王興龍，劉少穎，諸寅，倪曉峰，蔡強(qiáng)*

（1.浙江清華長三角研究院，浙江嘉興 314000；2.杭州市疾病預(yù)防控制中心，浙江杭州 310000）

黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFTB1）主要是由黃曲霉菌（Aspergillus flavus）和寄生曲霉菌（A. parasiticus）等多種真菌產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物，是二氫呋喃氧雜萘鄰?fù)难苌?，含有一個(gè)雙呋喃環(huán)和一個(gè)氧雜萘鄰?fù)ㄏ愣顾兀?。從國?nèi)外部分地區(qū)AFTB1污染狀況及膳食暴露風(fēng)險(xiǎn)評估中發(fā)現(xiàn)，雖然總體污染水平不高[1-3]，但是黃曲霉毒素有顯著的慢性毒性，攝入大劑量AFTB1后會對氧化、遺傳、肝臟系統(tǒng)造成一定程度的損傷[4-5]。目前不同國家和地區(qū)對黃曲霉毒素檢測種類和限值要求均不同，例如我國《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素含量》（GB 2761—2017）中對AFTB1有限量要求，歐盟除規(guī)定了AFTB1的限量外，還規(guī)定了4 種黃曲霉毒素總和的限量要求。真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，無論從品種上還是從數(shù)量上都無法滿足國際互認(rèn)和量值比對的溯源需要，因此有必要開展系統(tǒng)的AFTB1標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制工作，對于保證食品中AFTB1監(jiān)測檢測及風(fēng)險(xiǎn)評估數(shù)據(jù)一致性評價(jià)具有重要意義。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量值的溯源性、準(zhǔn)確度、精密度等技術(shù)指標(biāo)，本研究采用高效液相色譜串聯(lián)高分辨質(zhì)譜法、紫外-可見光譜法對AFTB1進(jìn)行表征與鑒定。通過使用滿足計(jì)量學(xué)特性要求的測量方法和計(jì)量器具，采用了8家實(shí)驗(yàn)室聯(lián)合定值，同時(shí)考察了其均勻性、穩(wěn)定性，并系統(tǒng)地評估了在研制過程引入的不確定度。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

1260 高效液相色譜儀，美國Agilent 公司；QE高分辨液質(zhì)聯(lián)用儀，美國Thermo Scientific 公司；Lambda 35 紫外-可見分光光度計(jì)，美國PerkinElmer公司；XSE105DU 電子天平，美國Mettler Toledo 公司；Milli-Q 超純水儀，美國Millipore 公司。

黃曲霉毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液（GBW 10174），中國計(jì)量科學(xué)研究院；黃曲霉毒素B1固體粉末（純度99%以上），以色列Fermentek 公司；乙腈，色譜純，德國默克公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)候選物選擇

為了進(jìn)一步確認(rèn)原料（黃曲霉毒素B1固體粉末）的準(zhǔn)確可靠，分別采用高分辨質(zhì)譜法、紫外分光光度法對購買的原料進(jìn)行了主成分定性分析。將經(jīng)過主成分定性分析的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)原料，采用重量-容量法配制標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液[6]。黃曲霉毒素B1在乙腈中相對穩(wěn)定[7]，因此選擇適量乙腈，將9.97 mg AFTB1固體充分溶解，將冷卻后的溶液沿玻璃棒小心轉(zhuǎn)入2 000 mL 的容量瓶中，定容至刻度。分裝至5 mL 潔凈干燥器的棕色安瓿瓶中，每個(gè)包裝量為4 mL，將安瓿瓶快速熔封，共分裝474 個(gè)包裝單元，置于-18 ℃冰箱內(nèi)保存。AFTB1原料充足，滿足復(fù)制的要求。

1.2.2 定性分析

（1）高效液相色譜條件

色譜柱：Thermo Hypersil GOLD（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流動相：A 為超純水，B 為乙腈-甲醇溶液（體積比1 ∶1）；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：2 μL；等度洗脫。

（2）高分辨質(zhì)譜條件

NCE：30/50/70；模式：Full MS/ddMS2，F(xiàn)ull MS分辨率為70 000，dd MS2分辨率為17 500；離子源模式為ESI+。

（3）紫外-可見光譜分析

采用紫外-可見光譜分析法測定配制好的AFTB1溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，波長掃描范圍為200 ～450 nm，分析化合物紫外可見光吸收光譜。

1.2.3 高效液相色譜-紫外檢測法定量分析

色譜柱：XTerra RP18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-甲醇溶液（50+50）；柱溫35 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL；紫外檢測器：檢測波長為359 nm；標(biāo)準(zhǔn)溶液及待測溶液直接進(jìn)樣，外標(biāo)法單點(diǎn)定值。梯度洗脫0 ～1 min，B 相30%；1 ～7 min，B 相變化至90%；7 ～9 min，B 相保持100%；9 ～13 min，B 相保持30%。

