張 立,何肖肖,馬海云,趙云海,王 青,蔡 偉,邢小勇,武小椿,權(quán)國梅,溫峰琴,包世俊

(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院,甘肅蘭州 730070)

牛支原體(Mycoplasmabovis,Mb)是造成牛呼吸道疾病的病原之一,可對養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失[1-2]。Mb感染是通過其自身表面的蛋白對宿主細(xì)胞的黏附,逐步侵襲感染細(xì)胞造成機(jī)體功能的損傷,目前已知的Mb表面黏附因子有α-烯醇酶、NADH氧化酶和亞甲基四氫葉酸t(yī)RNA-甲基轉(zhuǎn)移酶等[3-5],這些Mb膜表面蛋白通過其自身與宿主細(xì)胞的黏附完成了牛支原體侵染宿主細(xì)胞的第一步。Mb P48蛋白也是一種具有黏附作用的膜表面蛋白,通過黏附宿主細(xì)胞進(jìn)而侵入誘導(dǎo)凋亡因子的表達(dá)致使細(xì)胞凋亡,Mb P48蛋白在Mb感染宿主細(xì)胞并表現(xiàn)出臨床癥狀過程中發(fā)揮了重要作用[6]。因此,探討牛支原體在感染宿主細(xì)胞的過程中其相關(guān)蛋白與宿主細(xì)胞的相互作用,對認(rèn)識Mb發(fā)病機(jī)制及制備完善的防控方案具有重要意義。

硫氧還蛋白還原酶(thioredoxin reductase,TrxR)廣泛存在于原核生物及各種細(xì)胞中,在細(xì)胞各種生理功能的發(fā)揮中起著關(guān)鍵作用[7]。TrxR在參與細(xì)胞分化、生長和死亡、細(xì)胞抗氧化損傷、還原抗壞血酸自由基、細(xì)胞各種氧化還原信號傳導(dǎo)等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[8-9]。TrxR與硫氧還蛋白(Trx)和輔酶NADPH共同構(gòu)成的硫氧還蛋白系統(tǒng)維持著細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的平衡[10]。研究Mb TrxR在胎牛肺細(xì)胞(EBL)中表達(dá),了解其對EBL增殖與凋亡的影響及細(xì)胞中過氧化氫(H2O2)含量的變化,有助于解析其與宿主細(xì)胞的互作機(jī)制,進(jìn)一步闡述Mb感染和逃避免疫的機(jī)制[11],為防控Mb感染引起的疾病積累理論基礎(chǔ),也可更深地闡述Mb TrxR相關(guān)的生物學(xué)功能。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、細(xì)胞及載體 牛支原體武威分離株、EBL細(xì)胞及pVAX1和pEGFP-N1載體由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院傳染病實驗室保存。

1.1.2 主要試劑 支原體基礎(chǔ)培養(yǎng)基(HB7025),青島海博生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;DNA Marker、T4 DNA Ligase(2011A)、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ(1010S)和XhoⅠ(1094S),寶日醫(yī)生物技術(shù)(大連)有限公司產(chǎn)品;過氧化氫(H2O2)含量檢測試劑盒(M1020),北京索萊寶科技有限公司產(chǎn)品; MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒(C0009S)、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(C1062M),上海碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品;2×Hieff Canace?PCR Master Mix高保真酶預(yù)混液(10149ES03)、Hieff?qPCR SYBR Green Master Mix(Q311-02/03),翌圣生物科技(上海)股份有限公司產(chǎn)品;無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒(DP118-02),天根生化科技有限公司產(chǎn)品;PEI 40K Transfection Reagent(G1802-1ML),武漢賽維爾生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 生物安全柜,青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司產(chǎn)品;Minispin小型高速離心機(jī),Hermle公司產(chǎn)品;高壓蒸汽滅菌鍋,上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品;梯度PCR儀,德國Eppendorf公司產(chǎn)品;電泳儀,北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品;凝膠成像儀,君意東方電泳設(shè)備有限公司產(chǎn)品;超微量分光光度計,Pultton公司產(chǎn)品;細(xì)胞培養(yǎng)箱,上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司產(chǎn)品;酶標(biāo)儀,美國Molecular Devices公司產(chǎn)品;倒置熒光顯微鏡,德國ZEISS公司產(chǎn)品;Guava easyCyte流式細(xì)胞檢測儀,Millipore公司產(chǎn)品;LightCycler96實時熒光定量PCR儀,瑞士Roche公司產(chǎn)品;細(xì)胞超聲破碎儀,浙江寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 Mb基因組及pVAX1和pEGFP-N1質(zhì)粒的提取 取2 mL培養(yǎng)至對數(shù)生長中后期的Mb菌液,12 000 r/min離心6 min收集菌體,用水浴法粗提Mb基因組。將含有質(zhì)粒pVAX1和pEGFP-N1的甘油菌在具有卡那抗性的LB固體培養(yǎng)基劃線復(fù)蘇,待其培養(yǎng)至肉眼可見的單菌落時,挑取菌落繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng),收集相應(yīng)菌體用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒。

