吳善博,邵天人,張雅芳,李娟鋒,孫露露,邊嘯坤,王榮軍

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,河南鄭州 450046)

細(xì)胞凋亡(apoptosis)又稱(chēng)程序性細(xì)胞死亡,對(duì)維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[1]。凋亡的發(fā)生是信號(hào)分子通過(guò)多種信號(hào)通路將信息傳遞至細(xì)胞內(nèi),激活關(guān)鍵信號(hào)靶點(diǎn)從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[2]。細(xì)胞凋亡途徑主要包括死亡受體介導(dǎo)的外源性途徑、線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性途徑、顆粒酶/穿孔素介導(dǎo)的途徑以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的途徑[3]。凋亡途徑涉及一系列基因的激活、表達(dá)及調(diào)控,如半胱氨酸蛋白酶(caspase)、凋亡抑制蛋白(IAPs)的激活,microRNAs、Bcl-2家族基因的表達(dá)調(diào)控等,最終使細(xì)胞發(fā)生凋亡[4-6]。

研究表明,腸道寄生性原蟲(chóng)可誘導(dǎo)宿主上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡,如隱孢子蟲(chóng)(Cryptosporidium)感染誘導(dǎo)人膽管上皮細(xì)胞(H69)發(fā)生凋亡;十二指腸賈第蟲(chóng)(Giardiaduodenalis)誘導(dǎo)人回盲腸癌細(xì)胞(HCT-8)發(fā)生凋亡;芽囊原蟲(chóng)(Blastocystis)感染誘導(dǎo)大鼠小腸隱窩上皮細(xì)胞(IEC-6)凋亡等[7-9]。隱孢子蟲(chóng)、十二指腸賈第蟲(chóng)和芽囊原蟲(chóng)等腸道寄生性原蟲(chóng)通過(guò)誘導(dǎo)或抑制宿主上皮細(xì)胞凋亡,從而達(dá)到利于自身發(fā)育的目的,可見(jiàn)寄生蟲(chóng)的生長(zhǎng)、發(fā)育、感染與宿主細(xì)胞凋亡有著重要聯(lián)系[10-12]。寄生性原蟲(chóng)感染宿主腸道時(shí),其腸道屏障被破壞導(dǎo)致腸道穩(wěn)態(tài)紊亂,這時(shí)機(jī)體可通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡機(jī)制以維持腸道穩(wěn)態(tài)平衡,而這種穩(wěn)態(tài)平衡更是寄生蟲(chóng)-宿主相互作用的結(jié)果[12-13]。為進(jìn)一步探索凋亡機(jī)制在寄生蟲(chóng)-宿主間的作用,論文主要對(duì)隱孢子蟲(chóng)、十二指腸賈第蟲(chóng)和芽囊原蟲(chóng)誘導(dǎo)上皮細(xì)胞凋亡機(jī)制做一綜述。

1 隱孢子蟲(chóng)

隱孢子蟲(chóng)是全球分布的重要人畜共患原蟲(chóng),寄生于人和多種動(dòng)物的胃腸道上皮細(xì)胞中。目前已發(fā)現(xiàn)47個(gè)有效種,感染人類(lèi)的蟲(chóng)種約20個(gè),其中以微小隱孢子蟲(chóng)(C.parvum)、人隱孢子蟲(chóng)(C.hominis)最為常見(jiàn)[14-16]。微小隱孢子蟲(chóng)可通過(guò)改變關(guān)鍵緊密連接和黏附連接蛋白的表達(dá)來(lái)破壞腸上皮屏障功能,引起宿主腹瀉[17]。

隱孢子蟲(chóng)主要通過(guò)死亡受體/配體(Fas/FasL)和腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)受體/配體(TRAI/TRAIL)途徑調(diào)控宿主上皮細(xì)胞凋亡[7,18-19]。將微小隱孢子蟲(chóng)感染的H69細(xì)胞和未感染的Fas敏感的人T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞(Jurkat E6-1)共培養(yǎng)24 h,Jurkat E6-1細(xì)胞凋亡率增加,免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)和共聚焦顯微鏡檢測(cè)表明微小隱孢子蟲(chóng)增加FasL的遷移率,誘導(dǎo)其裂解為可溶性FasL,而通過(guò)半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)抑制劑與Fas/FasL中和抗體的作用可抑制該凋亡途徑,表明微小隱孢子感染可以依賴(lài)Fas/FasL途徑的自分泌和旁分泌方式誘導(dǎo)H69細(xì)胞發(fā)生凋亡[7]。另一研究顯示,微小隱孢子蟲(chóng)感染HCT-8細(xì)胞后使護(hù)骨素(OPG)表達(dá)上調(diào),通過(guò)不同濃度TRAIL和OPG重組蛋白處理細(xì)胞可阻斷TRAIL途徑誘導(dǎo)的凋亡并減少蟲(chóng)體感染量[18]。

