李夢磊,張銳錚,于皓同,張 琪,許信剛

(西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院,陜西楊凌 712100)

山羊傳染性胸膜肺炎(Contagious caprine pleuropneumonia,CCPP)被世界動物衛(wèi)生組織列為必須報告的動物傳染病[1-2]。該病主要臨床癥狀表現(xiàn)為高熱、鼻腔有黏性分泌液,個別患病羊有鐵銹色鼻液,剖檢可見肺臟實質(zhì)硬變,甚至肺臟與胸膜發(fā)生粘連。本病在初春及秋冬季節(jié)多發(fā),天氣寒涼、營養(yǎng)缺乏、羊群密集等均會誘發(fā)本病[3]。山羊支原體山羊肺炎亞種(Mycoplasmacapricolumsubsp.capripneumoniae,Mccp)是山羊傳染性胸膜肺炎的主要病原[4]。因支原體體外培養(yǎng)較為困難,直到1976年才分離到Mccp,并命名為F38,隨后在世界其他多個國家和地區(qū)均有Mccp的分離報道[5]。Mccp 0507基因為已知Mccp的毒力基因,在長期的進化歷史中未發(fā)生變化,具有較高的保守性,可作為包被抗原的選擇。

近年來,隨著我國畜牧業(yè)的不斷發(fā)展,山羊傳染性胸膜肺炎的流行呈現(xiàn)上升趨勢,嚴重制約著我國羊產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。因此,對傳染性胸膜肺炎開展檢測以及流行病學調(diào)查十分必要。本研究通過對Mccp 0507基因進行基因克隆和原核表達,將0507蛋白作為包被抗原,擬建立一種能夠快速檢測Mccp抗體的間接ELISA方法,進一步豐富Mccp的檢測技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株質(zhì)粒與血清樣品 pet-28a(+)質(zhì)粒、山羊支原體山羊肺炎亞種陽性病料由西北農(nóng)林科技大學動物醫(yī)學院獸醫(yī)微生物實驗室鑒定并保存。山羊支原體山羊肺炎亞種陽性血清、綿羊流產(chǎn)衣原體陽性血清、綿羊立克次體陽性血清、牛支原體陽性血清均由中國動物衛(wèi)生與流行病學中心血清庫提供; 山羊血清樣品282份,采自陜西省部分山羊養(yǎng)殖場。

1.1.2 主要試劑 DNA/RNA提取試劑盒,天隆科技有限公司產(chǎn)品;瓊脂糖凝膠DNA膠回收試劑盒、快速質(zhì)粒小提試劑盒,北京天根生物科技有限公司產(chǎn)品;2×TaqMaster Mix,艾科瑞生物工程有限公司產(chǎn)品;HindⅢ、BamHⅠ內(nèi)切酶,NEB公司產(chǎn)品;Ni-NTA His Bind Resin鎳柱,上海七海復泰生物科技有限公司產(chǎn)品。

1.1.3 主要儀器 梯度PCR儀、凝膠成像系統(tǒng),莫納生物科技有限公司產(chǎn)品;恒溫振蕩器,蘇州培英實驗設(shè)備有限公司產(chǎn)品;低溫高速離心機,曦瑪離心機(揚州)有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計 根據(jù)NCBI上收錄的Mccp 0507基因序列(CP006959.1),用Primer 5.0設(shè)計特異性引物(表1)。

表1 0507基因引物序列

1.2.2 0507基因的擴增及重組表達載體的構(gòu)建 用DNA/RNA提取試劑盒提取Mccp陽性病料DNA,以提取的DNA為模板,用1.2.1的特異性引物進行0507基因擴增。反應體系為:2×TaqMaster Mix 10 μL,上、下游引物各1 μL,模板2 μL,其余用ddH2O補足至20 μL。反應程序為:95℃ 5 min;95℃ 30 s,56℃ 60 s,72℃ 30 s,共循環(huán)30次;72℃延伸10 min。分別用HindⅢ、BamHⅠ內(nèi)切酶對膠回收后的目的片段及pet-28a載體雙酶切后進行連接。并將陽性重組質(zhì)粒命名為pet-28a-0507。

