蔣麗娟 唐福婷 景紅霞

1南京醫(yī)科大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院 南京市婦幼保健院病理科，南京 210004；2南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 江蘇省中醫(yī)院病理科，南京 210029；3南京醫(yī)科大學(xué)附屬江寧醫(yī)院病理科，南京 210000

細胞蠟塊與液基制片技術(shù)提高了細胞學(xué)腫瘤診斷的準確性［1-2］。目前，大多運用細胞蠟塊或液基制片技術(shù)行免疫細胞化學(xué)（immunocytochemistry，ICC）染色協(xié)助病理醫(yī)生診斷，但是少有文獻比較細胞蠟塊切片與液基涂片兩種不同的細胞學(xué)制片技術(shù)對ICC結(jié)果的影響［3］。本文收集50例診斷為肺腺癌患者的癌性胸水標本，比較角蛋白7（cytokeratin 7，CK7）、上皮特異性抗原（MOC-31）、天冬氨酸蛋白酶A（Napsin-A）及甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子（thyroid transcription factor-1，TTF-1）4種抗體在胸水細胞蠟塊切片與液基涂片上的免疫染色差異，探討這兩種細胞學(xué)技術(shù)對細胞學(xué)樣本ICC結(jié)果的影響，為病理醫(yī)生選擇不同載體的ICC染色提供依據(jù)。

資料與方法

1.材料

回顧性分析江蘇省中醫(yī)院2022年1月至12月診斷為肺腺癌的50例胸水樣本。選擇MOC-31、Napsin-A、CK7及TTF-1 4種抗體，分別在胸水細胞蠟塊切片及液基涂片上行4種抗體的ICC染色。

2.方法

2.1.胸水液基涂片的制作 取50 ml胸水于離心管，1 000 r/min離心5 min，去上清液，吸取細胞沉渣置于新柏氏非婦科液基保存液試劑瓶，靜置15 min后，用Thinpre 2 000液基制片機（美國豪洛捷公司）制作5張液基涂片，立即95%乙醇固定15 min，1張行巴氏染色，其余4張75℃烤片15 min，備ICC染色。

2.2.胸水細胞蠟塊切片的制作 取50 ml胸水于離心管，1 000 r/min離心5 min后去上清液后，加入10 ml 4%中性福爾馬林，固定30 min后再次1 000 r/min離心5 min，加入1%融化后的瓊脂糖，細胞沉渣凝固后放入組織包埋盒，常規(guī)脫水、包埋、3 μm切片、備ICC染色。

3.ICC染色

應(yīng)用EnVision二步法原理，采用全自動免疫組化機（DAK0公司Omnis平臺）進行染色。對細胞蠟塊切片及液基涂片分別行MOC-31、Napsin-A、CK7及TTF-1免疫染色，4種即用型一抗均購自北京中衫金橋公司，同時設(shè)立陰性及陽性對照。MOC-31與CK7陽性信號定位于腫瘤細胞膜，Napsin-A定位于腫瘤細胞漿，TTF-1定位于腫瘤細胞核，免疫染色結(jié)果根據(jù)整張切片及液基涂片中的腫瘤染色強度分為陰性（無染色）、弱陽性（淺黃色）、強陽性（深黃色及棕色），弱陽性與強陽性表達判讀為陽性表達。

4.統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，定性數(shù)據(jù)結(jié)果運用χ2檢驗，不滿足χ2檢驗的數(shù)據(jù)，采用Fisher確切概率法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1.細胞蠟塊切片及免疫染色結(jié)果

細胞蠟塊切片中腺癌細胞呈腺管樣或小簇狀，細胞核重度異型，呈空泡核，核膜增厚，可見核仁，核漿比高（圖1A）。ICC染色細胞蠟塊切片免疫染色結(jié)果，33例TTF-1強陽性表達，10例弱陽性表達（圖1B），7例陰性表達；40例MOC-31強陽性表達，10例弱陽性表達（圖1C）；28例Napsin-A強陽性表達，14例弱陽性表達（圖1D），8例陰性表達；46例CK7強陽性表達，4例弱陽性表達。

圖1 細胞蠟塊切片及液基涂片肺腺癌細胞免疫染色表達的差異。A：細胞蠟塊切片，腫瘤細胞呈單個、小簇狀排列（HE染色 ×200）；B：細胞蠟塊切片，肺腺癌細胞細胞核TTF-1弱陽性表達（ICC染色 ×200）；C：細胞蠟塊切片，肺腺癌細胞細胞膜MOC-31弱陽性表達（ICC染色 ×200）；D：細胞蠟塊切片，肺腺癌細胞細胞漿Napsin-A弱陽性表達（ICC染色 ×200）；E：液基涂片，腫瘤細胞呈三維立體排列，腫瘤細胞細胞漿稀少，具有高核漿比（巴氏染色 ×200）；F：液基涂片，肺腺癌細胞細胞核TTF-1強陽性表達，腫瘤細胞的高核漿比，導(dǎo)致胞漿不明顯（ICC染色 ×200）；G：液基涂片，肺腺癌細胞細胞膜MOC-31強陽性表達，因腫瘤細胞呈三維立體排列，胞膜的染色遮蓋住細胞核（ICC染色 ×200）；H：液基涂片，肺腺癌細胞細胞漿Napsin-A強陽性表達，胞漿的染色遮蓋住細胞核（ICC染色 ×200）

