楊好好 岑夢姣 王佳萍

急性淋巴細胞白血?。╝cute lymphocytic leukemia，ALL）由骨髓、血液和髓外部位淋巴祖細胞的惡性轉化和增殖引起，70%的患者為兒童[1]。雖然化療藥物治療兒童ALL 有一定療效，但引起的藥物不良反應不容忽視[2-4]。因此，尋找靶標明確、更為低毒有效的治療藥物對提高患者的生存質(zhì)量具有重大意義。安羅替尼具有抗腫瘤血管生成和抑制腫瘤生長的作用[5-6]，多種實體瘤的臨床試驗正在開展[7-8]。研究表明，安羅替尼通過抑制磷脂酰肌醇3 激酶（phosphoinositide 3 kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路降低B 細胞-ALL（B cell-ALL，BALL）細胞的活力[9]。然而，安羅替尼是否具有其他潛在的靶點仍待闡明。Abelson 酪氨酸蛋白激酶1（Abelson tyrosine kinase 1，ABL1）是一種酪氨酸激酶，由于染色體易位形成斷點聚集區(qū)域（breakpoint cluster region，BCR）-ABL1 融合基因，部分BCR 基因和ABL1基因融合成一個新的BCR-ABL1 融合基因，導致產(chǎn)生異常的蛋白激酶BCR-ABL1[10]。研究發(fā)現(xiàn)，靶向PI3K/PKB/mTOR 信號通路的藥物在ABL1 融合陽性的細胞中具有更好的抑制效果[11]。因此，ABL1 可能是治療ALL 的潛在靶點。本研究通過細胞實驗及生物信息學分析，探討安羅替尼在兒童T 細胞-ALL（T cell-ALL，T-ALL）中的潛在作用，并分析其作用機制，現(xiàn)將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 材料和儀器 鹽酸安羅替尼由正大天晴藥業(yè)提供（規(guī)格：12 mg；批號：H20180004），兒童T-ALL 細胞CCRF-CEM 和J.gamma1（分別來源于3 歲11 個月和14歲患兒）購于浙江如耀生物科技有限公司，膜聯(lián)蛋白V/碘化丙啶（annexin V/propidium iodide，Annexin V/PI）雙染細胞凋亡檢測試劑盒（批號：556547）購于美國BD公司，BCR-ABL1（批號：3009）、ABL1（批號：2862）、p-PKB（批號：4047）、PKB（批號：11848）、p-PI3K（批號：17366）、PI3K（批號：4255）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（批號：5174），凋亡蛋白Caspase-3（批號：9662）、cl-Caspase-3（批號：9661）、cl-PARP（批號：5625）、Bax（批號：14796）、Bcl-2（批號：4223）抗體均購自美國CST 公司，細胞培養(yǎng)采用的RPMI1640 培養(yǎng)基（批號：BL303A）購于北京白鯊易公司，F(xiàn)BS（批號：10099141）、青霉素-鏈霉素（批號：15070063）均購于美國Gibco 公司，PKB激活劑SC79（305834-79-1）購于德國Merck 公司。倒置顯微鏡（型號：ECLIPSE Ti2）購于日本Nikon 公司，多功能酶標儀（型號：SpectraMax M）購于美國molecular devices 公司，化學發(fā)光成像系統(tǒng)（型號：ChemiDoc-It Imaging System）購于美國UVP 公司，流式細胞儀（型號：Attune）購于美國Thermo 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 將CCRF-CEM 和J.gamma1細胞培養(yǎng)在含有10%FBS 的RPMI1640 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中。每2～3 d 取出，以800 r/min 離心3 min 后棄上清液，并以1∶2～1∶4 傳代，培養(yǎng)至對數(shù)生長期后用于下一步實驗。

1.2.2 細胞活性檢測 收集處于對數(shù)增長期且生長狀態(tài)良好的細胞，將細胞懸液按1×104個細胞/孔接種到96 孔板中，細胞培養(yǎng)箱孵育過夜。加入稀釋好的不同濃度的安羅替尼，使終濃度為0、0.25、0.5、1、2.5、5、10、15 μmol/L，每個濃度設3 個復孔。細胞培養(yǎng)箱中孵育48 h 后，每孔加入20 μL 細胞計數(shù)套件-8（cell counting kit-8，CCK-8）溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，用酶標儀檢測450 nm 處的吸光度（OD）值，計算抑制率，抑制率（%）=（1-實驗組OD 值/對照組OD 值）×100%，并計算半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）。

1.2.3 細胞凋亡檢測 通過Annexin V/PI 雙重染色，確定細胞凋亡水平。根據(jù)CCK-8 法測得的IC50，分別設置安羅替尼低、中、高濃度組（1.25、2.5 和5 μmol/L）及對照組（0 μmol/L），細胞經(jīng)不同濃度處理24 h 后，800 r/min 離心5 min，棄上清液，將細胞懸浮在結合緩沖液中。加入5 μL Annexin V 和5 μL PI 溶液到細胞懸液中，室溫避光孵育15 min。使用流式細胞儀檢測細胞早期（細胞開始發(fā)生凋亡的初期階段）和晚期（細胞凋亡的進一步發(fā)展階段）的凋亡率。本實驗重復3次。

