董 浩,張樂穎,左 琴,董青花,朱婉月,劉佐民,梁春南

(中國食品藥品檢定研究院 國家嚙齒類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源庫,北京 102629)

兔出血癥(Rabbit hemorrhagic disease,RHD)又稱兔瘟、兔出血性肺炎,是由杯狀病毒科(Caliciviridae)兔出血癥病毒屬(Lagovirus)兔出血癥病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)引起兔的一種急性、敗血性、高度致死性傳染病,該病于1984年首次在我國江蘇無錫等地暴發(fā)[1]。兔出血癥2型(Rabbit hemorrhagic disease type 2,RHD2)又稱兔瘟2型,是由兔出血癥病毒2型(Rabbit hemorrhagic disease virus type 2,RHDV2)引起的危害家兔和野兔的一種新型高度傳染性、急性致死性疫病,該病是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(WOAH)法定通報(bào)疫病。2022年6月農(nóng)業(yè)農(nóng)村部修訂發(fā)布的最新版本的《一、二、三類動(dòng)物疫病病種名錄》中,將兔出血癥列為二類動(dòng)物疫病。

RHDV2與RHDV的主要不同之處在于,RHDV主要引起成年家兔感染,而RHDV2感染的宿主范圍更廣,不僅可以感染成年家兔和幼年家兔,而且對(duì)多個(gè)品種的野兔造成感染。此外,RHDV的病死率可高達(dá)80%～90%,而RHDV2的病死亡稍低,但其跨度較大。

1 國內(nèi)外流行情況

RHD2于2010年4月在法國首次發(fā)現(xiàn),隨后RHD2呈現(xiàn)出向外蔓延趨勢(shì),意大利、西班牙、德國、葡萄牙、英國、挪威等多數(shù)西歐國家和亞速爾群島,以及北非和南非一些國家陸續(xù)報(bào)道了該病的發(fā)生[2-3]。自從2016年傳入加拿大的魁北克以來,在北美洲地區(qū)發(fā)生了多起RHD2疫情。2018-2021年,美國的華盛頓、俄亥俄州、加利福尼亞州、以及紐約等地區(qū)發(fā)生了多起疫情。該病在美國已經(jīng)呈現(xiàn)出擴(kuò)散勢(shì)態(tài)[4]。2019年5月,日本愛媛縣暴發(fā)了首起RHD2疫情,10只1～2歲的兔在2周內(nèi)陸續(xù)死亡[5]。2020年9月,新加坡從發(fā)病的歐洲兔群中首次分離到RHDV2病毒[6]。

2020年4月,我國四川省首次出現(xiàn)疑似病例,經(jīng)多種檢測(cè)方法最終確定病原為RHDV2[7-8]。2020年5月21日,我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜牧獸醫(yī)局發(fā)布消息稱,四川成都金堂縣2個(gè)養(yǎng)兔場(chǎng)發(fā)生兔出血癥疫情,經(jīng)四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心確診為兔出血癥2型。根據(jù)四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心2020-2021年對(duì)兔場(chǎng)中RHDV2的流行病學(xué)調(diào)查顯示,2020年監(jiān)測(cè)的432個(gè)規(guī)模場(chǎng),場(chǎng)點(diǎn)陽性率為8.56%,而2021年監(jiān)測(cè)了273個(gè)規(guī)模場(chǎng),場(chǎng)點(diǎn)陽性率已經(jīng)到達(dá)了39.93%,這說明RHDV2已經(jīng)在四川省流行[9]。2021年初,河南省某地區(qū)一兔場(chǎng)出現(xiàn)患病家兔急性死亡病例,經(jīng)鑒定也是發(fā)生了RHDV2感染,基于VP60基因的核苷酸序列測(cè)序和遺傳進(jìn)化分析表明該流行株與國內(nèi)首株分離株SC2020/04的相似性高達(dá)98.2%[10],由此可見RHDV2已在我國的多個(gè)省份發(fā)生了流行。

2 病原學(xué)

