陳怡穎,楊 涵,龍丹丹,陳怡蓉,蘇 洪,戴歡歡,張亞勤△

(普洱市人民醫(yī)院:1.眼科;2.生殖遺傳中心;3.感染管理科,云南 普洱 665000)

維生素D與人體內(nèi)的維生素D受體(VDR)結(jié)合,發(fā)揮重要的生物學(xué)功能,如調(diào)節(jié)骨代謝[1]、促進(jìn)生長分化[2]等,VDR基因多態(tài)性與兒童生長發(fā)育[3]及腫瘤[4]、骨質(zhì)疏松[5-7]、糖尿病[8-9]等各種疾病的關(guān)系,一直是研究者關(guān)注的熱點。根據(jù)既往研究結(jié)果,VDR基因多態(tài)性在不同的民族、種族、地區(qū)間有不同的分布頻率。

了解VDR基因多態(tài)性的遺傳分布特點,有助于進(jìn)一步為各地區(qū)臨床及科研提供更精準(zhǔn)的依據(jù)。本研究分析了普洱地區(qū)漢族和佤族的VDR基因多態(tài)性分布特點,為后續(xù)相關(guān)疾病的調(diào)查及分析提供遺傳數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 分別收集普洱地區(qū)佤族和漢族健康人的口腔黏膜上皮細(xì)胞,將其分為佤族組及漢族組,進(jìn)行VDR基因多態(tài)性分析。本研究經(jīng)本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.1佤族組 來自本院生殖遺傳中心體檢的佤族人群及普洱市西盟佤族自治縣的佤族人群,根據(jù)知情同意原則,共收集了99名佤族健康人的口腔黏膜細(xì)胞,年齡分布為3～65歲。

1.1.2漢族組 來自本院生殖遺傳中心體檢的漢族人群,根據(jù)知情同意原則,共收集了100名漢族健康人的口腔黏膜細(xì)胞,年齡分布為1～68歲。

1.2儀器與試劑 通用基因組DNA提取試劑盒(日本TaKaRa公司,貨號:9765);聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)預(yù)混試劑(日本TaKaRa公司,貨號:R004A);ABI veriti基因擴(kuò)增儀(美國Thermo公司); 臺式高速離心機(jī)(德國Eppendorf公司);水平電泳儀(北京六一生物科技有限公司)。

1.3方法 采用柱提法提取口腔黏膜細(xì)胞樣本的基因組DNA。采用PCR技術(shù)對其進(jìn)行擴(kuò)增后,將產(chǎn)物送北京擎科生物科技有限公司昆明分公司,采用Sange測序技術(shù),檢測VDR ApaⅠ、TaqⅠ、FokⅠ位點的基因多態(tài)性。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 經(jīng)擬合優(yōu)度χ2檢驗,佤族和漢族組VDR ApaⅠ、TaqⅠ、FokⅠ位點的基因多態(tài)性分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律,P>0.05提示數(shù)據(jù)來自同一孟德爾群體,樣本具有群體代表性。經(jīng)SPSS22.0 軟件分析基因型和等位基因頻率,采用χ2檢驗,P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。應(yīng)用Arlequin3.5軟件,對2組數(shù)據(jù)各基因型進(jìn)行連鎖不平衡分析。

2 結(jié) 果

2.1Hardy-Weinberg平衡分析與連鎖不平衡分析 入組對象的VDR ApaⅠ、TaqⅠ、FokⅠ位點的基因多態(tài)性分布符合遺傳平衡定律(P>0.05),見表1、2,提示漢族組、佤族組均來自同一孟德爾群體,樣本具有群體代表性。應(yīng)用Arlequin3.5軟件分別對2組數(shù)據(jù)各基因型進(jìn)行連鎖不平衡分析,發(fā)現(xiàn)佤族和漢族組VDR ApaⅠ、TaqⅠ、FokⅠ位點各基因型之間不存在較強(qiáng)的連鎖不平衡關(guān)系。

