楊瑞明 薛易 江芷珊 曹治云 陳旭征

1福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福州 350122；2福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350122；3福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福州 350122

中藥復(fù)方解毒消癥飲（Jiedu Xiaozheng Yin，JXY）是全國(guó)名中醫(yī)杜建教授的自擬經(jīng)驗(yàn)方，成分包括白花蛇舌草、夏枯草、山慈菇和苦參，臨床上主要用于熱毒熾盛證型的消化道腫瘤患者，具有清熱解毒、消腫散結(jié)等功效。研究發(fā)現(xiàn)，JXY乙酸乙酯提取物（ethyl acetate extract from JXY，EE-JXY）可以通過(guò)Wnt/β-Catenin通路抑制肝癌細(xì)胞的增殖［1］。EE-JXY還被發(fā)現(xiàn)可以降低肝癌側(cè)群（side population，SP）細(xì)胞在肝癌細(xì)胞中的比例，并抑制肝癌細(xì)胞中具有干性特征的相關(guān)因子CD133、c-kit、Oct4、Nanog、Sox2等的表達(dá)［2-3］，可能具有抑制肝癌干細(xì)胞生長(zhǎng)的作用。但是，EE-JXY抑制肝癌干細(xì)胞生長(zhǎng)的作用是否也與Wnt/β-Catenin通路相關(guān)尚未可知。2023年1月至5月，本研究通過(guò)體外培養(yǎng)Huh7和PLC/PRF/5人肝癌細(xì)胞株，觀察EE-JXY對(duì)肝癌細(xì)胞中SP細(xì)胞比例的影響，并對(duì)分選出的SP細(xì)胞進(jìn)行平板克隆實(shí)驗(yàn)和克隆球形成實(shí)驗(yàn)，從Wnt/β-Catenin通路進(jìn)一步闡明EE-JXY抑制肝癌干細(xì)胞生長(zhǎng)的作用機(jī)制，為EE-JXY在臨床肝癌防治中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

1.試劑和儀器

胎牛血清、DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；高糖DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；維拉帕米（Verapamil）、Hoechst33342染料購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；青霉素-鏈霉素混合溶液（100×雙抗）、重組人堿性成纖維生長(zhǎng)因子（bFGF）、重組人表皮生長(zhǎng)因子（EGF）購(gòu)自美國(guó)PeproTech公司；B27購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；β-catenin抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）、Alexa Fluor 555標(biāo)記的驢抗兔二抗、結(jié)晶紫染料購(gòu)自碧云天生物公司。

倒置顯微鏡系統(tǒng)（德國(guó)Leica公司）；二氧化碳培養(yǎng)箱、超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；低速離心機(jī)（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；MOFLO XDP分選型流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman coulter公司）；細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（美國(guó)CountStar公司）；高內(nèi)涵細(xì)胞分析系統(tǒng)Pathway 855（美國(guó)BD Biosciences公司）。

2.細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞株Huh7和PLC/PRF/5細(xì)胞購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)上海中科院細(xì)胞庫(kù)，細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中（含1×105U/L的青鏈霉素），放在條件為37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)及傳代。

3.EE-JXY的制備

白花蛇舌草、山慈菇、夏枯草、苦參從香港培力藥業(yè)有限公司購(gòu)買(mǎi)，按照2∶1∶1∶1的比例混合并粉碎均勻，10倍體積的75%乙醇浸泡30 min，回流提取2遍，每遍1 h，隨即混合提取液，過(guò)濾后采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮。濃縮液經(jīng)石油醚萃取3次，乙酸乙酯萃取3次，歸并乙酸乙酯萃取液，再次采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行減壓濃縮，真空干燥后獲得粉末，即EE-JXY。

4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)SP細(xì)胞比例并分選

將人肝癌細(xì)胞Huh7和PLC/PRF/5接種在6孔板中，0.25 g/L的EE-JXY分別干預(yù)24 h，消化細(xì)胞，制備成濃度為1×109個(gè)/L的單細(xì)胞懸液，再加入Hoechst33342染料，使染料的終濃度為5 mg/L，將水浴鍋升溫至37 ℃，將制備好的細(xì)胞懸液避光振蕩90 min，于4 ℃離心，在預(yù)冷的含2%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基中重懸細(xì)胞，加入終濃度為2 mg/L的PI染液用以排除死亡細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)SP細(xì)胞的比例并分選。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置Verapamil組，即在加入Hoechst33342染料的同時(shí)加入終濃度為50 μmol/L的Verapamil，其余步驟與其他各組相同。

