徐孟驊 王忠華 王靜 朱曉鋒 李雯 李勇

房顫是臨床上最常見(jiàn)的心律失常類(lèi)型，也是栓塞性卒中的最重要原因，已成為世界范圍內(nèi)的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1-2]。由于導(dǎo)管消融治療房顫復(fù)發(fā)率較高[3]，而藥物治療可能發(fā)生心律失常或出血等并發(fā)癥[4]，故迄今為止仍缺乏令人滿(mǎn)意的方法。上游治療是近年來(lái)提出的一種新方法，這種方法基于房顫發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制，其應(yīng)用涵蓋了所有類(lèi)型的房顫，并顯示了良好的療效前景[5]。心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)和電重構(gòu)是房顫的兩個(gè)重要特征，可導(dǎo)致房顫的發(fā)生和維持[6]。近年來(lái)，許多研究表明，一些miRNA 與房顫心房肌的電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)有關(guān)，且是發(fā)生房顫的關(guān)鍵因素[7-8]，心臟組織中富含的miR-208a 是許多疾病潛在的生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)[9-11]。β-catenin 信號(hào)傳導(dǎo)途徑是可調(diào)節(jié)細(xì)胞存活、死亡和增殖的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)[12]。許多研究報(bào)道，β-catenin 在房顫的發(fā)生和發(fā)展中起著重要作用[13-14]。還有研究發(fā)現(xiàn)，miR-208a 可以通過(guò)調(diào)節(jié)β-catenin 在腫瘤等疾病中發(fā)揮作用[15]。本研究通過(guò)建立快速起搏兔心房模型，探討miR-208a 在心房肌電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)中的作用，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑 健康新西蘭大耳白兔40 只購(gòu)自徐州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，體重2.7～3.1（2.9±0.2）kg，不分性別。活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，丙二醛（malondialdehyde MDA）檢測(cè)試劑盒和超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，agomiR-208a 和antagomiR-208a 試劑購(gòu)自上海源葉生物技術(shù)有限公司，聚合酶鏈反應(yīng)試劑盒和抗體購(gòu)自北京博奧森生物。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組和預(yù)處理 采用隨機(jī)區(qū)組分組法將40 只兔分為假手術(shù)組（SHAM 組）、快速起搏組（RAP組）、快速起搏+ agomiR-208a 組（miR-208a 組）和快速起搏+ antagomiR-208a 組（antmiR-208a 組），每組各10只。實(shí)驗(yàn)前，將所有兔子放入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。建模前3 天，每天向miR-208a 組和antmiR-208a 組兔子靜脈注射agomiR-208a 和antagomiR-208a，30 mg/kg，其余兩組兔子靜脈注射等量的0.9%氯化鈉注射液。本研究經(jīng)過(guò)杭州市余杭區(qū)第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查通過(guò)（批準(zhǔn)文號(hào)：yhqy221210）。

1.2.2 心房快速起搏模型的構(gòu)建 通過(guò)兔耳靜脈緩慢注入1%的戊巴比妥鈉2 ml/kg。麻醉誘導(dǎo)成功后通過(guò)留置針維持麻醉。切開(kāi)并分離氣管，進(jìn)行氣管插管，動(dòng)物呼吸機(jī)輔助通氣。經(jīng)右頸內(nèi)靜脈將10 極冠狀竇電極送到右心房，并將胸腔導(dǎo)聯(lián)V1連接到冠狀竇的遠(yuǎn)端臀部線(xiàn)。連接BL-420s 生物功能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，并以比竇性心律高10%～20%的頻率釋放連續(xù)刺激。當(dāng)腔內(nèi)導(dǎo)聯(lián)和體表導(dǎo)聯(lián)心電圖同時(shí)觀(guān)察到心房心室1∶1 傳導(dǎo)時(shí)，提示心房完全起搏。維持冠狀竇電極的位置，并且以2 倍于舒張期閾值的電壓、600 次/min 的起搏頻率進(jìn)行12 h 連續(xù)心房刺激。

1.2.3 心房有效不應(yīng)期（atrial effective refractory period，AERP）及頻率適應(yīng)性測(cè)定 將2 倍于舒張起搏閾值作為輸出電壓，并將脈沖寬度設(shè)置為0.5 ms，測(cè)定基本條件下AERP。程序性過(guò)早刺激（S1S2）采用的刺激頻率為8∶1。以10 ms 的步長(zhǎng)和30 s 的間隔執(zhí)行遞減掃描。不應(yīng)期定義為在S1S2 刺激時(shí)S2 后不誘導(dǎo)心房激動(dòng)的最長(zhǎng)間期；重復(fù)測(cè)定3 次取其均值作為AERP 基線(xiàn)值。分別測(cè)量S1S1 為200、150 ms 時(shí)的AERP200、AERP150，頻率適應(yīng)性表示為AERP200-AERP150。

