金丁萍,胡燕燕,倪凱文,陳來娟,楊曉煊,陸 群

浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院,浙江杭州 310009

當前支氣管鏡的臨床應用越來越普及,其管腔狹小、結(jié)構(gòu)復雜的特點使其護理清洗尤為困難,若基礎護理、消毒滅菌和儲存不規(guī)范,容易導致醫(yī)院感染發(fā)生。2019年美國公布的十大醫(yī)療危害技術(shù)中,明確指出了內(nèi)鏡是增加醫(yī)院感染的風險因素[1]。在各種內(nèi)鏡中支氣管鏡的細菌檢出率最高,達到40%,尤其是內(nèi)腔細菌檢出率高達57.14%[2]。因此,保證支氣管鏡清洗、消毒、滅菌的效果非常重要,定期開展消毒效果的質(zhì)量監(jiān)測尤為重要。目前國內(nèi)按照GB 15982-2012《醫(yī)院消毒衛(wèi)生標準》,采用常規(guī)法進行病原微生物檢測,但檢測的敏感性較低,尤其對于少見、難培養(yǎng)的病原體檢出困難。宏基因組二代測序(metagenomic next-generation sequencing,mNGS)是近年來新發(fā)展起來的一種微生物檢測技術(shù),具有靈敏度、準確性和檢測效率高的優(yōu)勢[3],在臨床疑難復雜感染的診斷中發(fā)揮了巨大價值,但尚未應用于內(nèi)鏡消毒效果監(jiān)測中。本研究對經(jīng)過規(guī)范消毒滅菌后的支氣管鏡進行mNGS檢測,并與常規(guī)培養(yǎng)法進行比較,初步評價mNGS對支氣管鏡消毒滅菌效果監(jiān)測的價值。

1 材料與方法

1.1 研究材料

2022年6月,隨機抽取某三級甲等綜合性醫(yī)院內(nèi)鏡室按規(guī)范流程清洗、過氧乙酸高水平消毒滅菌后的支氣管鏡8根(日本產(chǎn)),分別為型號BF-P260F(1根)、BF-260(1根)、BF-F260(1根)、BF-IT260(2根)、BF-UC260FW(1根)、BF-P60(2根)。嚴格遵循無菌操作原則,使用50 mL注射器抽取50 mL含相應中和劑的無菌液,從支氣管鏡的活檢口注入并全量收集至無菌瓶內(nèi),分別標記為樣本C1～C8待檢。準備8根新啟用并經(jīng)過清洗和滅菌處理的清洗刷,從8根支氣管鏡活檢口插入,按10～15 cm的行進間距從上往下來回刷洗,直達出口處,約3 min后抽出清洗刷,同上采用50 mL無菌液從活檢口沖洗支氣管鏡,收集樣本標記為S1～S8待檢。

1.2 方法

1.2.1試劑與儀器

高通量測序相關試劑(武漢產(chǎn))、營養(yǎng)瓊脂(英國產(chǎn)),MGISEQ-2000測序平臺(深圳產(chǎn))、抽濾泵和0.45 μm一次性過濾杯(美國產(chǎn))。

1.2.2檢測人員

所有樣本均由醫(yī)院感染管理科專職護士采集,送微生物實驗室進行檢測。檢測人員為檢驗科專職人員,具有相應檢測資質(zhì)。

1.2.3操作方法

1.2.3.1 常規(guī)微生物培養(yǎng)方法

按照GB 15982-2012《醫(yī)院消毒衛(wèi)生標準》消毒后內(nèi)鏡的監(jiān)測方法,將C1～C8、S1～S8共16份樣本分別取1 mL接種平皿,將預先冷卻至45℃的營養(yǎng)瓊脂每平皿傾注20 mL,經(jīng)35℃培養(yǎng)2 d后記錄第一次菌落數(shù),繼續(xù)培養(yǎng)至7 d后,記錄第二次菌落數(shù)。將剩余洗脫液的2/3量在無菌條件下采用0.45 μm濾膜過濾濃縮,分別將濾膜接種于已凝固的營養(yǎng)瓊脂平板上,經(jīng)35℃培養(yǎng)2 d、7 d后分別記錄菌落數(shù)。