對(duì)兔出血癥病毒毒株的系統(tǒng)發(fā)育分析表明,存在3個(gè)不同的類群,從1984年起分離出基因類群G1-G5的“經(jīng)典RHDV”,1996年鑒定出的抗原變體RHDVa /G6,以及2010年鑒定出的RHDV2。其中,RHDV和RHDVa是系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)的,二者的致病性無差別,但是呈現(xiàn)出不同的抗原性和遺傳差異,目前市售的疫苗對(duì)RHDV和RHDVa具有優(yōu)良的保護(hù)力[11]。然而RHDV2與RHDV/RHDVa衣売蛋白VP60的核苷酸多樣性差異超過15%,我國的RHDV疫苗無法對(duì)RHDV2提供足夠有效的保護(hù)力。

RHDV2無囊膜,病毒結(jié)構(gòu)呈20面體對(duì)稱結(jié)構(gòu),病毒顆粒直徑為32～44 nm。RHDV2為單股正鏈RNA病毒,基因組全長(zhǎng)為7 442 bp,長(zhǎng)于經(jīng)典RHDV。RHDV2與RHDV基因組結(jié)構(gòu)完全相同,核苷酸一致性達(dá)82.4%,RHDV2基因組包含2個(gè)開放閱讀框,即ORF1和ORF2,其中ORF1編碼1個(gè)多聚蛋白,該多聚蛋白由病毒編碼的蛋白酶酶解成多個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白p16、p23、p29、2C樣蛋白、3C樣蛋白、VPg、RNA依賴RNA聚合酶(RdRp)和結(jié)構(gòu)蛋白VP60,ORF2編碼衣殼蛋白VP10[12]。其中RHDV2的VP60蛋白是建立該病原分子診斷方法和血清學(xué)診斷方法的主要靶標(biāo),目前已經(jīng)有較多相關(guān)的研究報(bào)告[13-15]。

我國首次發(fā)生RHD2疫情的2個(gè)兔場(chǎng)中分離的RHDV2毒株的VP60基因核苷酸序列與荷蘭RHDV2分離株RHDV2-NL2016同源性最高,分別為98.01%和97.95%。與經(jīng)典型RHDV毒株的同源性為79.0%～80.0%,親緣關(guān)系較遠(yuǎn)[16]。

2020-2021年,李麗等[9]對(duì)四川省收集的12份陽性樣品的RHDV2 VP60基因序列進(jìn)行了測(cè)序分析,發(fā)現(xiàn)12份陽性樣品的VP60基因序列與我國首起RHD2疫情的分離株RHDV2 SC2020-04株單獨(dú)成簇,與國內(nèi)外參照毒株的VP60基因核苷酸序列同源性為93.7%～100%。通過系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn),國內(nèi)RHDV2分離株流行時(shí)期不同,所處的分支也不同,提示RHDV2毒株在我國很可能隨著時(shí)間和地區(qū)的改變出現(xiàn)新的變異現(xiàn)象。

3 理化特性

對(duì)于RHDV2的理化特性的研究比較有限。根據(jù)世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(WOAH)公布數(shù)據(jù)顯示,RHDV/RHDVa可以在50℃下存活1 h,對(duì)反復(fù)凍融具有抗性;pH4.5～10.5時(shí)穩(wěn)定,pH3.0的環(huán)境下可存活,而pH>12時(shí)病毒會(huì)失活;10 mg/mL的氫氧化鈉、10～20 mL/L的福爾馬林、酚類消毒劑(One-stroke Environ?)、5 mg/mL的次氯酸鈉都可以滅活病毒,乙醚、氯仿和胰蛋白酶處理不會(huì)影響病毒的傳染性。《陸生動(dòng)物衛(wèi)生法典》中推薦使用30 mL/L的福爾馬林進(jìn)行皮毛的消毒。在4℃用10～14 mg/mL甲醛或2～5 mL/L丙內(nèi)酯處理可使病毒失去活性,而保留免疫原性,適用于疫苗生產(chǎn)。

