李霞

（齊魯醫(yī)藥學(xué)院，山東淄博 255300）

蒲公英屬菊科，有清熱解毒、利尿通淋、健胃消炎和保肝利膽的功效。蒲公英藥效成分復(fù)雜，主要包括多糖類、黃酮類、甾醇類等。蒲公英中所含的多糖藥理作用廣泛，可以提高機體免疫力、降低血糖、抑菌、抗癌，也可以通過抗氧化作用起到保護肝臟的效果[1]。

酶提取法可以提高提取率并維持多糖的活性，受到廣泛關(guān)注。纖維素酶可以水解植物的細胞壁，讓提取溶劑快速進入組織細胞中，因而提高了多糖的提取率，縮短了多糖的提取時間；木瓜蛋白酶可以水解糖蛋白和多糖中的游離蛋白，有利于植物多糖的提取。如徐瀾等[2]采用木瓜蛋白酶對蒲公英進行酶解，多糖得率為3.11%；WANG 等[3]利用纖維素酶提取蒲公英多糖，多糖得率達到了20.67%。復(fù)合酶提取法能夠更有效地提高多糖提取率，如劉珊珊等[4]以蒲公英根烘焙粉為樣品，探究了單酶和雙酶協(xié)同條件下多糖得率，結(jié)果表明雙酶法多糖提取率為32.97%±0.13%，優(yōu)于單酶法。

目前測定植物多糖常用苯酚-硫酸法，該法方便、靈敏、穩(wěn)定，適用于單糖、低聚糖和多糖的含量測定[5]?；诖耍疚囊远嗵强偺崛÷蕿榭疾熘笜?biāo)，通過單因素實驗和正交試驗設(shè)計優(yōu)選超聲輔助復(fù)合酶法的最佳提取工藝。

1 材料與方法

1.1 儀器

UV-2550 分光光度計，日本島津株式會社；FA2204B 電子天平，上海精科天美科學(xué)儀器有限公司；XL-20B 密封型搖擺式粉碎機，廣州市旭朗機械設(shè)備有限公司；KQ-800KDE 高功率數(shù)控超聲波清洗器、SHBIII 循環(huán)水式多用真空泵，上海申生科技有限公司。

1.2 試劑

蒲公英根粉末樣品，產(chǎn)自云南，將蒲公英根干燥、去雜、粉碎、過篩后制得。無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，HPLC ≥99%，上海詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司；乙醇、苯酚，分析純，萊陽市康德化工有限公司；檸檬酸、磷酸氫二鈉，分析純，天津恒興化學(xué)試劑有限公司；纖維素酶（10 萬U/g）、木瓜蛋白酶（10 萬U/g），南寧龐博生物工程有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取干燥恒重的葡萄糖對照品0.020 1 g，加入蒸餾水定容至10 mL，得到2 mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。

吸取2.0 mL 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于25 mL 容量瓶中，加水稀釋至刻度，之后準(zhǔn)確吸取1.0 mL 到干燥潔凈的具塞試管中，加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖晃均勻后迅速滴入濃硫酸5.0 mL，充分混合均勻，冷卻到室溫后靜置30 min，測得最大吸收波長為488 nm。

分別吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL 和3.5 mL 于25 mL 容量瓶中，加水定容至刻度。分別吸取1.0 mL 不同濃度的葡萄糖溶液到具塞試管中，加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖晃均勻后迅速滴入濃硫酸5.0 mL，充分混合均勻，冷卻到室溫后靜置30 min；另取1.0 mL 水，用相同方法操作作為空白對照。用紫外可見分光光度計在波長488 nm處測定吸光度，以吸光度對葡萄糖濃度作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1 所示。線性回歸方程y=1.791 4x+0.063 5，R2=0.999 6。

圖1 苯酚-硫酸法測得的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.2 供試品的制備

蒲公英根粉末2.0 g 加適量蒸餾水，用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖溶液調(diào)節(jié)pH 值。超聲波處理一段時間后，加入適量纖維素酶懸液和木瓜蛋白酶懸液，酶解適當(dāng)時間后進行高溫滅酶，冷卻過濾，收集濾液，減壓濃縮，濃縮后的液體加入四倍量的95%乙醇溶液，冷藏靜置12 h，抽濾后取固形物，干燥得蒲公英根粗多糖。

1.3.3 供試品溶液吸光度的測定

稱取100 mg 粗多糖，加水定容至50 mL 后吸取2.0 mL 樣品溶液加水定容至25 mL，得到供試品溶液。吸取1.0 mL 供試品溶液到具塞試管中，加入5%苯酚溶液1.0 mL 搖勻，迅速滴入濃硫酸5.0 mL，充分混勻。冷卻至室溫，放置30 min，在波長488 nm 處測定吸光度。按照公式（1）計算多糖提取率。

式中，Y為蒲公英根多糖的提取率，%；c為供試品多糖濃度，mg/mL；D為稀釋倍數(shù)；v為多糖提取液體積，mL；m為蒲公英根樣品粉末質(zhì)量，mg。

1.3.4 單因素實驗

（1）最佳超聲時間。取蒲公英根粉末2.0 g，料液質(zhì)量比1 ∶30，pH 為5.0，超聲功率300 W，酶各2 mL（均為200 U/mL），酶解時間90 min，溫度55 ℃，分別超聲20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，計算多糖提取率。