1.2.2 引物設(shè)計 參照GenBank中Mb Hubei-1株TrxR基因序列(CP002513.1)設(shè)計引物對Mb-TrxR-FA、Mb-TrxR-RA和Mb-TrxR-Fa、Mb-TrxR-Ra,在上、下游引物5′端引入酶切位點XhoⅠ和BamHⅠ,其順序依載體而言,pVAX1載體上游引物5′端需引入一段Kozak翻譯起始序列和密碼子ATG,方能正確啟動翻譯(表1);實時熒光定量PCR引物參照文獻(xiàn)[6]進(jìn)行(表2)。所有引物由北京擎科生物科技有限公司(西安)合成。

表1 Mb TrxR基因PCR擴(kuò)增引物信息

表2 實時熒光定量PCR引物信息

1.2.3 MbTrxR基因的擴(kuò)增 以Mb粗提基因組為模板,用引物對Mb-TrxR-FA、Mb-TrxR-RA和Mb-TrxR-Fa、Mb-TrxR-Ra分別擴(kuò)增片段MbTrxRA和MbTrxRa,反應(yīng)體系(50 μL):2×Hieff canace?PCR Master Mix高保真酶預(yù)混液25 μL,上、下游引物(10 μmol/mL)各2 μL,模板DNA 3 μL,ddH2O補足50 μL。擴(kuò)增條件為:98℃ 3 min;98℃ 10 s,退火20 s(MbTrxRA和MbTrxRa片段退火溫度分別為57℃和56℃),72℃延伸20 s,32個循環(huán);72℃終延伸 5 min,擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳分離,回收后置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 真核表達(dá)載體pVAX-TrxR和pEGFP-TrxR的構(gòu)建及鑒定 分別取20 μL MbTrxRA和MbTrxRa基因片段,20 μL pVAX1質(zhì)粒和20 μL pEGFP-N1質(zhì)粒于4個1.5 mL離心管中,加入以下組分后用限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切(表3)。

表3 酶切體系

分別將以上組分混合后的離心管置于37℃水浴鍋酶切反應(yīng)7 h,酶切產(chǎn)物用通用型DNA純化回收試劑盒回收,對酶切后的基因片段與線性載體進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化。在轉(zhuǎn)化后的固體培養(yǎng)基挑取單菌落經(jīng)PCR驗證和重組質(zhì)粒酶切驗證后測序,正確的質(zhì)粒分別命名為pVAX-TrxR和pEGFP-TrxR。

1.2.5 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染EBL細(xì)胞 擴(kuò)大培養(yǎng)含有質(zhì)粒pVAX1、pEGFP-N1、pVAX-TrxR、pEGFP-TrxR的大腸桿菌Trans 5α,各取15 mL菌液用無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提中量試劑盒按說明書提取質(zhì)粒,重組質(zhì)粒用超微量分光光度計測取濃度(表4)。將培養(yǎng)至生長狀態(tài)良好的EBL細(xì)胞以每孔4×105個接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板,待其生長至融合度達(dá)到85%左右時開始轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前各孔棄原培養(yǎng)液,用0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液(PBS)緩慢清洗1次后換成1.8 mL不含胎牛血清(FBS)和抗生素的培養(yǎng)液。

轉(zhuǎn)染時先在潔凈無菌的離心管中分別加入100 μL不含F(xiàn)BS與抗生素的高糖DMEM培養(yǎng)基和3 μg的質(zhì)粒DNA(pVAX1、pEGFP-N1和pVAX-TrxR、pEGFP-TrxR),輕輕吹吸混勻配制成A液,再取無菌離心管加入100 μL不含F(xiàn)BS及抗生素的高糖DMEM培養(yǎng)基和10 μL轉(zhuǎn)染試劑PEI 40 K Transfection Reagent,輕輕吹吸混勻配制成B液,將A液和B液輕微混合后室溫孵育15 min,最后將配置好的轉(zhuǎn)染復(fù)合物(DNA-PEI)加入到含1.8 mL細(xì)胞培養(yǎng)液的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,將細(xì)胞放入細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng),6 h之后向培養(yǎng)液中加入終濃度3%的FBS,然后每隔24 h換完全培養(yǎng)基(FBS終濃度10%)一次。