PI3K/AKT信號(hào)通路和NF-κB信號(hào)通路調(diào)控微小隱孢子蟲(chóng)誘導(dǎo)宿主上皮細(xì)胞凋亡。微小隱孢子蟲(chóng)更易感染營(yíng)養(yǎng)不良的C57BL/6小鼠,且被感染小鼠體重明顯下降;caspase-3蛋白表達(dá)量降低,對(duì)caspase-3蛋白免疫染色,表明凋亡細(xì)胞發(fā)生于腸絨毛頂端;微小隱孢子蟲(chóng)感染營(yíng)養(yǎng)不良小鼠后,可激活PI3K/AKT信號(hào)通路,從而抑制caspase-3活性和細(xì)胞凋亡,進(jìn)而增加宿主感染負(fù)荷[20]。微小隱孢子蟲(chóng)感染細(xì)胞激活NF-κB系統(tǒng),并且伴隨白介素-8(IF-8)的分泌;而抑制劑MG-132和SN50可抑制NF-κB與DNA結(jié)合和降低IF-8的分泌,但顯著促進(jìn)了微小隱孢子蟲(chóng)誘導(dǎo)H69細(xì)胞凋亡;結(jié)果表明微小隱孢子蟲(chóng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡受NF-κB的影響,當(dāng)NF-κB被抑制時(shí),微小隱孢子蟲(chóng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力增加[21]。文獻(xiàn)[19]研究結(jié)果與此一致,微小隱孢子蟲(chóng)通過(guò)抑制NF-κB進(jìn)一步增加腸上皮細(xì)胞凋亡,將微小隱孢子蟲(chóng)體外感染HCT-8細(xì)胞,并加入誘導(dǎo)凋亡藥物進(jìn)行試驗(yàn),微小隱孢子蟲(chóng)顯著降低了這些藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用,表明隱孢子蟲(chóng)可減弱促凋亡因子誘導(dǎo)凋亡的作用,以利于自身的增殖發(fā)育。

Bcl-2基因家族、Survivin基因、及microRNAs等參與調(diào)控微小隱孢子蟲(chóng)感染誘導(dǎo)的宿主上皮細(xì)胞凋亡。隱孢子蟲(chóng)在感染HCT-8細(xì)胞早期(6～12 h)抗凋亡基因表達(dá)上調(diào),促凋亡基因表達(dá)下調(diào);感染后期(24～72 h)促凋亡基因表達(dá)上調(diào),抗凋亡基因表達(dá)下調(diào);而沉默Bcl-2基因后,細(xì)胞凋亡增加,表明Bcl-2基因家族調(diào)控微小隱孢子蟲(chóng)感染誘導(dǎo)的宿主上皮細(xì)胞凋亡[22]。另一研究表明,微小隱孢子蟲(chóng)體外感染HCT-8細(xì)胞可誘導(dǎo)抗凋亡蛋白家族基因Survivin表達(dá)上調(diào),從而抑制caspase-3、caspase-7活性,使細(xì)胞凋亡減弱;但沉默Survivin表達(dá)后,細(xì)胞凋亡又明顯增加,蟲(chóng)體數(shù)量減少;表明微小隱孢子蟲(chóng)感染期間可通過(guò)調(diào)節(jié)Survivin表達(dá),以抑制細(xì)胞凋亡促進(jìn)蟲(chóng)體自身發(fā)育[23]。