1.2.4均勻性檢驗(yàn)

根據(jù)《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值及均勻性、穩(wěn)定性評估》（JJF 1343—2022）[8]，對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行均勻性研究。采用簡單隨機(jī)抽取方式，抽取15 瓶樣品，按照1.2.3 確定的分析方法，每一瓶抽取3 份子樣進(jìn)行測定，最小取樣量為10 μL。采用單因素方差分析法（F檢驗(yàn)法）對檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[9]，判斷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性。

1.2.5穩(wěn)定性考察

穩(wěn)定性是所有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的關(guān)鍵特征之一，通常評估樣品短期穩(wěn)定性和長期穩(wěn)定性。短期穩(wěn)定性評估采用同步穩(wěn)定性評估方法，將制備好的溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)統(tǒng)一保存在60 ℃條件下，分別在第0 天、第1 天、第3 天、第5 天、第7 天取2 份樣品于-18 ℃下保存，所有取出的樣品平行測定2 次。長期穩(wěn)定性評估，在-18 ℃條件下，分別于第0 個(gè)月、第1 個(gè)月、第3 個(gè)月、第6 個(gè)月每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取2 個(gè)樣品，每個(gè)樣品平行測定3 次。以監(jiān)測時(shí)間和監(jiān)測結(jié)果擬合直線，采用趨勢分析法對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析[10]。

1.2.6標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值

本溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)采用8 家實(shí)驗(yàn)室間聯(lián)合定值。為確保定值過程中的可溯源性與質(zhì)量控制，在定值過程中將標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液直接與一級有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液GBW 10174 比對，單點(diǎn)外標(biāo)法定值。向每家定值單位發(fā)放2 個(gè)包裝的AFTB1溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（包裝1、包裝2），每個(gè)包裝平行測定6 次，提供12 個(gè)測定結(jié)果。數(shù)據(jù)經(jīng)過正態(tài)分布檢驗(yàn)、組內(nèi)可疑值檢驗(yàn)、組間數(shù)據(jù)精度檢驗(yàn)后，將有效數(shù)據(jù)匯總，計(jì)算總平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 高分辨質(zhì)譜定性分析

將AFTB1溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用20%乙腈水溶液逐級稀釋至100 ng/mL，按照1.2.2 項(xiàng)方法進(jìn)行測試，測定結(jié)果見圖1。得出的AFTB1質(zhì)荷比為313.069 64，AFTB1理論質(zhì)荷比為313.070 66[11]。按照高分辨質(zhì)譜的判定原則，兩者基本符合。AFTB1主要碎片離子285.1、241.0，與國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.22—2016[12]相一致。由此可以判定，溶液中的主成分為AFTB1。

圖1 黃曲霉毒素B1 的高分辨質(zhì)譜圖

2.2 紫外光譜分析定性研究

AFTB1化合物在乙腈中的紫外-可見光譜如圖2所示，在223 nm，264 nm 和359 nm 波段左右處，存在最大吸收，與RODRICKS[13]報(bào)道的AFTB1在甲醇中的最大吸收波段（223 nm、265 nm 和361 nm）基本一致，初步鑒定化合物為AFTB1。

圖2 乙腈中黃曲霉毒素B1 的紫外光譜

2.3 均勻性檢驗(yàn)及最小取樣量的確定

對隨機(jī)抽取的15 個(gè)樣本中黃曲霉毒素B1實(shí)測數(shù)據(jù)采用F檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，通過組間方差和組內(nèi)方差的比較判斷各組測量值之間有無系統(tǒng)誤差。查表得F（0.05,14,30）=2.037，乙腈溶液中黃曲霉毒素B1成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性數(shù)據(jù)的F計(jì)算值為1.145，小于F（0.05,14,30）=2.037，說明在95%的置信區(qū)間內(nèi)，乙腈中黃曲霉毒素B1分布均勻，同時(shí)確定最小取樣量為10 μL。

2.4 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

短期穩(wěn)定性是評估運(yùn)輸過程對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)量值的影響。在95%置信水平下進(jìn)行短期穩(wěn)定性評估，發(fā)現(xiàn)乙腈中黃曲霉毒素B1測定值隨時(shí)間變化的擬合直線斜率為|β1|=0.000 244，斜率標(biāo)準(zhǔn)偏差S(β1)=0.001 141，t0.95,3=3.18，|β1|＜t0.095,3·S(β1)。說明60 ℃條件下，乙腈中黃曲霉毒素在7 d 內(nèi)是穩(wěn)定的。