5.平板克隆實(shí)驗(yàn)

將上述實(shí)驗(yàn)分選到的Huh7和PLC/PRF/5肝癌SP細(xì)胞懸液以200個(gè)/孔的細(xì)胞數(shù)接種在6孔板中，并緩慢晃動(dòng)，使細(xì)胞均勻分布，培養(yǎng)2～3周。當(dāng)觀察到6孔板中出現(xiàn)明顯的克隆時(shí)停止培養(yǎng)，棄去上清，用PBS洗滌1次，4%多聚甲醛固定細(xì)胞，并用結(jié)晶紫染色15 min，PBS洗滌后拍照。

6.克隆球形成實(shí)驗(yàn)

將Huh7和PLC/PRF/5肝癌SP細(xì)胞接種在超低黏附6孔板中，按3×108個(gè)/L的密度接種培養(yǎng)過(guò)夜，用EE-JXY干預(yù)24 h，然后消化離心，并按500個(gè)/孔的密度把收集的細(xì)胞再次分別接種于超低黏附6孔板，在干細(xì)胞培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)10 d。期間，每隔3 d添加1 ml干細(xì)胞培養(yǎng)基［含有B-27（1∶50）、bFGF（20 μg/L）、EGF（20 μg/L）的DMEM/F12培養(yǎng)液］，倒置顯微鏡下觀察克隆球的形態(tài)和數(shù)量，并拍照。

7.免疫細(xì)胞熒光染色

將分選后的Huh7肝癌SP細(xì)胞接種在96孔板中24 h，0.25 g/L EE-JXY處理后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞10 min，在含有Triton X-100的阻斷緩沖液中孵育20 min。兔抗β-catenin抗體（1∶250），在4 °C下孵育過(guò)夜。PBS沖洗3次，每次10 min，細(xì)胞在Alexa Fluor 555標(biāo)記的驢抗兔二抗（1∶1 000）避光孵育2 h，再?zèng)_洗3次后，孔中加入300 μg/L的DAPI染色5 min后，使用高內(nèi)涵細(xì)胞分析系統(tǒng)檢測(cè)熒光表達(dá)的位置。

結(jié)果

1.EE-JXY降低Huh7和PLC/PRF/5細(xì)胞中SP細(xì)胞的比例

利用SP細(xì)胞具有將Hoechst33342染料泵出細(xì)胞外的特性，筆者通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)了肝癌細(xì)胞中SP細(xì)胞的比例。結(jié)果如圖1所示，Hoechst33342染料在紫外激發(fā)光的作用下，可發(fā)射450 nm（FL6）的藍(lán)光和675 nm（FL7）的紅光。但是，由于SP細(xì)胞對(duì)Hoechst33342染料拒染，在流式細(xì)胞圖上顯示為左下方有一群Hoechst33342熒光低表達(dá)的細(xì)胞群。當(dāng)肝癌細(xì)胞未受到干預(yù)的時(shí)候，SP細(xì)胞含量在PLC/PRF/5中約占9.92%（圖1a），在Huh7中約占1.10%（圖1d）；當(dāng)加入Verapamil后，這群細(xì)胞數(shù)量有所減少或完全消失（圖1b和1e）。當(dāng)EE-JXY干預(yù)Huh7和PLC/PRF/5細(xì)胞24h后，PLC/PRF/5細(xì)胞中SP細(xì)胞含量從9.92%下降至0.59%，Huh7細(xì)胞中SP細(xì)胞含量從1.10%下降至0.58%，都有很明顯的下降趨勢(shì)（圖1c、圖1f），可見(jiàn)EE-JXY可以顯著降低SP細(xì)胞在肝癌細(xì)胞中的占比。