1.2.4 藥物靶標預測 通過Pubchem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）獲得安羅替尼的簡化分子線性輸入規(guī)范（simplified molecular input line entry system，SMILE）號，而 后 利 用SEA（sea. bkslab. org/）、MolTarPred（moltarpred.marseille.inserm.fr/）和Swisstarget（swisstargetprediction.ch/index.php）等在線小分子靶標預測網(wǎng)站，對安羅替尼的作用靶標進行預測。從Genecard（https://www.genecards.org/）上獲取與ALL 相關的基因。通過生物信息網(wǎng)站制作安羅替尼和ALL 的交集（http://www.bioinformatics.com.cn）。從PDB（rcsb.org/）上獲取目標蛋白ABL1 的3D 結構（PDB ID：4wa9），利用Vina2進行安羅替尼與ABL1 蛋白結合的模擬對接。使用Pymol 軟件將對接結果進行可視化。

1.2.5 京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析 將安羅替尼潛在作用靶標列表導入DAVID 在線數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov），進行KEGG 通路富集分析。

1.2.6 凋亡蛋白表達水平檢測 采用Western blot 法。收集經(jīng)安羅替尼處理后的CCRF-CEM 和J.gamma1 細胞，在冰上加入RIPA 細胞裂解液裂解10 min，4 ℃下12 000 r/min，離心后取出上清液并用雙硫鍵還原劑（bicinchoninic acid，BCA）法進行定量，加熱煮沸使蛋白變性。經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺膠電泳分離總蛋白，隨后轉移到聚偏二氟乙烯膜上，室溫下5%脫脂牛奶封閉1 h，加入一抗于4 ℃孵育過夜，將膜用TBST 洗滌3 次后，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育2 h，再洗膜3 次，加入ECL 用化學發(fā)光成像系統(tǒng)成像。用Image J 對蛋白條帶進行量化，以GADPH 為內(nèi)參計算蛋白相對表達量。

1.2.7 ABL1/PI3K/PKB 信號通路蛋白檢測 采用Western blot 法。收集經(jīng)0、1.25、2.5、5 μmol/L 安羅替尼處理48 h 后的CCRF-CEM 和J.gamma1 細胞，檢測不同濃度安羅替尼對BCR-ABL1 的影響。之后，根據(jù)安羅替尼對ABL1 的抑制作用，并可能抑制下游PI3K/PKB 通路，給予5 μmol/L SC79 進行回復實驗，以驗證該通路中的蛋白表達量變化。蛋白提取和檢測方法同1.2.6。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件，計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度安羅替尼對ALL 細胞增殖及形態(tài)的影響 在不同濃度安羅替尼作用下，CCRF-CEM 和J.gamma1 細胞的增殖受到抑制，且抑制率隨濃度的增加而增加（F=317.6、342.1，均P＜0.05），見圖1A。CCRFCEM 和J.gamma1 細胞在48 h 的IC50值分別為3.39、2.36 μmol/L。顯微鏡下顯示，隨著安羅替尼濃度的增加，細胞數(shù)量減少，輕微皺縮，推測存在細胞凋亡，見圖1B。

圖1 不同濃度安羅替尼對CCRF-CEM 和J.gamma1 細胞增殖及細胞形態(tài)的影響（A：不同濃度安羅替尼對CCRF-CEM 和J.gamma1細胞的抑制率；B：不同濃度安羅替尼作用下CCRF-CEM 和J.gamma1 細胞顯微鏡下所見，×100）

2.2 不同濃度安羅替尼對T-ALL 細胞凋亡的影響隨著安羅替尼濃度的增加，ALL 細胞發(fā)生凋亡，凋亡率隨著濃度的增加而增加，與對照組比較，高濃度組CCRF-CEM、J.gamma1 早期及晚期凋亡率均增加（均P＜0.01），見表1。細胞凋亡相關蛋白的表達水平顯示，安羅替尼抑制了抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達，促進了凋亡促進蛋白Bax 和cl-PARP 的表達，提高了Caspase-3的活化，并呈現(xiàn)劑量依賴性，高濃度組cl-PARP 和Bax升高最為顯著（P＜0.05），見圖2。

表1 不同濃度安羅替尼作用下CCRF-CEM、J.gamma1 細胞的凋亡率比較

圖2 不同濃度安羅替尼對凋亡相關蛋白表達的影響（A：CCRF-CEM 細胞中凋亡相關蛋白的電泳圖；B：J.gamma1 細胞中凋亡相關蛋白的電泳圖；C：CCRF-CEM 細胞免疫印跡量化結果；D：J.gamma1 細胞免疫印跡量化結果；與對照組比較，aP＜0.05）