2.液基涂片免疫染色結(jié)果

液基涂片中腺癌細胞呈三維立體狀（圖1E），細胞核重度異型，染色質(zhì)深染，核膜增厚，核漿比高，可見增大的核仁，部分胞漿可見胞漿黏液空泡。44例TTF-1強陽性表達（圖1F），2例弱陽性表達，4例陰性表達；50例MOC-31強陽性表達（圖1G）；40例Napsin-A強陽性表達（圖1H），5例弱陽性表達，5例陰性表達；50例CK7強陽性表達。

3.比較4種抗體在液基涂片及細胞蠟塊切片中陽性表達率和強陽性率

CK7與MOC-31在細胞蠟塊切片與液基涂片上的陽性表達率均為100%，兩者無差異，Napsin-A與TTF-1的陽性表達率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05），見表1。MOC-31、Napsin-A及TTF-1的細胞蠟塊切片與液基涂片強陽性表達率比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），CK7的細胞蠟塊切片與液基涂片強陽性表達率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見表2。

表1 4種抗體在液基涂片及細胞蠟塊切片中陽性表達率比較 [%（例）]

表2 4種抗體在液基涂片及細胞蠟塊強陽性率比較[%（例）]

討論

細胞蠟塊技術(shù)是近年發(fā)展起來的一項新的儲存細胞的技術(shù)［4-5］。其主要原理是將細胞學(xué)樣本離心，富集細胞后經(jīng)4%中性甲醛固定，獲得細胞沉渣后再行脫水、石蠟包埋，制作成細胞蠟塊，制作流程和常規(guī)組織基本一樣。因此，細胞蠟塊切片行免疫細胞染色會出現(xiàn)福爾馬林導(dǎo)致的抗原封閉現(xiàn)象，導(dǎo)致抗原不表達或表達變?nèi)酰?-7］。本研究中選擇的4個抗體，CK7與MOC-31兩個抗體表達于肺腺癌的細胞膜，Napsin-A表達于肺腺癌的細胞漿，TTF-1表達于肺腺癌的細胞核，在細胞蠟塊與液基涂片陽性表達率的比較中，4種定位于不同細胞部位抗體的陽性表達率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義［8-13］。因此，兩種細胞存儲技術(shù)對于漿膜腔積液細胞的抗原保存均具有良好的作用。但是，細胞蠟塊切片與液基涂片的表達強度比較中，MOC-31、Napsin-A及TTF-1 3種抗體在液基涂片上的強陽性表達率比細胞蠟塊切片高，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明液基涂片能提高不同表達部位抗體的ICC染色強度。分析原因如下：細胞蠟塊技術(shù)通過4%的甲醛固定細胞，甲醛導(dǎo)致細胞中的蛋白變性，蛋白發(fā)生交聯(lián)，導(dǎo)致抗原封閉，后期抗原修復(fù)不能完全暴露抗原，導(dǎo)致免疫染色的強度降低，同時細胞蠟塊脫水過程中接觸乙醇、二甲苯等有機試劑進一步引起蛋白的變性，導(dǎo)致抗原活性的改變，從而降低免疫染色的強度。目前，常用的抗原修復(fù)方式是熱修復(fù)與化學(xué)試劑修復(fù)，常用的化學(xué)試劑修復(fù)液有EDTA、檸檬酸、EGTA、Tris、胰酶、胃酶等［14-16］。在使用相同的抗原修復(fù)液的條件下，熱修復(fù)溫度越高，免疫染色強度越強［17］。本研究中運用的全自動免疫組化儀采用的是微波熱修復(fù)抗原，液基涂片的細胞一般呈單層平鋪排列，相比于組織蠟塊的3 μm切片，化學(xué)修復(fù)試劑更易充分接觸細胞，微波熱修復(fù)更易修復(fù)細胞抗原，從而使液基涂片的免疫染色強度更強。CK7在液基涂片與細胞蠟塊切片的表達強度比較中差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能原因為CK7是日常工作中運用時間長且廣泛的一種抗體，提煉純度高、濃度高，研究表明濃度越高免疫染色越強［18］。

液基制片技術(shù)是1996年通過FDA認證的首先運用于宮頸癌篩查的一項技術(shù)，與傳統(tǒng)的普通細胞學(xué)相比，液基保存液具有消化黏液、紅細胞等作用，從而使液基涂片背景干凈，提高診斷的準確性［19-22］。因此，液基涂片也被廣泛運用于非婦科細胞學(xué)的診斷［23-25］。