圖1 EE-JXY對(duì)Huh7和PLC/PRF/5細(xì)胞中SP細(xì)胞含量的影響

2.EE-JXY抑制分選后的Huh7和PLC/PRF/5肝癌SP細(xì)胞的克隆形成

如圖2所示，將上述流式細(xì)胞術(shù)分選出的Huh7和PLC/PRF/5肝癌SP細(xì)胞接種在6孔板中進(jìn)行平板克隆實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未受干預(yù)的SP細(xì)胞正常培養(yǎng)2～3周后均出現(xiàn)散在的克隆，大小不一，而經(jīng)0.25 g/L的EE-JXY干預(yù)后分選出的SP細(xì)胞形成克隆的數(shù)量明顯減少，說(shuō)明給藥后SP細(xì)胞的增殖能力明顯下降，難以形成克隆。

圖2 EE-JXY抑制肝癌SP細(xì)胞的克隆形成

3.EE-JXY對(duì)分選后肝癌SP細(xì)胞體外成球能力的影響

如圖3所示，在倒置顯微鏡下觀察克隆球數(shù)目，可見(jiàn)分選后的未受干預(yù)的Huh7和PLC/PRF/5肝癌SP細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，成球狀況良好，而EE-JXY干預(yù)后克隆球數(shù)目較空白組明顯減少，說(shuō)明EE-JXY減弱了肝癌SP細(xì)胞體外成球的能力，抑制了肝癌SP細(xì)胞的增殖。

圖3 EE-JXY抑制肝癌SP細(xì)胞克隆球的形成（200×）

4.EE-JXY對(duì)肝癌SP細(xì)胞Wnt/β-catenin通路中β-catenin蛋白轉(zhuǎn)位的影響

如圖4所示，在未處理的SP細(xì)胞中，β-catenin主要聚集在細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中。經(jīng)EE-JXY處理后，β-catenin出現(xiàn)在部分細(xì)胞的細(xì)胞膜中。顯然，EE-JXY可以促進(jìn)β-catenin從細(xì)胞漿向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)位，這說(shuō)明EE-JXY可以抑制β-catenin的活性。

圖4 EE-JXY對(duì)肝癌SP細(xì)胞β-catenin蛋白轉(zhuǎn)位的影響（400×）

討論

肝細(xì)胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球常見(jiàn)的惡性腫瘤。目前，其治療方法主要有手術(shù)切除、放化療、靶向藥物治療等，但是由于肝癌細(xì)胞易轉(zhuǎn)移、對(duì)放化療和靶向藥物不敏感，以及這些藥物嚴(yán)重的不良反應(yīng)等特點(diǎn)導(dǎo)致患者生存率沒(méi)有顯著提高。許多中藥復(fù)方在輔助腫瘤治療中發(fā)揮著良好的增效減毒作用，如在抑制肝癌細(xì)胞增殖、抑制肝癌細(xì)胞侵襲、誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡等方面均被發(fā)現(xiàn)有很好的功效［4］。有關(guān)中藥復(fù)方抑制肝癌生長(zhǎng)的作用機(jī)制，目前大多數(shù)研究以肝癌細(xì)胞為主要研究對(duì)象，較少關(guān)注肝癌組織中的癌干細(xì)胞（cancer stem cells，CSCs），而CSCs正是癌癥轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵［5-6］。這群細(xì)胞因具有不斷自我更新、無(wú)限增殖等干細(xì)胞樣特性，具有一定的化療抵抗能力，導(dǎo)致肝癌易復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移［7］。目前，人們?cè)谘芯扛伟〤SCs的過(guò)程中還沒(méi)有發(fā)現(xiàn)一種靈敏度和特異度均較高的標(biāo)志物。因此，對(duì)于了解肝癌CSCs有哪些特點(diǎn)、抗癌靶點(diǎn)的篩選以及肝癌CSCs的功能進(jìn)行研究成了疑難問(wèn)題［8］。近年來(lái)，學(xué)者們研究癌癥時(shí)發(fā)現(xiàn)一些細(xì)胞群可以將Hoechst33342熒光染料從細(xì)胞核排出細(xì)胞外，流式細(xì)胞術(shù)和熒光顯微鏡檢測(cè)均未觀察到染色或弱染色，學(xué)者稱其為SP細(xì)胞。SP細(xì)胞具有自我更新、多向分化、耐藥性及高致瘤性，這些特征與CSCs特征非常相似，SP細(xì)胞逐漸成為CSCs研究的切入點(diǎn)［9-10］。