RHDV/RHDVa病毒可能在冷藏或冷凍兔肉、動(dòng)物尸體中存活數(shù)月。在4℃的組織懸浮液中可以存活7個(gè)月以上。室溫下,干燥布匹上可以存活至少3個(gè)月。22℃時(shí),在動(dòng)物尸體中可以存活20 d。60℃的組織懸浮液或者干燥狀態(tài)下的病毒,可以存活至少2 d。由于WOAH尚未公布RHDV2的理化特性數(shù)據(jù),且RHDV2的相關(guān)研究比較有限,RHDV/RHDVa的相關(guān)數(shù)據(jù)具有一定的參考價(jià)值。

陳婉婷等[17]用PMA-RT-qPCR技術(shù)研究了不同pH、不同溫度、常用獸用消毒劑、不同濃度甲醛與RHDV2共同作用后,對(duì)病毒活性的影響(表1)。RHDV2的活性隨pH降低或升高而降低;83℃處理5 min后,病毒殺滅率可達(dá)95.10%;聚維酮碘對(duì)RHDV2殺滅作用最好,作用30 min后,病毒殺滅率達(dá)88.78%;3 mg/mL甲醛作用30 min后殺滅率可達(dá)82.22%。

表1 RHDV2在不同理化條件下的存活能力

4 流行病學(xué)

4.1 傳染源

感染了RHDV2的家兔和野兔為RHD2的主要傳染源。

4.2 易感動(dòng)物

對(duì)于6～8周齡以下的動(dòng)物,典型的RHDV/RHDVa通常呈亞臨床的感染,而RHDV2可以感染15日齡以上的家兔和野兔。在易感動(dòng)物種類方面,除家兔外,撒丁海角兔(L.capensisvarmediterraneus)、意大利野兔(L.corsicanus)、歐洲褐兔(L.europaeus)和山地野兔(L.timidus)等品種的野兔均對(duì)RHDV2易感。

4.3 傳播途徑

通過口腔、鼻腔或結(jié)膜途徑直接接觸受感染動(dòng)物,感染動(dòng)物的尸體以及被污染的飼料、墊料和水等均可造成感染。野生動(dòng)物和蒼蠅等昆蟲也是病毒的機(jī)械傳播媒介。在動(dòng)物感染試驗(yàn)中,可以通過口腔、鼻腔、皮下、肌肉或靜脈注射等途徑進(jìn)行攻毒。值得注意的是,因?yàn)橥醚褐械牟《驹诘蜏乇４娴耐萌庵锌梢蚤L(zhǎng)時(shí)間保持感染性,進(jìn)口受感染的兔肉是該病跨境傳播的重要途徑。

Qi R等[18]首次報(bào)道了人工感染RHDV2的兔精液中可檢測(cè)到高濃度的病毒核酸。進(jìn)一步對(duì)暴發(fā)RHD2疫情養(yǎng)殖場(chǎng)附近市場(chǎng)中售賣的兔凍精產(chǎn)品進(jìn)行檢測(cè),從10份凍精樣品中7份檢出RHDV2病毒核酸,由此推斷兔精液也是RHDV2傳播的重要途徑。

5 臨床癥狀

根據(jù)病程的不同,可以分為最急性型、急性型、亞急性型和慢性型。最急性型發(fā)病時(shí)通常沒有臨床癥狀,主要的臨床表現(xiàn)出現(xiàn)在急性感染的動(dòng)物,亞急性型的特征類似于急性型但癥狀相對(duì)較溫和。根據(jù)病原體的類型,潛伏期在1～5 d之間。在出現(xiàn)發(fā)熱(>40℃)癥狀后12～36 h發(fā)生死亡。在此階段,可以觀察到各種臨床癥狀,例如厭食、呆滯、反應(yīng)遲鈍、虛脫、神經(jīng)癥狀(抽搐、共濟(jì)失調(diào)、癱瘓、角弓反張、劃水狀)、尖叫、呼吸癥狀(呼吸困難、鼻孔流出帶血的泡沫)和黏膜發(fā)紺。

在疫情暴發(fā)期間,若病原為RHDV/RHDVa則有5%～10%比例被感染動(dòng)物可能表現(xiàn)為慢性或亞臨床癥狀,其特征為嚴(yán)重的全身性黃疸、體重減輕和嗜睡,這些動(dòng)物通常會(huì)在1～2周后死亡,部分存活下來的動(dòng)物會(huì)出現(xiàn)抗體陽轉(zhuǎn)。如果病原為RHDV2,發(fā)生慢性或亞臨床癥狀的比例要顯著增加。