非婦科細胞學(xué)液基制片技術(shù)是將離心后的細胞沉渣直接轉(zhuǎn)運到液基保存液中，全自動液基制片機完成制片后立即將液基涂片放入95%的乙醇固定，其標準化的制片使液基涂片的細胞量豐富、細胞厚度均勻，避免了傳統(tǒng)手工涂片細胞退變等缺點［24，26］。Dabbs等［27］運用液基涂片行ICC染色發(fā)現(xiàn)其染色強度強于傳統(tǒng)普通涂片。本研究中，在液基涂片行免疫染色之前，為避免細胞掉片，行15 min 75 ℃烤片，使細胞粘附于載玻片上，余免疫染色流程與細胞蠟塊切片完全相同，但是液基涂片的免疫染色結(jié)果更佳。其原因為：⑴液基涂片制作完成后立即采用95%的乙醇固定，避免細胞退變、抗原丟失，同時液基涂片細胞平鋪、分散，避免了細胞蠟塊切片的重疊擁擠，使抗原修復(fù)更充分，免疫染色結(jié)果更優(yōu)。⑵液基保存液是多成分的復(fù)合劑，含有不同濃度的甲醇、冰醋酸、二硫化碳等［28］。研究表明免疫染色的pH值越高，免疫染色強度越強［29］。相比于4%中性甲醛固定的細胞蠟塊樣本，液基保存液中的冰醋酸等酸性試劑導(dǎo)致細胞呈弱酸性，提高免疫染色的強度。⑶液基保存液保存細胞效果優(yōu)良，Sato等［30］研究表明液基保存液可以長達半年常溫保存細胞抗原，因此，液基涂片有利于免疫抗原的表達。⑷液基涂片無甲醛固定，二甲苯、浸蠟等脫水步驟，減少了抗原變性與封閉的機會。

本研究中4種抗體均為即用型抗體，目前即用型抗體主要是針對組織學(xué)樣本而配置。研究表明大部分組織學(xué)樣本與細胞學(xué)樣本免疫染色的抗體濃度相似，但是部分組織學(xué)樣本抗體濃度不適合細胞學(xué)樣本［27］。因此，每個實驗室應(yīng)該根據(jù)實際情況驗證適合于細胞學(xué)樣本的抗體濃度，同時需要根據(jù)不同的制片方法，驗證不同的抗體濃度，使實驗結(jié)果最佳。標準化的非婦科細胞學(xué)標本送檢存在一定困難，細胞蠟塊制作流程復(fù)雜，導(dǎo)致漿膜腔積液制作的細胞蠟塊的細胞抗原存在一定的差異，從而導(dǎo)致細胞蠟塊切片的免疫染色存在一定的差異。因此，標準化的細胞蠟塊制作是減少免疫染色差異的方法。

雖然液基涂片的免疫染色效果優(yōu)于細胞蠟塊切片，但是細胞蠟塊富集更多的細胞，能重復(fù)切片驗證最佳的免疫染色條件，且能長年保存細胞。而液基涂片具有唯一性，不同的液基涂片的細胞可能導(dǎo)致免疫染色出現(xiàn)不同的結(jié)果，且液基保存液一般僅可制作5～8張涂片，明顯少于細胞蠟塊切片，不利于同一種細胞多種抗原的表達研究。因此，對于細胞蠟塊切片和液基涂片的免疫染色應(yīng)根據(jù)實際情況綜合分析而定。若樣本中腫瘤細胞量少，制作細胞蠟塊困難，可以優(yōu)先選擇液基涂片行免疫染色，液基涂片更易觀察到陽性染色結(jié)果；若胞蠟塊切片免疫染色效果欠佳時，可以選擇液基涂片再次重復(fù)免疫染色，更有利于明確診斷；若積液中腫瘤量多，可選擇細胞蠟塊切片染色，雖然細胞蠟塊切片免疫染色的強度可能弱于液基制片，但染色的敏感性與液基涂片無差異，同時可組合多種抗體染色，提高診斷的準確性。

綜上分析，液基涂片與細胞蠟塊切片的免疫染色強度存在差異，但是細胞蠟塊存儲細胞量多，儲存細胞條件簡單，能重復(fù)多次免疫染色，液基涂片染色效果優(yōu)良，但是儲存細胞數(shù)量不確定。因此，液基涂片不能完全取代細胞蠟塊切片，兩者相結(jié)合，效果更好。實驗室應(yīng)根據(jù)自己的條件，驗證適合細胞學(xué)樣本的免疫染色條件，病理醫(yī)生根據(jù)病例的具體情況選擇不同載體的免疫染色，為診斷助力。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聲明蔣麗娟：文章撰寫、醞釀和研究設(shè)計；唐福婷：采集數(shù)據(jù)、對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱；景紅霞：工作支持和指導(dǎo)等