微小隱孢子蟲(chóng)感染H69細(xì)胞后通過(guò)下調(diào)miR-513表達(dá)從而促進(jìn)程序性死亡配體-1(B7-H1)表達(dá);與微小隱孢子蟲(chóng)感染的H69細(xì)胞共培養(yǎng)的Jurkat細(xì)胞凋亡率明顯增加;使用B7-H1中和抗體或轉(zhuǎn)染miR-513過(guò)表達(dá)前體后Jurkat細(xì)胞凋亡被部分阻斷,表明miR-513介導(dǎo)B7-H1的表達(dá)參與調(diào)控隱孢子蟲(chóng)感染上皮細(xì)胞凋亡[24]。微小隱孢子感染細(xì)胞后通過(guò)miR-942-5p靶向調(diào)控干擾素誘導(dǎo)蛋白27(IFI27)的表達(dá)進(jìn)而通過(guò)TRAIL途徑影響細(xì)胞凋亡,從而調(diào)控微小隱孢子蟲(chóng)的內(nèi)生發(fā)育;即感染前期下調(diào)IFI27的表達(dá)量,抑制細(xì)胞凋亡進(jìn)而促進(jìn)蟲(chóng)體發(fā)育;后期上調(diào)IFI27的表達(dá)量,促進(jìn)細(xì)胞凋亡而抑制蟲(chóng)體發(fā)育[25]。Wang等[26]研究微小隱孢子蟲(chóng)感染早期HCT-8細(xì)胞發(fā)現(xiàn)一些microRNA表達(dá)水平發(fā)生顯著變化,功能預(yù)測(cè)分析結(jié)果顯示Hsa-miR-18b-3p、Hsa-miR-3976等與細(xì)胞凋亡也有一定的聯(lián)系,這對(duì)為進(jìn)一步研究microRNAs調(diào)控隱孢子蟲(chóng)感染誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制提供新理論基礎(chǔ)。

2 十二指腸賈第蟲(chóng)

十二指腸賈第蟲(chóng)是寄生于人和多種動(dòng)物十二指腸內(nèi)的一種機(jī)會(huì)性致病原蟲(chóng)。該蟲(chóng)具有A-H共8種集聚體,其中A和B被認(rèn)為是人獸共患集聚體,可感染人和多種哺乳動(dòng)物;集聚體C和D常見(jiàn)于犬科動(dòng)物,而集聚體E在蹄類(lèi)動(dòng)物中最為常見(jiàn)[16,27]。生活史僅有滋養(yǎng)體和包囊兩個(gè)階段,包囊可長(zhǎng)期在環(huán)境中生存,使十二指腸賈第蟲(chóng)在宿主間的傳播更為廣泛,從而增加了人類(lèi)食源性和水源性感染的風(fēng)險(xiǎn),感染者主要表現(xiàn)為腹瀉、腹痛、腹脹等臨床癥狀[28-29]。

研究表明,十二指腸賈第蟲(chóng)感染引起腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白Claudin 1表達(dá)下調(diào),進(jìn)而導(dǎo)致腸上皮屏障功能障礙,引起吸收不良和慢性腹瀉,并誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞凋亡[30]。將蟲(chóng)體與一種新型未轉(zhuǎn)化的人十二指腸上皮(SCBN)細(xì)胞共培養(yǎng),結(jié)果表明賈第蟲(chóng)以依賴(lài)caspase方式增加細(xì)胞膜通透性,同時(shí)破壞胞質(zhì)緊密黏連蛋白ZO-1,并誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡[31]。十二指腸賈第蟲(chóng)感染HCT-8細(xì)胞可誘導(dǎo)Bax表達(dá)上調(diào)、Bcl-2表達(dá)下調(diào),并激活內(nèi)、外兩種途徑依賴(lài)于caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]。

腫瘤壞死因子受體1(TNFR1)信號(hào)通路調(diào)控十二指腸賈第蟲(chóng)誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞外源性凋亡。十二指腸賈第蟲(chóng)滋養(yǎng)體與人克隆結(jié)腸腺癌細(xì)胞(Caco-2)共培養(yǎng)可降低Caco-2細(xì)胞活性;通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)(RNA-seq)分析表明,一些凋亡相關(guān)基因和去泛素酶基因的表達(dá)發(fā)生了顯著性變化,而滋養(yǎng)體感染Caco-2細(xì)胞后可通過(guò)上調(diào)腫瘤抑制因子(CYLD)表達(dá),進(jìn)而激活TNFR1通路和受體相關(guān)蛋白(RIP1)的K63泛素化,從而激活caspase-3和caspase-8信號(hào)通路,誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞發(fā)生外源性凋亡[32]。