CSCs發(fā)揮其干細(xì)胞樣特性與幾條信號(hào)通路如Wnt/β-catenin、Hippo-YAP/TAZ、JAK/STAT、Notch等關(guān)系密切，其中Wnt/β-catenin信號(hào)通路是研究最為明確的一條［11-13］。當(dāng)該通路沒(méi)有被Wnt配體激活時(shí)，β-catenin匯聚在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，不能向核內(nèi)易位，β-catenin會(huì)被糖原合成酶激酶3β（GSK3β）、酪蛋白激酶1（CK1）磷酸化，從而引起有關(guān)的蛋白酶體降解；當(dāng)Wnt配體存在時(shí)，與細(xì)胞膜上的卷曲同源物和肺耐藥蛋白5/6（LRP5/6）結(jié)合并且受體共表達(dá)，激活該通路，細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的β-catenin不會(huì)被GSK3β磷酸化，β-catenin轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路下游的相關(guān)靶基因，然后發(fā)揮一系列的作用［14-15］。Wnt/β-catenin信號(hào)通路在CSCs中發(fā)揮著重要功能，促進(jìn)CSCs耐藥和轉(zhuǎn)移，維持CSCs的增殖生長(zhǎng)、自我更新和干細(xì)胞表型［16-18］。研究發(fā)現(xiàn)，EE-JXY可以明顯改善Huh7細(xì)胞對(duì)小劑量化療藥的抵抗，也可以抑制Hep3B細(xì)胞的干細(xì)胞樣特性，EE-JXY通過(guò)wnt/β-catenin通路抑制肝癌細(xì)胞增殖［2］。本研究首先對(duì)分選出來(lái)的Huh7和PLC/PRF/5細(xì)胞的SP細(xì)胞的百分含量進(jìn)行測(cè)定，可以看出，在正常的Huh7和PLC/PRF/5細(xì)胞中SP細(xì)胞是有一定存在比例的，加入Verapamil后PLC/PRF/5和Huh7細(xì)胞中SP細(xì)胞的比例下降，這是因?yàn)镾P細(xì)胞高表達(dá)ATP結(jié)合蛋白G2（ABCG2），這種蛋白可以將有毒的藥物排出細(xì)胞外，逃避化療藥物的損害，而Verapamil會(huì)特異性阻斷ABCG2，使其不能發(fā)揮功能，干細(xì)胞就會(huì)被殺傷，SP細(xì)胞含量顯著降低。本研究發(fā)現(xiàn)，EE-JXY能顯著降低肝細(xì)胞株中SP細(xì)胞的比例，與Verapamil有相同的作用，這說(shuō)明EE-JXY對(duì)肝癌CSCs的抑制能力比對(duì)肝癌細(xì)胞更加敏感。緊接著本研究分選出這兩種細(xì)胞的SP細(xì)胞進(jìn)行平板克隆實(shí)驗(yàn)和克隆球?qū)嶒?yàn)，發(fā)現(xiàn)EE-JXY組SP細(xì)胞平板克隆能力和克隆成球能力均明顯下降，進(jìn)一步說(shuō)明JXY可以抑制SP細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。鑒于前期發(fā)現(xiàn)EE-JXY可以通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，本研究還考察了EE-JXY對(duì)肝癌SP細(xì)胞β-catenin的表達(dá)是否有抑制作用［19-20］，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常情況下β-catenin多表達(dá)在細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi)，加了EE-JXY后部分細(xì)胞的β-catenin轉(zhuǎn)位到了細(xì)胞膜上，說(shuō)明EE-JXY抑制了β-catenin的活化。

綜上所述，EE-JXY可能通過(guò)影響Wnt/β-catenin信號(hào)通路，抑制β-catenin的活化，進(jìn)而影響SP細(xì)胞的增殖，這可能是EE-JXY抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)的機(jī)制之一。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明楊瑞明、薛易、江芷珊：實(shí)施研究，采集數(shù)據(jù)，起草文章，統(tǒng)計(jì)分析；曹治云：醞釀和設(shè)計(jì)試驗(yàn)，對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性閱讀，支持性貢獻(xiàn)；陳旭征：醞釀和設(shè)計(jì)試驗(yàn)，對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性閱讀，統(tǒng)計(jì)分析，獲取研究經(jīng)費(fèi)，指導(dǎo)，支持性貢獻(xiàn)