1.2.3 重組0507蛋白表達條件的優(yōu)化 將陽性重組質(zhì)粒pet-28a-0507轉(zhuǎn)化至BL21(DE3)感受態(tài)細胞中,隔天挑取單菌落搖菌后進行菌液PCR鑒定,篩選出陽性表達菌株。將表達菌株過夜活化后,按照1∶100比例轉(zhuǎn)接于含Kan+抗性的液體LB培養(yǎng)基中,在2 h左右測定OD600,當OD600為0.6～0.8時,加入不同體積的IPTG對表達菌株進行誘導,使菌液中IPTG終濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L。37℃誘導8 h后離心收集菌體,將菌體重懸后制樣,經(jīng)SDS-PAGE來確定最適誘導濃度。選擇最適IPTG誘導濃度,對菌液進行2、3、4、5、6、7 h誘導,對不同誘導時間的菌液進行12 000 r/min離心1 min,收集菌體并重懸制樣,通過SDS-PAGE篩選菌液最佳誘導時間。

1.2.4 重組0507蛋白表達形式分析、純化及復性 在已確定的最佳誘導條件下擴大菌液量進行大量誘導,誘導后離心收集菌體與上清,用不超過原菌液體積1/25 PBS對菌體進行重懸。對重懸菌液進行超聲裂解后離心,收集上清與沉淀并分別制樣進行SDS-PAGE分析,以此來確定重組0507蛋白的表達形式。采用鎳柱法純化對重組0507蛋白進行純化,采用不同濃度梯度尿素對純化蛋白進行復性,對復性后的蛋白測定濃度后于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 重組0507蛋白的Western blot分析 將復性0507蛋白進行SDS-PAGE,轉(zhuǎn)膜后加入50 g/L脫脂奶粉封閉2 h,在稀釋后的一抗孵育液中4℃孵育過夜。次日洗膜后,在稀釋后的HRP標記的二抗孵育液中室溫孵育1 h,洗膜后均勻滴加ECL工作液,排出氣泡后開始曝光。

2 結(jié)果

2.1 0507基因的擴增及重組質(zhì)粒的構(gòu)建

經(jīng)PCR擴增后,瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示得到與Mccp 0507基因片段大小(924 bp)相一致的目的片段(圖1)。重組質(zhì)粒經(jīng)HindⅢ、BamHⅠ雙酶切鑒定為陽性(圖2),表明重組質(zhì)粒pet-28a-0507構(gòu)建成功。

M.DNA標準DL 2 000;1.0507基因的擴增M.DNA Marker DL 2 000;1.Amplification of 0507 gene

M.DNA標準DL 5 000;1.重組質(zhì)粒pet-28a-0507經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切

2.2 重組0507蛋白表達條件的優(yōu)化

用不同濃度IPTG對重組表達菌株進行誘導。當IPTG終濃度為0.4 mmol/L時,重組蛋白的表達量最大(圖3);在重組表達菌株進行不同時間誘導,當誘導時間為4 h時,重組蛋白的表達量最大(圖4)。

M.預染蛋白分子質(zhì)量標準;1.誘導的pet-28a;2～6.37℃時0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L的IPTG終濃度條件下誘導7 h的重組pet-28a-0507;8.未誘導的重組pet-28a-0507

M.預染蛋白分子質(zhì)量標準;1.未誘導的pet-28a;2～7.37℃、0.4 mmol/L的IPTG終濃度條件下誘導2、3、4、5、6、7 h的重組pet-28a-0507;8.未誘導的重組pet-28a-0507

2.3 重組0507蛋白表達形式的分析與純化

在最佳誘導條件的基礎(chǔ)上,對大量重組表達菌株進行誘導,經(jīng)SDS-PAGE分析,重組0507蛋白主要存在于菌體超聲裂解沉淀中,將重組蛋白進行蛋白純化后,得到大小約39 ku的目的蛋白(圖5)。

M.預染蛋白分子質(zhì)量標準;1.pet-28a-0507菌液上清;2.pet-28a-0507超聲裂解菌體上清;3.pet-28a-0507超聲裂解菌體沉淀;4.純化蛋白