十二指腸賈第蟲(chóng)可通過(guò)活性氧介導(dǎo)上皮細(xì)胞發(fā)生線粒體內(nèi)源性凋亡。在體外將十二指腸賈第蟲(chóng)WB蟲(chóng)株和Caco-2細(xì)胞共培養(yǎng),通過(guò)熒光顯微鏡、透射電鏡、流式細(xì)胞儀和Western blot等技術(shù)對(duì)細(xì)胞凋亡水平進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明十二指腸賈第蟲(chóng)滋養(yǎng)體通過(guò)刺激細(xì)胞產(chǎn)生活性氧(ROS),并通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)凋亡因子Bax和Bcl-2的表達(dá),引起線粒體外膜通透性增加,線粒體膜電位(MMP)下降和細(xì)胞色素C(Cyt-C)的釋放;從而激活caspase-9和caspase-3,促使DNA修復(fù)酶(PARP)裂解,最終引起線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性凋亡[33]。

環(huán)氧化酶-2(COX-2)作為抗凋亡啟動(dòng)子并激發(fā)潛在因子調(diào)控十二指腸賈第蟲(chóng)感染誘導(dǎo)的腸上皮細(xì)胞凋亡。研究表明,十二指腸賈第蟲(chóng)體外感染腸上皮細(xì)胞后通過(guò)抑制COX-2活性從而降低細(xì)胞活性;增加ROS生成并減少NO的釋放,促進(jìn)caspase-3激活和PARP裂解,抑制Survivin等抗凋亡蛋白的表達(dá)從而促進(jìn)IEC細(xì)胞凋亡,而COX-2過(guò)表達(dá)則抑制IEC細(xì)胞凋亡;進(jìn)一步研究表明,p38/ERK/AKT/NF-κB信號(hào)通路可調(diào)控十二指腸賈第蟲(chóng)感染過(guò)程中COX-2介導(dǎo)的ROS和NO生成和抗上皮細(xì)胞凋亡作用,并且COX-2介導(dǎo)的抗上皮細(xì)胞凋亡作用與Toll樣受體4(TLR4)依賴(lài)的p38-NF-κB信號(hào)通路激活有關(guān)[34]。

十二指腸賈第蟲(chóng)不同蟲(chóng)株誘導(dǎo)宿主上皮細(xì)胞凋亡水平存在差異。Chin等[31]使用賈第蟲(chóng)NF、S2、WB和PB蟲(chóng)株分別感染十二指腸上皮細(xì)胞并加入Caspase-3抑制劑(Z-DEVD-FMK),其中NF和S2蟲(chóng)株可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,而WB和PB蟲(chóng)株未誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,表明不同蟲(chóng)株誘導(dǎo)胃腸道上皮細(xì)胞凋亡能力有所不同,此結(jié)果與新生大鼠感染十二指腸賈第蟲(chóng)引起小腸損傷具有蟲(chóng)株依賴(lài)性的研究結(jié)果一致[35]。賈第蟲(chóng)感染不局限于誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,還會(huì)引起一些促炎癥因子的釋放,甚至改變腸上皮細(xì)胞基因表達(dá)的變化等[36]。

3 芽囊原蟲(chóng)

芽囊原蟲(chóng)是一種寄生于人和動(dòng)物腸道的厭氧性單細(xì)胞原生生物,其形態(tài)結(jié)構(gòu)較復(fù)雜,可分為包囊型、空泡型、顆粒型等形態(tài),但目前對(duì)該蟲(chóng)生活史了解尚不明確[37-38]。芽囊原蟲(chóng)可與其他寄生蟲(chóng)共感染,如隱孢子蟲(chóng)、賈第蟲(chóng)和阿米巴原蟲(chóng)等;其感染與其他疾病的發(fā)生有一定聯(lián)系,如肺結(jié)核、艾滋病和其他慢性疾病等[39]。盡管目前對(duì)芽囊原蟲(chóng)的生物學(xué)、遺傳多樣性和流行病學(xué)有了一定的認(rèn)識(shí),但其致病力仍存在爭(zhēng)議。有關(guān)芽囊原蟲(chóng)在體內(nèi)外的研究表明,其不僅能引起腸道緊密連接蛋白的降解和腸道膜通透性的改變,還能誘導(dǎo)細(xì)胞炎性因子的釋放、以及腸道細(xì)胞的凋亡等[40-42]。