1.2.3.2 mNGS檢測方法

將經(jīng)微生物常規(guī)培養(yǎng)后剩余的樣品(1/3的量)用0.45 μm濾膜過濾,按4份樣本過濾在同一張膜上;然后將濾膜放入50 mL無菌離心管內(nèi),用10 mL無菌等滲鹽水震蕩洗脫10 min,取出濾膜后將10 mL的液體以12 000 rpm離心5 min,棄上清,沉淀備用。獲取沖洗液和刷洗液各2管,分別標記為C1～C4、C5～C8、S1～S4、S5～S8,共4份樣本用于后續(xù)的mNGS方法檢測病原微生物。4份用于mNGS檢測的樣本采用柱提法提取核酸,并用限制性內(nèi)切酶進行處理以打斷核酸。核酸片段主要通過末端修復、添加接頭、核酸磁珠純化進行文庫的構(gòu)建;根據(jù)濃度混合核酸,環(huán)化擴增文庫得到DNB(DNA nanoball,DNA納米球);隨后通過儀器氣液系統(tǒng)將DNB泵入到芯片并加以固定,然后泵入測序試劑進行測序分析。每次檢測均設置陰性對照和陽性對照。

1.2.4評價方法

1.2.4.1 常規(guī)微生物培養(yǎng)結(jié)果評價方法

菌落總數(shù)(CFU/件)=兩平行平板的平均菌落數(shù)(CFU/平板)+濾膜上菌落數(shù)(CFU/濾膜)。

1.2.4.2 mNGS檢測結(jié)果評價方法

宏基因組測序數(shù)據(jù)下機數(shù)據(jù)經(jīng)過服務器生物信息學分析得到初步報告,由實驗室具有生物信息學背景的臨床微生物專家解讀,主要依據(jù)同批次的陰陽性對照及以往對臨床樣本分析的經(jīng)驗積累進行報告。主要評價指標包括嚴格比對序列數(shù) (strict mapping reads number,SMRN)、深度(depth)、標準化為1M序列數(shù)(reads per million,RPM)。SMRN:指匹配到該病原體的序列數(shù)目,其多少與標本中病原體本身載量負荷、核酸提取量、人源序列比例等有關,序列數(shù)越高,表示標本中檢測到該病原體的可信度越高。深度:指該微生物基因組上某段序列被檢測到的次數(shù),深度參數(shù)越大表示該微生物被檢測到的可靠性越高。RPM:指每百萬測得序列中比對到目標物種基因組的序列條數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 常規(guī)微生物培養(yǎng)的結(jié)果

16份樣本經(jīng)傾注法和濾膜法培養(yǎng)2 d和7 d后,均未檢出病原微生物。

2.2 mNGS檢測結(jié)果

混合后的4份樣本經(jīng)初步生物信息學分析檢出不同序列數(shù)的抗輻射不動桿菌、銅綠假單胞菌、腐生葡萄球菌、豚鼠氣單胞菌、金黃色葡萄球菌、遜德勒不動桿菌、卡他莫拉菌、巴斯德葡萄球菌等,其中每份標本均檢出銅綠假單胞菌。相同內(nèi)鏡混合后的刷洗液與對應的沖洗液比較,檢出菌種數(shù)、序列數(shù)沒有明顯增加,未檢出特殊、難培養(yǎng)的病原微生物,見表1和表2。陰性對照中也包含不同序列的上述菌種,經(jīng)微生物專家結(jié)合陰陽性對照及臨床經(jīng)驗,進一步分析認為,4份樣本檢出菌均屬于背景菌。