表1 佤族組VDR各位點基因型Hardy-Weinberg 平衡分析

表2 漢族組VDR各位點基因型Hardy-Weinberg 平衡分析

2.2基因型和等位基因頻率分布情況

2.2.1佤族組研究對象的基因型頻率 VDR ApaⅠCC基因型53例(53.5%),CA基因型39例(39.4%),AA基因型7例(7.1%);VDR FokⅠTT基因型28例(28.3%),TC基因型49例(49.5%),CC基因型22例(22.2%);VDR TaqⅠTT基因型94例(96.0%),TC基因型5例(4.0%),CC基因型0例。

佤族組研究對象的等位基因頻率:VDR ApaⅠC等位基因145例(73.2%),A等位基因53例(26.8%); VDR FokⅠT等位基因105例(53.0%),C等位基因93例(47.0%);VDR TaqⅠT等位基因194例(98.0%),C等位基因4例(2.0%)。

2.2.2漢族組研究對象的基因型頻率 VDR ApaⅠCC基因型55例(55.0%),CA基因型38例(38.0%),AA基因型7例(7.0%);VDR FokⅠTT基因型28例(28.0%),TC基因型47例(47.0%),CC基因型25例(25.0%);VDR TaqⅠTT基因型91例(91.0%),TC基因型8例(8.0%),CC基因型1例(1.0%)。

漢族組研究對象的等位基因頻率:VDR ApaⅠC等位基因148例(74.0%),A等位基因52例(26.0%);VDR FokⅠT等位基因103例(51.5%),C等位基因97例(48.5%);VDR TaqⅠT等位基因190例(95.0%),C等位基因10例(5.0%)。

2.2.3漢族組與佤族組基因型頻率、等位基因頻率比較 普洱地區(qū)的漢族人群與佤族人群VDR基因多態(tài)性位點ApaⅠ、FokⅠ、TaqⅠ的基因型頻率、等位基因頻率比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表3。

表3 佤族組與漢族組基因型與等位基因分布[n(%)]

2.2.4佤族組VDR FokⅠ基因型頻率與其他民族比較 選取各少數(shù)民族研究結(jié)果較多的VDR FokⅠ位點,將本研究的佤族統(tǒng)計結(jié)果與其他研究組的統(tǒng)計結(jié)果進(jìn)行比較分析,發(fā)現(xiàn)普洱地區(qū)佤族與大理地區(qū)漢族、阿昌族、僾尼族、蒙古族的基因型頻率之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表4。本研究還發(fā)現(xiàn),普洱地區(qū)漢族與大理地區(qū)漢族之間,VDR FokⅠ基因型頻率比較,差異也有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表5。

表4 佤族與其他民族VDR FokⅠ基因型分布比較[n(%)]

表5 普洱地區(qū)漢族與云南其他地區(qū)漢族VDR FokⅠ基因型頻率比較[n(%)]

3 討 論

由于維生素D在人體中發(fā)揮多種生物學(xué)功能,其與各種疾病的發(fā)病機(jī)制也存在重要的關(guān)系,所以VDR基因多態(tài)性一直是學(xué)者研究的熱點。近期譚璐等[13]研究發(fā)現(xiàn),VDR基因多態(tài)性位點與難治性腎病的發(fā)生密切相關(guān)。韋琴等[14]發(fā)現(xiàn),VDR基因多態(tài)性與代謝綜合征的遺傳易感性也關(guān)系密切。另外有研究發(fā)現(xiàn),?？诘貐^(qū)兒童VDR基因多態(tài)性與骨密度異常的發(fā)生密切相關(guān)[15],而寧夏地區(qū)老年女性原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥患者與VDR基因多態(tài)性也具有相關(guān)性[16]。還有研究發(fā)現(xiàn),新疆地區(qū)漢族、維吾爾族及哈薩克族孕婦發(fā)生子癇前期可能與VDR FokⅠ位點基因型相關(guān)[17],而李健等[18]也研究發(fā)現(xiàn)FokⅠ位點多態(tài)性與潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)生風(fēng)險相關(guān)。