1.2.4 心房心肌組織病理學(xué)檢查 起搏后，通過(guò)靜脈注射100 mg/kg 戊巴比妥鈉處死白兔。無(wú)菌開(kāi)胸取出心臟，切開(kāi)后立即用緩沖鹽水（pH 7.4）洗滌，去除紅細(xì)胞和血塊后稱(chēng)重。心房心肌組織樣本立即用0.9%氯化鈉溶液洗滌，并在10%磷酸鹽緩沖的甲醛溶液中固定24 h。脫水后石蠟包埋、切片，HE染色下觀(guān)察心肌組織。

1.2.5 miR-208a 表達(dá)水平、SOD 活性、MDA 及ROS 水平檢測(cè) 采用RT-PCR 法。根據(jù)說(shuō)明書(shū)使用Trizol 試劑從心房心肌組織中提取總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟合成互補(bǔ)脫氧核糖核酸（complementary DNA，cDNA）。對(duì)miR-208a 表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)，反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性10 s，60 ℃退火40 s，共40 個(gè)循環(huán)。以U6 作為miRNA 內(nèi)參，引物序列見(jiàn)表1。以2-ΔΔCt法計(jì)算miR-208a 的相對(duì)表達(dá)水平；使用相應(yīng)的檢測(cè)試劑盒檢測(cè)心房心肌組織中SOD 活性、MDA 及ROS 水平。

表1 引物序列

1.2.6 β-catenin 蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blot 法。使用補(bǔ)充了蛋白酶抑制劑的組織蛋白提取試劑盒（美國(guó)Roche 公司）獲得心房心肌組織樣本的全細(xì)胞裂解物。按BCA 蛋白測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定總蛋白濃度，定量后變性制成樣本。在10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠中通過(guò)電泳分離等量的蛋白質(zhì)，然后將其轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，在5%的脫脂牛奶中室溫封閉1 h，用1×TBST 洗膜后在4 ℃孵育一抗過(guò)夜，1×TBST 洗膜后室溫孵育相應(yīng)的二抗1 h，洗滌后進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯影檢測(cè)，以β-actin 為內(nèi)參校正，用圖像灰度分析軟件進(jìn)行灰度分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；連續(xù)型重復(fù)計(jì)量資料間比較使用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組miR-208a 表達(dá)水平比較 RAP 組miR-208a表達(dá)水平均低于SHAM 組和miR-208a 組（均P＜0.05），而高于antmiR-208a 組（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 各組miR-208a 表達(dá)水平比較

2.2 各組在200ms 和150ms 時(shí)AERP 比較 在SHAM組中，隨著起搏時(shí)間的延長(zhǎng)，在200 ms 和150 ms 時(shí)AERP 無(wú)明顯變化（均P＞0.05）；其余組中，隨著起搏時(shí)間的延長(zhǎng)，AERP 逐漸縮短（均P＜0.05）。與SHAM組相比，RAP 組在200 ms 和150 ms 時(shí)AERP 縮短（均P＜0.05）。與RAP 組相比，miR-208a 組在200 ms 和150 ms 時(shí)的4、8、12 h 各時(shí)間點(diǎn)AERP 增加（均P＜0.05），而antmiR-208a 組的AERP 縮短（P＜0.05）。見(jiàn)表2～3。

表2 各組在200 ms 時(shí)AERP 比較（ms）

表3 各組在150 ms 時(shí)AERP 比較（ms）

2.3 各組AERP 頻率適應(yīng)性比較 SHAM 組隨著起搏時(shí)間的延長(zhǎng)，AERP 頻率適應(yīng)性在12 h 內(nèi)無(wú)明顯變化（P＞0.05），而其余組均減低（均P＜0.01）。與SHAM組相比，RAP 組的AERP 頻率適應(yīng)性在8、12 h 時(shí)間點(diǎn)時(shí)均減低（均P＜0.01）；與RAP 組相比，miR-208a 組在8、12 h 時(shí)間點(diǎn)時(shí)的AERP 頻率適應(yīng)性均增加（均P＜0.01），而antmiR-208a 組均減低（均P＜0.05）。見(jiàn)表4。

表4 各組AERP 頻率適應(yīng)性比較（ms）

2.4 各組心肌組織病理檢查結(jié)果 SHAM 組兔心肌纖維結(jié)構(gòu)完整，排列整齊、有序，見(jiàn)圖2A；RAP 組可見(jiàn)心肌細(xì)胞肥大，細(xì)胞核大小不規(guī)則，許多細(xì)胞核顯示凝結(jié)，心肌纖維紊亂、在某些區(qū)域破裂和溶解，見(jiàn)圖2B。與RAP 組比較，miR-208a 組的心肌組織病理變化明顯減輕，大多數(shù)核呈正常狀態(tài)，多數(shù)的心肌纖維未顯示破裂，其排列有序，見(jiàn)圖2C；相反，antmiR-208a 組的心肌組織纖維排列紊亂、破裂和溶解等病理變化更為嚴(yán)重，見(jiàn)圖2D。