1.2.6 MTT法檢測細(xì)胞增殖 將生長狀態(tài)良好的EBL細(xì)胞以每孔1.5×104個傳至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,待其融合度達(dá)到85%左右時用PBS洗滌細(xì)胞一次后換成無血清無抗生素培養(yǎng)基,按1.2.5方法轉(zhuǎn)染細(xì)胞,在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中依次加入含pVAX1、pVAX-TrxR、pEGFP-N1、pEGFP-TrxR質(zhì)粒的DNA-PEI 10 μL(96孔細(xì)胞培養(yǎng)板DNA和PEI用量分別為0.1 μg/孔和0.35 μL/孔),同時設(shè)置加入0.35 μL的PEI和等體積PBS的細(xì)胞孔做陰性對照組和空白對照組,每組設(shè)3個重復(fù)孔,各組細(xì)胞依次培養(yǎng)24 h、48 h、72 h,每間隔12 h換一半培養(yǎng)液。各時間段結(jié)束后用MTT試劑盒檢測分析EBL細(xì)胞的增殖情況。

1.2.7 Annexin V-FITC試劑盒檢測細(xì)胞凋亡 取EBL細(xì)胞以每孔3×105個接種至6孔細(xì)胞板,待細(xì)胞融合度達(dá)85%左右時轉(zhuǎn)染,將含pVAX1、pVAX-TrxR、pEGFP-N1、pEGFP-TrxR質(zhì)粒的細(xì)胞及PEI陰性對照組和PBS空白對照組細(xì)胞分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h,培養(yǎng)結(jié)束后胰酶消化并細(xì)胞計數(shù),各組取5×104～1×105個細(xì)胞參照Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明書處理后用流式細(xì)胞儀檢測Mb TrxR表達(dá)對EBL細(xì)胞凋亡的影響。

1.2.8 實時熒光定量PCR法檢測凋亡因子表達(dá) 按1.2.7方法處理細(xì)胞,收集細(xì)胞后用Trizol法提取總RNA,將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,以cDNA為模板,采用實時熒光定量PCR法(GAPDH為內(nèi)參基因),用2-ΔΔCt方法分析EBL細(xì)胞中Bax、Beclin-1、caspase3、caspase4、P53凋亡因子在各時間段受細(xì)胞中TrxR蛋白影響的mRNA表達(dá)情況。

1.2.9 細(xì)胞內(nèi)過氧化氫(H2O2)含量檢測 按1.2.7方法處理后的細(xì)胞,PBS洗滌計數(shù)后各取5×106個1 500 r/min室溫離心8 min,棄去PBS,每個離心管中加入1 mL丙酮后冰浴,用超聲破碎儀破碎細(xì)胞(功率為20%,工作3 s,間隔3 s,工作3 min),破碎后的細(xì)胞按H2O2含量檢測試劑盒說明書。檢測各時間段Mb TrxR在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)對細(xì)胞內(nèi)H2O2含量的影響。使用以下公式計算EBL細(xì)胞內(nèi)H2O2的含量。

EBL細(xì)胞內(nèi)H2O2的含量(μmol/104cell)=ΔA測定÷(ΔA標(biāo)準(zhǔn)÷C標(biāo)液)×V樣本÷(500×V樣本÷V提取)=0.004×ΔA測定÷ΔA標(biāo)準(zhǔn)。

其中,ΔA測定=A測定管-A空白管,ΔA標(biāo)準(zhǔn)=A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管。

2 結(jié)果

2.1 Mb TrxR基因的擴(kuò)增

以Mb粗提基因組為模板,引物Mb-TrxR-FA、Mb-TrxR-RA和Mb-TrxR-Fa、Mb-TrxR-Ra經(jīng)PCR分別擴(kuò)增獲得片段MbTrxRA和MbTrxRa,10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳分離后在凝膠成像儀下可見約952 bp和942 bp大小的目的條帶,與預(yù)期大小相符(圖1)。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.Mb TrxRA擴(kuò)增結(jié)果;3.Mb TrxRa擴(kuò)增結(jié)果;2,4.陰性對照 M.DNA Marker DL 2 000; 1.Mb TrxRA amplification result; 3.Mb TrxRa amplification result; 2,4.Negative control