與經(jīng)典RHDV/RHDVa相比,RHDV2有與之相似的病變特征,即呼吸道出血和實(shí)質(zhì)臟器水腫、出血、淤血。兩者的不同之處在于,RHDV/RHDVa主要引起成年家兔感染,而RHDV2的感染宿主范圍更廣,不但感染成年家兔,還會(huì)感染15～20日齡幼年家兔。此外,經(jīng)典RHDV/RHDVa的死亡率可高達(dá)80%～90%,而RHDV2型的死亡率稍低,但其跨度較大(5%～70%)。表2中展示了使用我國RHDV2分離株SC20-01人工感染SPF級(jí)新西蘭白兔后,不同組織和體液中病毒的載量[18]。

表2 RHDV2感染新西蘭白兔后不同組織的病毒載量

6 剖檢病變

RHDV2感染引起的兔出血癥以實(shí)質(zhì)器官出血、淤血為主要特征。肝臟呈黃棕色,質(zhì)脆和變性。氣管黏膜充血,含有大量泡沫液體,肺部水腫和充血。脾臟腫大,邊緣變鈍。彌漫性血管內(nèi)凝血通常是患病動(dòng)物出現(xiàn)多種器官出血和猝死的原因。在亞急性和慢性病例中,耳朵、結(jié)膜和皮下組織明顯出現(xiàn)黃疸變色。

7 診斷方法

目前尚無合適的細(xì)胞系用于RHDV2的分離培養(yǎng),只能采用接種試驗(yàn)兔的方式進(jìn)行病毒的分離、傳代和確定傳染能力。用RHDV2發(fā)病死亡兔的100 mg/mL的肝勻漿液,通過頸部皮下注射成功感染25日齡仔兔和4月齡成年兔。感染的試驗(yàn)兔72 h內(nèi)全部死亡,剖檢和實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)均證明上述試驗(yàn)兔死于RHDV2感染[19]。用RHDV2發(fā)病死亡兔的100 mg/mL肝勻漿液,通過肌肉注射感染了5只1月齡的SPF級(jí)試驗(yàn)兔,18～24 h內(nèi)試驗(yàn)兔也全部死亡[20]。死亡試驗(yàn)兔的臨床癥狀和剖檢變化與發(fā)病兔場(chǎng)中的死亡病例類似,對(duì)人工感染動(dòng)物進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室檢測(cè),也均為RHDV2陽性。

病原學(xué)檢測(cè)技術(shù)方面,《陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗手冊(cè)》中推薦了RHDV的通檢方法和專門針對(duì)RHDV2的RT-PCR方法。用RT-PCR可以在多種器官、尿液、糞便或血清中檢測(cè)到病毒的RNA。其中,肝臟是病毒載量最高的器官,其次是脾臟。在慢性或亞急性感染的兔中,可能在脾臟中比肝臟中更容易檢測(cè)到病毒。針對(duì)RHDV2的VP60序列建立了多種RT-PCR檢測(cè)方法和雙重RT-PCR方法[21-23],用于對(duì)RHDV和RHDV2進(jìn)行鑒別檢測(cè)。除此PCR類檢測(cè)方法外,血凝試驗(yàn)、免疫電鏡、病毒捕獲ELISA、免疫染色以及Western blot也是WOAH推薦的病原檢測(cè)方法。

血清學(xué)檢測(cè)技術(shù)方法,《陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)和疫苗手冊(cè)》推薦血凝抑制試驗(yàn)、間接ELISA和競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法應(yīng)用于RHDV、RHDVa和RHDV2自然感染或者免疫抗體的測(cè)定。