作者查閱文獻(xiàn),綜合近年來的VDR基因多態(tài)性研究結(jié)論發(fā)現(xiàn),其不僅與各種疾病的發(fā)生關(guān)系密切,而且在不同地區(qū)、不同民族間也存在著各種差異。另外,少數(shù)民族與漢族的VDR基因多態(tài)性也經(jīng)常具有顯著的差異,如根據(jù)阿麗婭等[19]的研究結(jié)果,中國維吾爾族(烏魯木齊地區(qū))人群VDR基因多態(tài)性的分布頻率,與北京地區(qū)漢族人群比較有顯著差異(P<0.05)。陳瑞英等[20]研究發(fā)現(xiàn),哈薩克族與漢族人群之間VDR基因型頻率分布比較,差異有顯著性意義。全京花等[21]報道,延邊地區(qū)朝鮮族兒童VDR基因FokⅠ多態(tài)性分布頻率與云南地區(qū)阿昌族、甘肅地區(qū)東鄉(xiāng)族差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。邢少姬等[22]分析506名內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族人群的VDR FokⅠ的基因型和等位基因的分布頻率,發(fā)現(xiàn)內(nèi)蒙古地區(qū)蒙古族人群與云南地區(qū)漢族、阿昌族人群的VDR多態(tài)性分布頻率比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

云南普洱地區(qū)處于我國的西南邊疆,少數(shù)民族眾多,遺傳資源豐富。研究本地區(qū)不同少數(shù)民族VDR基因多態(tài)性,將有助于更好地掌握本地區(qū)遺傳資源,為臨床研究提供更精準(zhǔn)的基因數(shù)據(jù)。

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的VDR基因多態(tài)性有20多種,其中ApaⅠ、Taq Ⅰ、FokⅠ是研究報道相對較多的位點。本研究首先聚焦于云南地區(qū)的佤族群體,為了便于將研究結(jié)果與其他地區(qū)或民族進(jìn)行比對,本研究選取了已有較多研究報道的ApaⅠ、FokⅠ、TaqⅠ位點,通過測序后比對分析,發(fā)現(xiàn)普洱地區(qū)的漢族與佤族人群在ApaⅠ、FokⅠ、TaqⅠ之間沒有明顯的差異性。但是,云南不同地區(qū)的漢族人群VDR基因多態(tài)性可能存在差異。根據(jù)研究結(jié)果顯示,普洱地區(qū)漢族與昆明地區(qū)漢族人群FokⅠ位點的基因頻率差異不顯著,但普洱地區(qū)漢族與大理地區(qū)漢族人群FokⅠ位點的基因頻率差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。這可能與各地漢族生活環(huán)境、生活方式、遺傳等多種因素有關(guān)。由于云南各民族人群長期聚居生活,同一個地區(qū)的民族可能通過長期的雜居通婚、進(jìn)化等逐漸發(fā)生了地區(qū)間基因型的重新整合,從而發(fā)生了基因頻率的差異化。這可能就導(dǎo)致了同一個民族在不同地區(qū)的基因型之間存在差異。

本研究首次獲得了普洱地區(qū)佤族VDR基因多態(tài)性位點ApaⅠ、FokⅠ、TaqⅠ的分布頻率,豐富了不同民族在基因水平上的遺傳信息。另外,根據(jù)本研究結(jié)果,普洱地區(qū)佤族與大理地區(qū)阿昌族、僾尼族、蒙古族人群FokⅠ位點的基因頻率具有明顯差異,但與大理地區(qū)白族、基諾族、傣族人群差異不明顯。

眾多研究表明,VDR基因多態(tài)性存在種族和地域差異,表現(xiàn)出遺傳特異性。這提示各少數(shù)民族之間的基因多態(tài)性具有多樣性,在疾病防治、藥物代謝、生長發(fā)育等醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域,要充分考慮并重視基因多態(tài)性所造成的遺傳差異,以達(dá)到精準(zhǔn)防治的目的。