2.2 真核表達(dá)載體pVAX-TrxR和pEGFP-TrxR的構(gòu)建及鑒定

構(gòu)建的真核表達(dá)載體pVAX-TrxR和pEGFP-TrxR轉(zhuǎn)化后挑取單菌落分別進(jìn)行PCR鑒定,經(jīng)PCR鑒定為陽性的菌擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒pVAX-TrxR和pEGFP-TrxR,對重組質(zhì)粒用XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切,可切出大小約952 bp和942 bp的目的片段(圖2)。經(jīng)雙酶切驗證后的質(zhì)粒送生物公司進(jìn)行測序,結(jié)果顯示成功獲得序列正確的重組質(zhì)粒。

M.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.Mb TrxRA酶切結(jié)果;2.Mb TrxRa酶切結(jié)果 M.DNA Marker DL 2 000; 1.Results of Mb TrxRA enzyme digestion; 2.Results of Mb TrxRa enzyme digestion

2.3 pEGFP-TrxR在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況

由于pEGFP-N1載體帶有綠色熒光蛋白(GFP)基因,表達(dá)后的GFP在熒光顯微鏡下有綠色熒光。為了驗證質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率及重組質(zhì)粒在EBL細(xì)胞中的表達(dá)情況,分別將轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pEGFP-N1和pEGFP-TrxR后培養(yǎng)24 h和48 h的EBL細(xì)胞用40 mL/L多聚甲醛室溫固定30 min,依次用10 μmol/L DiI染色液和PBS 1∶50稀釋的 DAPI 染色液對細(xì)胞膜和細(xì)胞核染色10 min,PBS充分洗滌用抗熒光淬滅劑封片后置于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)和GFP的表達(dá)情況。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染pEGFP-N1和pEGFP-TrxR質(zhì)粒后的EBL細(xì)胞內(nèi)均有GFP蛋白表達(dá)且細(xì)胞形態(tài)正常,GFP表達(dá)量隨培養(yǎng)時間的增加而增加;轉(zhuǎn)染pEGFP-N1質(zhì)粒后的EBL細(xì)胞(A、C組)GFP表達(dá)量明顯高于轉(zhuǎn)染pEGFP-TrxR質(zhì)粒后的細(xì)胞(B、D組),B、D組細(xì)胞內(nèi)GFP的表達(dá)受到細(xì)胞內(nèi)TrxR表達(dá)的影響而低于A、C組(圖3)。

A.pEGFP-N1轉(zhuǎn)染24 h;B.pEGFP-TrxR轉(zhuǎn)染24 h;C.pEGFP-N1轉(zhuǎn)染48 h;D.pEGFP-TrxR轉(zhuǎn)染48 h A.pEGFP-N1transfection 24 h; B.pEGFP-TrxR transfection 24 h; C.pEGFP-N1 transfection 48 h; D.pEGFP-TrxR transfection 48 h

2.4 TrxR胞內(nèi)表達(dá)對EBL細(xì)胞增殖的影響

轉(zhuǎn)染pVAX1、pVAX-TrxR、pEGFP-N1、pEGFP-TrxR質(zhì)粒的試驗組及PEI陰性對照組和PBS空白對照組中各組的EBL細(xì)胞增殖隨時間的增加而增加,由于轉(zhuǎn)染劑及載體本身對細(xì)胞的影響,24 h、48 h和72 h三個時間段的EBL活細(xì)胞數(shù)始終少于PBS空白組(圖4),說明PEI對EBL細(xì)胞的生長有一定的毒害作用,載體pEGFP-N1與pVAX1對EBL細(xì)胞的生長也有很大的影響,相比而言,載體pVAX1對細(xì)胞的影響較小,所以pVAX1更有利于外源基因的真核表達(dá)。在此試驗中,pVAX-TrxR、pEGFP-TrxR實驗組細(xì)胞增殖明顯高于pVAX1、pEGFP-N1對照組,兩者差異性極顯著,表明細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的Mb TrxR蛋白促進(jìn)EBL細(xì)胞的增殖。