2.4 重組蛋白的Western blot分析

經(jīng)Western blot分析得到了39 ku的特異性條帶,表明重組0507蛋白能與Mccp陽性血清發(fā)生特異性反應(圖6)。

M.預染蛋白分子質(zhì)量標準;1～2.重組N蛋白; 3.陰性對照

2.5 抗原包被量、一抗和酶標二抗稀釋度的確定

當抗原包被量為3 μg/mL,一抗1∶100稀釋,二抗1∶2 500稀釋時,P/N值達到最大,此時為最優(yōu)的工作條件(表2)。

2.6 其他試驗條件優(yōu)化

當封閉時間為60 min、一抗孵育時間為120 min、二抗孵育時間為60 min、TMB顯色時間為20 min時,P/N值達到最大,此時為最優(yōu)工作條件。

2.7 間接ELISA臨界值的確定

陰性血清OD450的平均值為0.143,標準差為0.026,臨界值為0.221,即當待檢血清OD450≥0.221時,樣品為陽性;當待檢血清OD450<0.221時,樣品為陰性。

2.8 特異性試驗

用已經(jīng)優(yōu)化好的ELISA檢測方法對牛支原體、綿羊立克次氏體、綿羊流產(chǎn)衣原體的陽性血清進行檢測,結(jié)果顯示陰陽對照成立,樣品檢測均為陰性。表明本試驗所建立的ELISA檢測方法能特異性檢出Mccp。

2.9 靈敏性試驗

將標準陽性血清進行2倍倍比稀釋后,用已優(yōu)化好的檢測方法對稀釋后的血清進行檢測,當樣品稀釋到1∶1 024時OD450為0.227,依然大于臨界值,表明本試驗所建立的方法具有較低的檢測閾值。

2.10 重復性試驗

對陰陽性血清進行檢測后,計算批內(nèi)變異系數(shù)為2.8%～4.3%,批間變異系數(shù)為2.9%～5.4%,兩者的變異系數(shù)均小于10%,表明本試驗所建立的方法結(jié)果較穩(wěn)定,具有較好的重復性。

2.11 臨床樣品檢測

對陜西地區(qū)部分奶山羊養(yǎng)殖場收集到的282份臨床血清樣品進行檢測,37份血清為陽性,山羊支原體山羊肺炎亞種抗體陽性率為13.1%。

3 討論

山羊傳染性胸膜肺炎與其他疾病具有相似的臨床癥狀,診斷較復雜,如小反芻獸疫也會造成肺部出血性間質(zhì)性炎癥、支氣管擴張胸腔積液[7],多殺性巴氏桿菌也會造成肺部大面積損傷。本研究所建立的檢測方法對于診斷山羊支原體山羊肺炎亞種的感染具有重要意義。我國對山羊支原體山羊肺炎亞種的檢測主要采用病原分離及PCR鑒定。但支原體體外培養(yǎng)要求較高且培養(yǎng)周期長不適合臨床疾病的快速診斷。PCR檢測具有特異性高的優(yōu)點但對人員與試驗條件要求較高。而ELISA檢測方法操作簡單且不需要特定設(shè)備,還可對大批量的血清樣品進行檢測。因此本試驗選擇建立一種間接ELISA檢測方法對山羊支原體山羊肺炎亞種抗體進行檢測。

由于支原體的基因組G、C含量較低,Mccp 87001全基因組測序發(fā)現(xiàn) GC含量為23.68%,91.2%的密碼子在擺動位置有A或T,導致75.9%的基因有TAA終止密碼子[8],且在支原體表達時編碼色氨酸的TGA在大腸埃希氏菌表達系統(tǒng)中為終止密碼子,若目的基因中含有TGA則表達時會直接終止,因此,在包被抗原的選擇上極為困難。經(jīng)查閱文獻及對NCBI上已公布的10株Mccp進行序列比對[8],發(fā)現(xiàn)0507基因具有較高的保守性;且基因中僅在19-21位含1個TGA,可通過引物設(shè)計將其直接突變?yōu)橥瑯泳幋a色氨酸的TGG[9];表明0507能夠作為ELISA檢測的包被抗原,可用來進行Mccp實驗室診斷和流行病學調(diào)查。

本試驗通過克隆0507基因,構(gòu)建原核表達載體建立了一種間接ELISA檢測方法。該檢測方法特異性較強、靈敏度高、重復性好,對282份臨床樣品進行檢測時有37份血清為陽性,山羊支原體山羊肺炎亞種抗體陽性率為13.1%,我國山羊支原體山羊肺炎亞種抗體陽性率范圍在10%左右[10-12],本方法檢測的陽性率與其一致。說明本試驗建立的檢測方法可用于Mccp的檢測與流行病學調(diào)查。