圖2 各組心肌組織病理圖片（A：SHAM 組；B：RAP 組；C：miR-208a 組；D：antmiR-208a 組；HE 染色，×200）

2.5 各組心肌組織氧化應(yīng)激指標(biāo)比較 與RAP 組相比，miR-208a 組MDA、ROS 水平降低，SOD 活性升高（均P＜0.05），而antmiR-208a 組MDA、ROS 水平升高，SOD 活性降低（均P＜0.05），見(jiàn)表5。

表5 各組心肌組織氧化應(yīng)激指標(biāo)比較

2.6 各組β-catenin 蛋白表達(dá)比較 與SHAM 組相比，RAP 組β-catenin 表達(dá)水平增加（P＜0.01）；與RAP 組相比，antmiR-208a 組β-catenin 表達(dá)水平升高，而miR-208a 組降低（均P＜0.01）。見(jiàn)圖3。

圖3 各組β-catenin 表達(dá)的電泳圖及表達(dá)水平比較

3 討論

房顫的發(fā)病機(jī)制相當(dāng)復(fù)雜，目前研究表明，房顫主要涉及結(jié)構(gòu)重構(gòu)和電重構(gòu)[16-17]。心房肌電重構(gòu)可能導(dǎo)致離子通道功能部分喪失，離子通道異常電流變化與Ca2+和K+的細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)，這種變化可能會(huì)促進(jìn)房顫的維持。心房結(jié)構(gòu)重構(gòu)也是房顫發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因素，心房膠原蛋白的異常合成、降解和沉積促進(jìn)心房纖維化和結(jié)構(gòu)重塑[18-19]。miRNA 是內(nèi)源的非編碼性小核糖核酸，含有21～24 個(gè)核苷酸，與它們的靶基因的3'非翻譯區(qū)結(jié)合，導(dǎo)致靶基因降解或翻譯抑制[20]。

在過(guò)去的10 年中，miRNA 已被證明可以調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)，并可用作多種心臟疾病的臨床生物標(biāo)志物，包括急性心肌梗死、心臟肥大和病毒性心肌炎[21-23]。研究表明，miR-208a 與多種心臟疾病有關(guān)，包括心臟纖維化、心臟肥大、擴(kuò)張型心肌病和心力衰竭[13-15]。miRNA 表達(dá)的變化已在許多心血管疾病中得到了證實(shí)，包括房顫[24-26]；然而，miR-208a 具體作用機(jī)制仍然需要更多的研究來(lái)闡明，特別是其在房顫中的作用機(jī)制，目前少有報(bào)道。本研究證實(shí)了RAP 組miR-208a 表達(dá)水平降低，提示miR-208a 參與了房顫的發(fā)生、發(fā)展。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-208a 的高表達(dá)可以顯著延緩快速起搏引起的AERP 縮短，頻率適應(yīng)性喪失。抑制miR-208a 的表達(dá)后，心房電重構(gòu)更為嚴(yán)重。本研究顯示，通過(guò)HE 染色，與RAP 組相比，miR-208a 組心肌纖維排列和溶解明顯改善，antmiR-208a 組心肌病理變化更為嚴(yán)重。這些發(fā)現(xiàn)與之前的研究結(jié)果一致[27]。miR-208a 參與房顫的發(fā)生、發(fā)展，miR-208a 可顯著改善快速起搏兔模型中的心房電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)。

近年來(lái)，關(guān)于β-catenin 信號(hào)通路的研究越來(lái)越多。大量研究發(fā)現(xiàn)，微核糖核酸通過(guò)調(diào)節(jié)β-catenin 信號(hào)通路參與多種心血管疾病。例如，miR-708-5p 和miR-499-5p 對(duì)β-catenin 信號(hào)通路的調(diào)控可能是心律失常性心肌病的潛在病理生理機(jī)制[28]；也有研究證明其對(duì)房顫的作用[17-18]。本研究發(fā)現(xiàn)，與SHAM 組相比，RAP 組β-catenin 的表達(dá)上調(diào)，而miR-208a 的高表達(dá)可下調(diào)β-catenin 的表達(dá)。相比之下，與RAP 組相比，抑制miR-208a 后β-catenin 的表達(dá)顯著上調(diào)，說(shuō)明miR-208a 在快速起搏兔心房模型中可能通過(guò)抑制βcatenin 的表達(dá)從而發(fā)揮改善電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)的作用。此外，許多研究發(fā)現(xiàn)，miR-208a 在心臟應(yīng)激反應(yīng)中起重要作用[29-32]。而房顫的發(fā)生、發(fā)展還包括與氧化應(yīng)激密切相關(guān)的應(yīng)激反應(yīng)[33-35]。本研究顯示，與RAP 組 相 比，miR-208a 組MDA 和ROS 水 平 均 降 低，SOD 活性升高；而antmiR-208a 組MDA 和ROS 水平均升高，SOD 活性降低。這些結(jié)果表明，miR-208a 對(duì)快速起搏兔心房模型中電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)的改善作用可能與抑制氧化應(yīng)激有關(guān)。

綜上所述，miR-208a 可以改善兔心房快速起搏模型中的電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)，這可能與減少氧化應(yīng)激和抑制β-catenin 信號(hào)通路有關(guān)。