與對應(yīng)空載體pVAX1、pEGFP-N1組相比,**P<0.01

2.5 TrxR胞內(nèi)表達(dá)對EBL細(xì)胞凋亡的影響

將各組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后用流式細(xì)胞術(shù)檢測。結(jié)果顯示,由于質(zhì)粒本身屬性對細(xì)胞生長的影響,轉(zhuǎn)染pVAX1、pVAX-TrxR、pEGFP-N1、pEGFP-TrxR質(zhì)粒后的細(xì)胞凋亡率高于空白對照組;轉(zhuǎn)染劑對細(xì)胞生長的影響,PEI陰性對照組細(xì)胞凋亡率略高于空白對照組;空載體pVAX1、pEGFP-N1組細(xì)胞凋亡率高于pVAX-TrxR、pEGFP-TrxR試驗組,兩組差異性顯著,載體pVAX1組細(xì)胞凋亡率低于pEGFP-N1組(圖5),表明胞內(nèi)表達(dá)的Mb TrxR蛋白對EBL細(xì)胞的凋亡具有抑制作用,且載體pVAX1更有利于TrxR蛋白的表達(dá)和作用的發(fā)揮。

與對應(yīng)空載體pVAX1、pEGFP-N1組相比,*P<0.05Compared with the corresponding empty carriers pVAX1 and pEGFP-N1,*P<0.05

2.6 實時熒光定量PCR檢測凋亡標(biāo)志物mRNA的變化

分析結(jié)果表明(圖6),由于凋亡因子在細(xì)胞生長各期的表達(dá)量不同,所以其mRNA表達(dá)水平也不相同,在自然凋亡情況下,凋亡因子Beclin-1 mRNA表達(dá)量隨培養(yǎng)時間的增加呈先降后升的趨勢,其他凋亡因子在72 h內(nèi)與培養(yǎng)時間成正比;僅有PEI的陰性對照組和PBS空白對照組的試驗中,凋亡因子Bax、caspase3、P53 mRNA表達(dá)水平隨培養(yǎng)時間的延長而增加,且PEI組在各時間段略高于PBS組,說明PEI造成細(xì)胞損傷加速了其自然凋亡;當(dāng)載體中TrxR基因表達(dá)時EBL細(xì)胞的凋亡率低于對應(yīng)空載體組,且隨著培養(yǎng)時間的延長兩組細(xì)胞中凋亡因子mRNA表達(dá)量差異性越顯著,載體pVAX1試驗組細(xì)胞中各凋亡因子在3個時間段均低于pEGFP-N1組,表明pVAX1載體在真核表達(dá)中更具優(yōu)勢。此試驗中,TrxR蛋白抑制了各凋亡因子的表達(dá),進(jìn)一步證明了Mb TrxR蛋白具有抑制EBL細(xì)胞凋亡的作用。

2.7 EBL細(xì)胞中H2O2含量的變化

H2O2含量測定試驗結(jié)果顯示,在未處理細(xì)胞組中,H2O2含量在48 h之前隨細(xì)胞培養(yǎng)時間的延長而降低,由于48 h之后細(xì)胞密度增加,產(chǎn)生了過氧化氫酶(CAT)及細(xì)胞本身保護(hù)性機(jī)制的應(yīng)激作用致使H2O2含量保持在一定的范圍;基于pVAX1載體試驗中(圖7A),重組質(zhì)粒pVAX-TrxR試驗組H2O2含量低于pVAX1空載體組,兩組差異性極顯著,且pVAX-TrxR組48 h及之后的時間段H2O2的含量低于空白對照組;基于pEGFP-N1載體試驗中(圖7B),重組質(zhì)粒pEGFP-TrxR試驗組H2O2含量低于pEGFP-N1空載體組,兩組在48 h之前具有顯著性差異,48 h及之后的時間段H2O2的含量接近空白對照組。載體pVAX1試驗組TrxR蛋白對EBL細(xì)胞H2O2降低效果較pEGFP-N1載體顯著,充分說明了載體pVAX1更適合外源基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)。此試驗驗證了TrxR蛋白可以降低細(xì)胞內(nèi)H2O2含量,對細(xì)胞有抗氧化損傷的作用。進(jìn)一步證明了Mb TrxR蛋白有利于促進(jìn)EBL細(xì)胞生長,間接抑制其凋亡。

與空載體組相比,*P<0.05,**P<0.01Compared with pVAX1 empty vector group,*P<0.05,**P<0.01圖7 Mb TrxR在細(xì)胞內(nèi)基于載體pVAX1(A)和pEGFP-N1(B)表達(dá)后各時間段H2O2含量的變化