長期穩(wěn)定性數(shù)據(jù)以平均值歸一化后，其結(jié)果見圖3。虛線內(nèi)的兩條黑實(shí)線代表乙腈中黃曲霉毒素B1隨時(shí)間變化的不確定度。在95%置信水平下，乙腈中黃曲霉毒素B1測定值隨月份變化的擬合直線斜率為|β1|=0.000 714 286，斜率標(biāo)準(zhǔn)偏差S(β1)=0.001 649 572，t0.95,3=4.30，|β1|＜t0.095,3·S(β1)。乙腈中黃曲霉毒素B1溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在-18 ℃條件下儲存至少6個(gè)月內(nèi)穩(wěn)定?；谮厔莘治?，可將貨架期延長至24 個(gè)月，以此來評估長期穩(wěn)定性引入的不確定度[14]。

圖3 乙腈中黃曲霉毒素B1 長期穩(wěn)定性歸一化結(jié)果

2.5 聯(lián)合定值的結(jié)果

本次定值共有8 家單位（A、B、C、D、E、F、G、H）參與，均參考1.2.3 確定的方法進(jìn)行測定，詳見表1。根據(jù)達(dá)戈斯提諾（D’Agostioon）法檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的正態(tài)性。統(tǒng)計(jì)量Y=1.49，位于-3.61 ～1.59（p=0.99），故接受所有數(shù)據(jù)為正態(tài)分布；經(jīng)格拉布斯（Grubbs）法檢驗(yàn)，所有參與定值實(shí)驗(yàn)室的每組數(shù)據(jù)中|v1|均＜λ（0.05,12）·s，無可疑值需要剔除；經(jīng)科克倫（Cochran）法檢驗(yàn)，科克倫檢驗(yàn)結(jié)果C 為0.160，小于C（0.05,8,12）=0.275，說明各組間數(shù)據(jù)等精密度。

表1 聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室定值結(jié)果

因此，乙腈溶液中黃曲霉毒素B1定值結(jié)果為8家實(shí)驗(yàn)室測定結(jié)果的總平均值，即4.99 μg/mL。

2.6 不確定度評定

根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)及技術(shù)規(guī)范[8]，確定了影響乙腈中黃曲霉素毒素B1測定結(jié)果的各個(gè)不確定度分量，主要包括：標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性引起的不確定度u(bb)；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性引起的不確定度；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值過程帶來的A 類不確定度和B 類不確定度。

2.6.1 均勻性引入的不確定度

根據(jù)均勻性測定結(jié)果，由均勻性引入的不確定度可按式（1）表示[6]。

式中：S2為組內(nèi)方差；n為組內(nèi)測量次數(shù)，n=3；vs為組內(nèi)自由度，Vs=30。

均勻性檢驗(yàn)過程中，15 個(gè)樣本，3 平行，45 個(gè)數(shù)據(jù)的均值為5.04。則由均勻性檢驗(yàn)引入的相對不確定度為

2.6.2 穩(wěn)定性引入的不確定度

由穩(wěn)定性引入的不確定度可按式（2）表示[15]。

式中：s(β1)為回歸分析斜率的標(biāo)準(zhǔn)偏差；X為穩(wěn)定性評估的時(shí)間。

短期穩(wěn)定性考察時(shí)，14 個(gè)樣本的平均值為4.997 μg/mL；長期穩(wěn)定性考察時(shí)，12 個(gè)樣本的平均值為5.003 μg/mL。則由短期穩(wěn)定性引入的相對不確定度為

由長期穩(wěn)定性引入的相對不確定度為

2.6.3 定值過程引入的不確定度

定值過程引入的A 類不確定度按式（3）計(jì)算[16]。

式中：s為各實(shí)驗(yàn)室定值結(jié)果平均值的標(biāo)準(zhǔn)偏差；n為實(shí)驗(yàn)室個(gè)數(shù)。

則由定值過程引入的A 類相對不確定度為

定值過程引入的B 類不確定度由標(biāo)準(zhǔn)溶液不確定引入，根據(jù)GWB 10174 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)證書規(guī)定，標(biāo)準(zhǔn)溶液的相對擴(kuò)展不確定為2%（k=2），則由定值過程引入的B 類相對不確定度為uBrel=2%/2=1%。

2.7 不確定度的合成

通過以上分析，將各分量合成總相對不確定度：

當(dāng)k=2 時(shí)，相對擴(kuò)展不確定度Urel=k×urel=2×1.302%=2.604%，則擴(kuò)展不確定度。

因此，乙腈溶液中黃曲霉毒素B1成分分析標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)特性值表示為（4.99±0.13）μg/mL（k=2）。

3 結(jié)論

本文制備的黃曲霉毒素溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，經(jīng)均勻性、穩(wěn)定性考察，結(jié)果無顯著性變化。對黃曲霉毒素B1的量值進(jìn)行不確定度評定，發(fā)現(xiàn)影響不確定度的主要因素為均勻性、穩(wěn)定性及定值過程相關(guān)的A 類不確定度與B 類不確定度。該溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溯源至國家一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)GBW 10174，符合相關(guān)國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)技術(shù)規(guī)范要求，特性值表示為（4.99±0.13）μg/mL。該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制，為實(shí)現(xiàn)量值可比性提供了物質(zhì)保障與技術(shù)支撐。