表1 mNGS檢測8根支氣管鏡沖洗液的微生物結(jié)果

表2 mNGS檢測8根支氣管鏡刷洗液的微生物結(jié)果

3 討論

3.1 微生物培養(yǎng)法能滿足當前標準法處理支氣管鏡后滅菌效果評價的需求

近年來,隨著內(nèi)鏡技術(shù)的發(fā)展及在臨床中的廣泛應用,軟式內(nèi)鏡使用后的消毒效果評估越來越受到關注。本研究中的8根內(nèi)鏡在高水平消毒及滅菌后分別采用沖洗和刷洗兩種方法采集樣本,并按GB 15982-2012《醫(yī)院消毒衛(wèi)生標準》中的要求進行微生物培養(yǎng),結(jié)果常規(guī)微生物培養(yǎng)2 d、7 d均為陰性,說明按照目前清洗、消毒、滅菌的標準處理支氣管鏡能夠達到要求。但通過常規(guī)培養(yǎng)法檢測病原微生物的種類有限,無法檢出特殊難培養(yǎng)的細菌、非典型病原體、病毒等;而且受限于細菌的生長特性,出報告時間2～15 d不等[4]。因此,采用該技術(shù)監(jiān)測支氣管鏡的消毒效果存在假陰性的風險。

3.2 mNGS用于支氣管鏡滅菌效果的評價在性價比上并沒有優(yōu)勢

mNGS可同時對數(shù)十萬到數(shù)百萬條DNA/RNA分子序列讀取,單次運行即可實現(xiàn)對細菌、真菌、病毒、寄生蟲以及非典型病原體的鑒定,尤其是能夠檢出未知及難培養(yǎng)病原體。且檢測速度快,在感染性疾病診斷中具有重要價值[5]。本研究對8根支氣管鏡的沖洗液和刷洗液進行mNGS檢測,結(jié)果檢出均為背景菌,未見難培養(yǎng)和特殊的病原體,這與王萍等[6]的研究結(jié)果一致。此外,支氣管鏡容易形成生物膜,是導致內(nèi)鏡消毒、滅菌失敗的主要原因。即使嚴格按照規(guī)范對支氣管鏡進行清洗消毒,生物膜仍無法被徹底清除,存在交叉感染的風險[7]。對比本研究中刷洗液、沖洗液的mNGS檢測結(jié)果,發(fā)現(xiàn)刷洗后并未見微生物構(gòu)成和序列數(shù)的明顯增加,可能與該批次支氣管鏡的日常清洗和維護較好、沒有明顯的生物膜形成有關。此外,mNGS檢測的成本明顯高,對于常規(guī)支氣管鏡滅菌效果的評價并不合適。

3.3 mNGS用于支氣管鏡滅菌效果的評價還需要更多研究

由于本研究是首次對支氣管鏡的沖洗液和刷洗液進行mNGS檢測,對標本質(zhì)量控制、結(jié)果解讀還缺乏統(tǒng)一標準,且二代測序技術(shù)敏感度高、背景核酸干擾、外源性核酸污染、定植菌的混雜等容易導致假陽性結(jié)果,檢測出的病原微生物基因片段也可能是經(jīng)過高水平消毒滅菌后死亡病原體的殘骸。因此,本研究認為研究中mNGS未檢出特殊、難培養(yǎng)的病原體才具有重要的臨床價值,而對檢出常見病原微生物及其序列數(shù)高低的臨床意義還有待明確,需要排除檢測過程中的污染,并結(jié)合培養(yǎng)法的結(jié)果做出綜合判斷。

3.4 本研究的局限性

首先是選取的支氣管鏡數(shù)量有限,沒有對支氣管鏡使用的年限進行分層。第二,因為考慮研究成本,沒有對每根支氣管鏡的樣本逐個進行mNGS檢測,而是將8根支氣管鏡的沖洗、刷洗的16個樣本合并成4份,不能區(qū)分單根支氣管鏡的情況。第三,由于缺乏內(nèi)鏡采樣標本質(zhì)量控制和結(jié)果解讀的標準,對mNGS檢測結(jié)果的精準判斷還有待更多的研究。

(致謝:感謝護理部封秀琴主任、醫(yī)院感染管理科董麗老師對本研究的悉心指導!)