芽囊原蟲(chóng)感染引起大鼠腸上皮通透性增加,并誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞凋亡從而破壞腸屏障功能[43]。研究證明,鼠源芽囊原蟲(chóng)WR1蟲(chóng)株以非接觸方式誘導(dǎo)IEC-6細(xì)胞凋亡[9],并且重新排列纖維狀肌動(dòng)蛋白(F-actin)的分布、降低上皮間電阻并增加上皮通透性。值得注意的是,該研究顯示抗原蟲(chóng)藥物甲硝唑可消除鼠源芽囊原蟲(chóng)WR1蟲(chóng)株對(duì)上皮屏障功能作用的影響,表明該藥物對(duì)芽囊原蟲(chóng)引起的腸道疾病具有一定的治療潛力[9]。

芽囊原蟲(chóng)感染小鼠進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn),與未感染組相比,感染組小鼠腸道細(xì)胞乳糖酶活性降低;免疫組化試驗(yàn)表明感染組小鼠腸道細(xì)胞炎癥細(xì)胞因子TNF-α水平降低、Bax表達(dá)上調(diào),Bcl-2表達(dá)下調(diào),結(jié)果表明芽囊原蟲(chóng)通過(guò)TNF-α相關(guān)途徑誘導(dǎo)小腸上皮細(xì)胞凋亡,從而降低乳糖酶活性[44]。

芽囊原蟲(chóng)不同蟲(chóng)株誘導(dǎo)宿主上皮細(xì)胞凋亡的能力有所差異。用分離出的不同亞型芽囊原蟲(chóng)株(ST4和ST7)與Caco-2細(xì)胞共同培養(yǎng)[45],用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Caco-2細(xì)胞早期凋亡的變化,免疫組化技術(shù)和共聚焦顯微鏡觀察芽囊原蟲(chóng)感染Caco-2細(xì)胞不同時(shí)期ZO-1連接蛋白的重組情況,以及用蛋白印跡法對(duì)相應(yīng)凋亡蛋白分子檢測(cè),結(jié)果表明ST7蟲(chóng)株可激活caspases-3和caspase-9,而未激活caspases-8,并引起上皮間電阻、上皮通透性和緊密連接蛋白ZO-1分布的改變,用caspases抑制劑Z-VAD-FMK處理后檢測(cè)發(fā)現(xiàn),可顯著性抑制以上變化,結(jié)果表明芽囊原蟲(chóng)誘導(dǎo)上皮細(xì)胞凋亡,并且引起細(xì)胞屏障的改變[45]。ST7蟲(chóng)株可誘導(dǎo)Caco-2細(xì)胞凋亡,而ST4蟲(chóng)株不可以,表明芽囊原蟲(chóng)在致病性方面表現(xiàn)出宿主特異性和蟲(chóng)株間的差異[46]。深入研究芽囊原蟲(chóng)感染宿主期間誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制和與宿主間的相互作用關(guān)系,對(duì)研發(fā)該病原引起的腸道性疾病的治療藥物具有一定的作用。

4 展望

寄生性原蟲(chóng)誘導(dǎo)宿主上皮細(xì)胞凋亡是寄生蟲(chóng)與宿主共進(jìn)化過(guò)程中形成的重要調(diào)控機(jī)制之一,影響寄生蟲(chóng)在宿主體內(nèi)的發(fā)育以及疾病的發(fā)展過(guò)程。絕大數(shù)寄生性原蟲(chóng)調(diào)控宿主細(xì)胞凋亡機(jī)制尚不清楚,一些關(guān)鍵技術(shù)性問(wèn)題限制了凋亡機(jī)制的相關(guān)研究,如隱孢子蟲(chóng)等一些寄生性原蟲(chóng)未有穩(wěn)定的動(dòng)物感染模型,對(duì)隱孢子蟲(chóng)進(jìn)行遺傳操作尚存在一定的困難。因此,未來(lái)在解決技術(shù)瓶頸基礎(chǔ)上,利用體內(nèi)外試驗(yàn)探索寄生性原蟲(chóng)感染誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡的調(diào)控機(jī)制,揭示參與調(diào)控細(xì)胞凋亡的一些關(guān)鍵蛋白分子的作用機(jī)制以及宿主非編碼RNA的調(diào)控機(jī)制,為設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)抗寄生蟲(chóng)性原蟲(chóng)病藥物和疫苗等提供新策略。