2.3 安羅替尼靶標分析以及與ABL1 分子對接結果KEGG 通路富集得到13 條信號通路，見圖3A（插頁），主要涉及Ras、Rap1、PI3K-PKB、NF-κB 信號，造血細胞系，癌癥的碳代謝，表明安羅替尼可能作用于這些信號通路抑制細胞增殖。通過多個靶標預測網(wǎng)站的結果得到交集為ABL1 見圖3B（插頁），分子對接顯示安羅替尼與ABL1 的潛在結合能為-8.8 kcal/mol 見圖3C（插頁），與氨基酸殘基Met318 之間產(chǎn)生氫鍵，與氨基酸殘基Leu248、Leu370、Phe382、Ala269、Lys271、Val256、Ala380 之間存在疏水相互作用，表明安羅替尼與ABL1 結合能較強。

圖3 安羅替尼靶標分析以及其與ABL1 分子對接結果圖（A：KEGG 富集得到13 條通路，Y 軸代表路徑的名稱，X 軸表示靶向的基因背景的基因的比例，點的大小表示該通路中包含的基因與輸入基因列表交集的基因數(shù)；B：不同網(wǎng)站對安羅替尼靶點預測的韋恩圖；C：安羅替尼與ABL1 分子對接示意圖）

2.4 不同濃度安羅替尼對ABL1/PI3K/PKB 蛋白表達和細胞活性的影響 安羅替尼作用于CCRF-CEM 和J.gamma1 細胞后，BCR-ABL1 的表達均降低（均P＜0.05）。加入SC79 后，兩種細胞內(nèi)p-PKB/PKB 表達均升高（均P＜0.05），逆轉了安羅替尼對ABL1/PI3K/PKB通路的抑制效果，見圖4。

圖4 不同濃度安羅替尼對ABL1/PI3K/PKB 蛋白表達和細胞活性影響（A：不同濃度安羅替尼對BCR-ABL1 蛋白表達的電泳圖及量化結果；B：加入SC79 后，安羅替尼對BCR-ABL1/PI3K/PKB 表達的電泳圖及量化結果；與對照組比較，aP＜0.05；與SC79 組相比，bP＜0.05）

3 討論

T-ALL 會導致患者造血功能受損和骨髓衰竭[12-13]。臨床上治療手段有限，仍以化療（如甲氨蝶呤、糖皮質(zhì)激素、長春新堿等）或者骨髓移植為主，但藥物治療往往伴隨著較大的不良反應[3,14]，且易出現(xiàn)耐藥[15-16]。因此，開發(fā)新的T-ALL 治療藥物迫在眉睫。安羅替尼是國內(nèi)自主研發(fā)的酪氨酸激酶抑制劑，在多種實體瘤中具有抗腫瘤作用[17-18]，但是對于血液腫瘤的應用鮮有報道。最新的研究表明，安羅替尼通過抑制PI3K/PKB/mTOR 途徑誘導B-ALL 細胞的凋亡，引起G2/M 周期的停滯[9]，這為安羅替尼治療ALL 提供了重要的研究基礎。為探討安羅替尼對T-ALL 抑制效果，本研究發(fā)現(xiàn)，安羅替尼對T-ALL 細胞株J.gamma1 有更好的抑制作用，高濃度能顯著抑制T-ALL 細胞增殖，并導致細胞皺縮。進一步研究發(fā)現(xiàn)，安羅替尼可劑量依賴性促進Caspase-3 的活化以及促凋亡相關蛋白，如Bax 和cl-PARP 等表達，最終引起T-ALL 細胞凋亡，與在其他實體瘤中的研究結果一致[19-20]。

通過生物信息學方法預測安羅替尼靶標結果表明，主要靶標可能涉及Ras、Rap1、PI3K-PKB、NF-κB等信號通路，造血細胞系，癌癥的中樞碳代謝，表明安羅替尼可能作用于這些信號通路抑制腫瘤的進展。但以上預測結果的具體機制仍有待研究驗證。進一步的分子對接結果顯示，BCR-ABL1 是安羅替尼治療ALL 的潛在靶標，BCR-ABL1 是腫瘤治療重要靶點[21]。ABL1 活化后可進一步激活PI3K/PKB，而PI3K/PKB/mTOR 信號通路在BCR-ABL1 陽性ALL 患者中被顯著激活[22]，通過抑制BCR-ABL1 能夠誘導ALL 細胞的凋亡，抑制細胞活性。給予PKB 激活劑后顯著削弱安羅替尼誘導的ALL 細胞凋亡，這些結果均證實，安羅替尼通過抑制BCR-ABL1/PI3K/PKB 信號通路抑制CCRFCEM 和J.gamma1 細胞的增殖。臨床上，甲磺酸伊馬替尼特異性靶向BCR-ABL1 融合基因，不僅廣泛用于慢性粒細胞白血病的治療[23]，而且也使T-ALL 患者獲得持久的血液學緩解[24]，提示靶向抑制BCR-ABL1 也有望在T-ALL患者中獲益。

綜上所述，安羅替尼可能通過BCR-ABL1/PI3K/PKB 信號通路發(fā)揮抗ALL 作用，并可誘導細胞凋亡。本研究也為安羅替尼治療BCR-ABL1 陽性的ALL 患者提供了重要的研究基礎，后續(xù)將重點考察安羅替尼在T-ALL 動物模型中的應用，并探討最佳的給藥劑量。