化反應(yīng)依賴于ACP的劑量,而不依賴于Pat和CobB。當(dāng)賴氨酸102殘基被乙?；瘯r(shí),PhoP在體外不被磷酸化。同時(shí)模仿非乙?；问降腜hoP K201R突變體,發(fā)現(xiàn)PhoP能夠與DNA結(jié)合,并上調(diào)PhoP和PhoP靶基因。在用精氨酸取代PhoP K201和K102的菌株中,PhoP和PhoP靶基因的轉(zhuǎn)錄減少[17,24]。因此,可以認(rèn)為ACP介導(dǎo)的PhoP K102乙?；?通過終止PhoP活性所必需的PhoP磷酸化來降低沙門氏菌毒力基因的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn),PhoP 的一個(gè)高度保守的賴氨酸殘基K88可以被ACP而非Pat特異性乙?；?這削弱了PhoP的二聚體形成并抑制其與DNA結(jié)合的能力,從而影響PhoP的活性并導(dǎo)致沙門氏菌毒力的減弱[25]。這些研究都表明沙門氏菌的毒力可以被在PhoP的賴氨酸殘基處的乙酰化所影響,而且未來可能會(huì)發(fā)現(xiàn)更多的賴氨酸殘基位點(diǎn)影響沙門氏菌的毒力。

5 某些轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子的賴氨酸乙?；瘜ι抽T氏菌毒力的影響

鼠傷寒沙門氏菌中的Lon蛋白酶可以引起入侵蛋白的水解和毒力的負(fù)調(diào)節(jié)。Lon是一種應(yīng)激誘導(dǎo)的依賴ATP的蛋白酶,是HilD的負(fù)調(diào)控因子[26]。并且有研究通過質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn),HilD的賴氨酸23、34和132位點(diǎn)是部分乙?；?而HilD的賴氨酸297是完全乙酰化的。此外,用谷氨酰胺取代HilD的賴氨酸297(模擬乙?；问?會(huì)影響沙門氏菌對HeLa細(xì)胞的入侵,導(dǎo)致HilD與DNA的結(jié)合活性存在缺陷[16]。因此,乙?；腍ilD無法與DNA結(jié)合從而降低沙門氏菌的毒力,但Lon蛋白酶是否參與到HilD的乙?；^程來調(diào)節(jié)入侵蛋白的水解和毒力還有待進(jìn)一步探索。

還有其他轉(zhuǎn)錄因子,如Lrp和RcsB也受到乙酰化的影響[27-28]。Lrp是一個(gè)全局性的調(diào)控因子,大概參與大腸埃希氏菌10%的基因表達(dá)。在鼠傷寒沙門氏菌中,它調(diào)節(jié)編碼Ⅰ型菌毛的薄膜操縱子,會(huì)刺激細(xì)菌和腸道細(xì)胞之間的結(jié)合,從而促進(jìn)其致病性[29]。有研究證實(shí)鼠傷寒沙門氏菌的Lrp在體外可以分別被Pat和CobB乙酰化和去乙?；?乙酰化位點(diǎn)是其DNA結(jié)合域的螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋(HTH)基序中的第36個(gè)賴氨酸(K36)殘基。它的乙?；种屏似渑cDNA的結(jié)合,減少了Lrp調(diào)控基因(菌毛)的轉(zhuǎn)錄,從而削弱了沙門氏菌的致病性。RcsB是一種反應(yīng)調(diào)節(jié)因子和轉(zhuǎn)錄因子,通過與RcsC和RcsD形成一個(gè)雙組分系統(tǒng)來調(diào)節(jié)腸桿菌科的基因轉(zhuǎn)錄[30]。當(dāng)細(xì)菌收到外部信號時(shí),RcsC發(fā)生自磷酸化;然后RcsC上的磷酸基通過RcsD傳遞到RcsB。磷酸化的RcsB與其共激活子RcsA或轉(zhuǎn)錄因子BglJ和GadE形成一個(gè)同源二聚體或多個(gè)異源二聚體,以控制150多個(gè)大腸埃希氏菌基因[30]。有研究證實(shí)位于與DNA結(jié)合的HTH基序中的RcsB的第180個(gè)賴氨酸(K180)殘基被沙門氏菌乙酰轉(zhuǎn)移酶Pat和大腸埃希氏菌同系物YfiQ乙?；?并在體外被CobB去乙?；?。但Pat對RcsB 上的K180的乙?；强赡娴?可以改變DNA結(jié)合活性,從而影響相關(guān)毒力基因表達(dá)[31]。這些乙?；稽c(diǎn)的發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步解釋了沙門氏菌感染后毒力調(diào)節(jié)的機(jī)制,說明這些修飾位點(diǎn)是相關(guān)藥物研制的重要參考。

6 展望

在包括沙門氏菌在內(nèi)的許多細(xì)菌中,乙?；且环N翻譯后動(dòng)態(tài)修飾過程,可以控制蛋白質(zhì)的酶活性、亞細(xì)胞定位、蛋白質(zhì)之間的相互作用、蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性以及DNA結(jié)合活性。賴氨酸乙酰化是各種乙?；问街醒芯孔钌钊氲摹１疚膹钠鋵Φ鞍踪|(zhì)功能影響的角度,綜述了賴氨酸乙?；瘜ι抽T氏菌基因表達(dá)的調(diào)控及其毒力的影響。由于酸性環(huán)境對沙門氏菌的毒力和致病作用很重要,所以在對由沙門氏菌引起的相關(guān)疾病的治療中可以根據(jù)這一特點(diǎn)來抑制其生長,但是在酸性環(huán)境中沙門氏菌是否還會(huì)通過非酶途徑來影響自身的耐酸性還有待進(jìn)一步探索。另外,無論是依賴于Pat還是依賴于ACP的賴氨酸乙酰化都能抑制相關(guān)蛋白質(zhì)活性從而影響其致病性。通過以上的分析發(fā)現(xiàn)細(xì)菌毒力是一個(gè)非常復(fù)雜的表型,這其中涉及到多種因素,無法通過單個(gè)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾來解釋。未來的研究可能會(huì)發(fā)現(xiàn)其他調(diào)節(jié)毒力因子活性的翻譯后修飾。

目前,一些與毒力相關(guān)的蛋白質(zhì),包括PhoP和HilD,已經(jīng)被證明可以發(fā)生乙?；?。這些研究表明蛋白質(zhì)乙?；诩?xì)菌毒力中起著重要的作用。然而,還需要更多的研究來揭示蛋白質(zhì)乙?；瘜?xì)菌毒力的影響和探索相關(guān)修飾位點(diǎn)與其致病性的關(guān)系,并解釋蛋白質(zhì)乙酰化調(diào)節(jié)細(xì)菌毒力的潛在機(jī)制,為今后研究治療由沙門氏菌引起相關(guān)疾病的藥物提供理論支撐。