3 討論

硫氧還蛋白系統(tǒng)是體內(nèi)非常重要的抗氧化系統(tǒng),該系統(tǒng)包括硫氧還蛋白、TrxR、NADPH、內(nèi)源性硫氧還蛋白抑制劑和硫氧還蛋白相關(guān)蛋白[12]。TrxR作為硫氧還蛋白系統(tǒng)的最主要的蛋白之一,對體內(nèi)代謝產(chǎn)生的氧化物調(diào)節(jié)和氧化還原穩(wěn)態(tài)具有重要的作用[13],TrxR也是細(xì)胞主要的氧化還原調(diào)節(jié)因子,能夠有效降低細(xì)胞產(chǎn)生的活性氧,從而降低對細(xì)胞的損傷[14]。研究發(fā)現(xiàn),解脲支原體的硫氧還蛋白系統(tǒng)具有自我排毒的功能,它可以使宿主細(xì)胞免受自身代謝產(chǎn)生的氧化物的侵害[15]。抑制TrxR蛋白活性能夠促進(jìn)三陰性乳腺癌(TNBC)細(xì)胞的凋亡[16];研究Mb TrxR蛋白對EBL細(xì)胞增殖和凋亡的影響,有助于了解該蛋白在Mb感染宿主中發(fā)揮的作用,進(jìn)一步揭示Mb的致病性及逃避和調(diào)節(jié)宿主反應(yīng)的策略,為研發(fā)有效疫苗奠定基礎(chǔ)。

為進(jìn)一步確認(rèn)Mb TrxR蛋白的效應(yīng),本研究采用真核表達(dá)載體pVAX1或pEGFP-N1在EBL細(xì)胞內(nèi)表達(dá)Mb TrxR,通過MTT試驗和流式細(xì)胞技術(shù)檢測對細(xì)胞增殖和凋亡的影響,結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),Mb TrxR蛋白通過還原細(xì)胞內(nèi)的活性氧包括降低細(xì)胞內(nèi)H2O2的含量調(diào)節(jié)氧化還原的穩(wěn)態(tài),進(jìn)而打造適合細(xì)胞生長的環(huán)境促進(jìn)其生長;另一方面,它能夠與硫氧還蛋白系統(tǒng)協(xié)調(diào),通過激活調(diào)節(jié)細(xì)胞生長的轉(zhuǎn)錄因子,增加細(xì)胞對其他細(xì)胞因子和生長因子的敏感性,從而維持細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的動態(tài)平衡[18]。細(xì)胞凋亡主要受細(xì)胞內(nèi)死亡受體及線粒體通路的調(diào)控[16],而TrxR主要分布在細(xì)胞線粒體上,TrxR與細(xì)胞凋亡密切相關(guān),研究發(fā)現(xiàn)TrxR蛋白通過抑制凋亡因子Bax、caspase3、P53 mRNA的表達(dá)量從而下調(diào)凋亡因子的表達(dá)抑制EBL細(xì)胞的凋亡,從細(xì)胞培養(yǎng)時間的梯度來看,Mb TrxR在細(xì)胞內(nèi)營造了適合細(xì)胞生長的內(nèi)環(huán)境,導(dǎo)致細(xì)胞自然凋亡速率減慢,在細(xì)胞培養(yǎng)48 h之后,出現(xiàn)過多積累的衰老細(xì)胞又可以激活凋亡因子caspase3的表達(dá),使其進(jìn)一步促進(jìn)下游效應(yīng)因子前列腺素E2的表達(dá)而刺激活細(xì)胞的生長[19]。整體來說,Mb TrxR蛋白作用EBL細(xì)胞后,一方面抑制了凋亡因子mRNA的表達(dá),從而抑制EBL細(xì)胞的凋亡,另一方面還原Trx在細(xì)胞代謝中產(chǎn)生的過氧化物使其免受損傷而進(jìn)一步保護(hù)宿主細(xì)胞。細(xì)胞線粒體TrxR蛋白抑制細(xì)胞凋亡的通路調(diào)控,需進(jìn)一步研究探索。

本試驗中基于pVAX1或pEGFP-N1兩種載體表達(dá)Mb TrxR蛋白,結(jié)果顯示,pVAX1載體更有利于外源蛋白的表達(dá)以及蛋白作用的發(fā)揮,而pEGFP-N1載體可以通過本身GFP的表達(dá)量來檢測外源蛋白TrxR的表達(dá)。該試驗中Mb TrxR蛋白對EBL細(xì)胞作用的初步研究,為進(jìn)一步了解牛支原體感染機(jī)制和制定有效的抗牛支原體策略提供更多可靠的數(shù)據(jù)。