（2）最佳超聲功率。取蒲公英根粉末2.0 g，料液質(zhì)量比1 ∶30，pH 為5.0，超聲時間30 min，酶各2 mL，酶解時間90 min，溫度55 ℃，超聲功率分別設(shè)定為200 W、250 W、300 W、350 W、400 W，計算多糖提取率。

（3）最佳酶用量。取蒲公英根粉末2.0 g，料液質(zhì)量比1 ∶30，pH 為5.0，超聲功率350 W，超聲時間30 min，酶解時間90 min，溫度55 ℃，兩種酶各取1.0 mL、1.5mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL，計算多糖提取率。

（4）最佳pH。取蒲公英根粉末2.0 g，料液質(zhì)量比1 ∶30，超聲功率350 W，超聲30 min，酶解時間90 min，溫度55 ℃，酶各2 mL，pH分別調(diào)整為3.0、3.5、4.0、4.5、5.0，計算多糖提取率。

（5）復(fù)合酶解時間。取蒲公英根粉末2.0 g，料液質(zhì)量比1 ∶30，pH 為5.0，超聲功率350 W，溫度55 ℃，超聲30 min，酶各2 mL，分別酶解30 min、60 min、90 min、120 min、150 min，計算多糖提取率。

1.3.6 正交實驗

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，確定超聲功率、超聲時間、酶解時間及溶液pH 為影響較大的四個因素，設(shè)計L9(34)正交實驗優(yōu)化蒲公英根中多糖的提取工藝，實驗參數(shù)如表1 所示。

表1 正交實驗設(shè)計表

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 最佳超聲時間

如圖2 所示，多糖提取率隨超聲時間延長呈先升高后降低趨勢，40 min 時提取率最高；超聲時間過長會破壞局部多糖的結(jié)構(gòu)，使粗多糖提取率下降，因此選擇超聲時間30 min、40 min、50 min 進行正交實驗。

圖2 超聲時間對多糖提取率的影響

2.1.2 最佳超聲功率

如圖3 所示，超聲功率從200 W 增加到350 W 時，多糖快速溶出，提取率隨功率增加逐漸上漲，當(dāng)功率超過350 W 時，得率驟然降低。因此，選取超聲功率為300 W、350 W、400 W 進行正交實驗。

圖3 超聲功率對多糖提取率的影響

2.1.3 最佳酶用量

如圖4 所示，復(fù)合酶用量從2.0 mL 提高到4.0 mL時，多糖提取率明顯升高。繼續(xù)增加酶用量，提取率基本不變，因此確定復(fù)合酶用量為4.0 mL，即纖維素酶、蛋白酶用量各2.0 mL。

圖4 復(fù)合酶用量對多糖提取率的影響

2.1.4 最佳pH

如圖5 所示，pH 為4.5 時粗多糖提取率達到最大值，增大pH，多糖提取率反而下降。因此，選擇pH值為4.0、4.5、5.0 進行正交實驗。

圖5 不同pH 值對多糖提取率的影響

2.1.5 復(fù)合酶解時間

如圖6 所示，酶解90 min 時多糖提取率最高，酶作用時間過長多糖提取率反而下降，因此復(fù)合酶作用最佳時間為90 min，選擇酶解時間為60 min、90 min、120 min 進行正交實驗。

圖6 酶解時間對多糖提取率的影響

2.2 正交實驗

如表2 所示，根據(jù)K值可得最佳提取工藝組合為A1B1C3D3，即超聲波功率300 W，超聲時間30 min，復(fù)合酶作用時間120 min，溶液pH 5.0。而根據(jù)多糖提取率結(jié)果，最佳組合為A3B1C3D2，即超聲波功率400 W，超聲時間30 min，復(fù)合酶作用時間120 min，溶液pH 4.5。通過比較極差可得，四個因素對多糖提取率的影響排序為超聲功率＞溶液pH ＞超聲時間＞酶解時間。

表2 正交實驗結(jié)果

2.3 驗證

為進一步驗證最佳工藝條件，在A1B1C3D3的條件下進行3 次重復(fù)性驗證試驗，得到多糖平均提取率為9.068%。另外對編號7 的組合進行3 次重復(fù)性實驗，得到多糖平均提取率為8.970%。因此，最佳工藝組合確定為A1B1C3D3。

3 結(jié)論

基于單因素實驗結(jié)果，設(shè)計L9(34)的正交實驗優(yōu)化蒲公英根多糖提取工藝，結(jié)果表明，對提取效果影響最大的是超聲功率，其次是溶液pH 及超聲時間，而酶解時間的影響較?。怀曒o助復(fù)合酶提取蒲公英根多糖最佳工藝為A1B1C3D3，即超聲作用時間30 min，超聲波功率300 W，溶液pH5.0，復(fù)合酶作用時間120 min。在最佳條件下，平行試驗三次，得到蒲公英根中多糖平均提取率為9.068%。