中國畜牧業(yè)協(xié)會(huì)團(tuán)體標(biāo)準(zhǔn)《兔病毒性出血癥2型診斷技術(shù)規(guī)程》(T/CAAA 028-2019)中規(guī)定了應(yīng)用于RHDV2檢測(cè)的紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)、RT-PCR、免疫印跡等病原學(xué)診斷方法,以及紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)和競(jìng)爭(zhēng)ELISA等血清學(xué)診斷方法[24]。目前在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物領(lǐng)域的限行標(biāo)準(zhǔn)中,只有《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 兔出血癥病毒檢測(cè)方法》GB/T 14926.21-2008中規(guī)定了RHDV/RHDVa的抗原和抗體檢測(cè)方法,尚缺乏RHDV2檢測(cè)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

8 防控措施

我國用RHDV/RHDVa疫苗已經(jīng)對(duì)RHDV感染實(shí)現(xiàn)了有效的控制。但是,RHDV/RHDVa疫苗對(duì)于RHDV2沒有交叉保護(hù)力[25]。目前在世界范圍內(nèi),法國和西班牙已經(jīng)注冊(cè)了預(yù)防RHDV2感染的疫苗,而我國國內(nèi)尚無針對(duì)RHDV2的商業(yè)化疫苗。嚴(yán)格控制動(dòng)物引種,應(yīng)從無RHDV2病原感染的養(yǎng)殖場(chǎng)購買活兔,加強(qiáng)活兔調(diào)運(yùn)檢驗(yàn)檢疫,嚴(yán)防病原引入。針對(duì)兔肉制品和兔凍精具有攜帶RHDV2病原進(jìn)行遠(yuǎn)距離傳播的風(fēng)險(xiǎn),相關(guān)部門也應(yīng)該加強(qiáng)對(duì)于這類商品的檢驗(yàn)檢疫工作。加強(qiáng)針對(duì)RHDV2防控知識(shí)的宣傳培訓(xùn),提升廣大從業(yè)者對(duì)該病的知曉率和重視程度。還應(yīng)加強(qiáng)養(yǎng)殖場(chǎng)生物安全防控工作,對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)周圍環(huán)境的蚊蟲進(jìn)行殺滅,人流、物流及車流同樣需要嚴(yán)格控制,防止病毒的機(jī)械攜帶傳播[26]。根據(jù)《中華人民共和國動(dòng)物防疫法》的要求,發(fā)現(xiàn)動(dòng)物感染RHDV2或疑似感染時(shí),應(yīng)當(dāng)立即向所在地農(nóng)業(yè)農(nóng)村主管部門或者動(dòng)物疫病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)報(bào)告,并迅速采取隔離等控制措施,防止動(dòng)物疫情擴(kuò)散[27]。動(dòng)物疫病預(yù)防控制機(jī)構(gòu)也應(yīng)加強(qiáng)對(duì)家兔RHDV2的監(jiān)測(cè)力度,及時(shí)掌握我國不同區(qū)域的RHDV2的流行情況和抗原變異情況,為疫病的防控、診斷試劑和疫苗的研發(fā)提供數(shù)據(jù)支撐。RHDV2病毒在環(huán)境中的存活能力較強(qiáng),一旦出現(xiàn)感染病例,應(yīng)該用病毒敏感的消毒劑對(duì)死亡兔的尸體、污染的籠架、飼料、墊料等進(jìn)行嚴(yán)格消毒和無害化處理,嚴(yán)防病毒擴(kuò)散。

9 小結(jié)

RHD2作為一種高度傳染性、急性致死性疫病,嚴(yán)重危害著家兔養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。自2020年4月RHDV2傳入我國四川省后,在僅2年的時(shí)間已經(jīng)傳播至我國的多個(gè)省份,病原的傳播速度十分驚人。同時(shí),RHDV2的宿主范圍比RHDV和RHDVa更廣,傳播途徑多,在自然環(huán)境下抵抗力強(qiáng),使得該病毒難以被消滅。而當(dāng)前缺乏沒有商品化的疫苗和診斷試劑對(duì)于該病的防控極為不利。因此,相關(guān)部門應(yīng)提高RHDV2防控的重視程度,加大宣傳培訓(xùn)力度,加強(qiáng)科技力量投入,破解RHD2防控的關(guān)鍵技術(shù)瓶頸,有效降低RHDV2對(duì)養(yǎng)兔業(yè)的危害。