李佳虹，趙俊益，杜昕,2*，陳嬡

（1.成都師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，四川成都 611130；2.成都師范學(xué)院食品發(fā)酵研究所，四川成都 611130）

茶樹(shù)菇（Agrocybe cylindracea）也稱茶薪菇，屬于擔(dān)子菌門(mén)和田頭菇屬（Agrocybe）。干燥后的茶樹(shù)菇可以治療頭痛、嘔吐和老年人哮喘等，對(duì)腎虛、癌癥、高血壓有很好的輔助治療功效[1]。茶樹(shù)菇多糖具有很強(qiáng)的體外抗氧化特性，是一種超氧自由基捕捉劑[2-3]，同時(shí)也可以作為免疫調(diào)節(jié)劑，具有抗腫瘤、降血糖等作用[4]。

傳統(tǒng)的多糖類提取方法有熱水提取法[5]、酸堿提取法[6]等，但均存在耗時(shí)長(zhǎng)、提取率低、成本高等問(wèn)題。而超聲波輔助法提取多糖具有效率高、操作簡(jiǎn)便快速等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛使用[7]。例如，張君等[8]使用超聲波提取多糖，提取率為16.7%，與熱水浸提法相比，該法的提取率明顯提高。樊偉偉等[9]使用超聲波浸提猴頭菇多糖，提取率為6.22%，是熱水浸提法提取多糖得率的1.45 倍。另外，酶提法液是一種簡(jiǎn)單、便捷、綠色無(wú)污染的處理方法。謝瑋等[10]利用纖維素酶和果膠酶提取黑松松針多糖，發(fā)現(xiàn)復(fù)合酶法優(yōu)于單酶提取法，復(fù)合酶法的最大提取率為6.17%。王瑩等[11]同樣使用這兩種酶輔助提取柚子皮多糖，最高提取率為8.26%。與水提醇沉法及纖維素酶輔助法相比，復(fù)合酶法的提取效率顯著提高。

為進(jìn)一步提高多糖提取效率，學(xué)者們利用超聲波輔助酶催化水解，并取得了一定成效[12]。廉宜君等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在纖維素酶和果膠酶提取多糖中加上超聲波的輔助，可以使提取效果達(dá)到最佳，最大提取率為12.35%。王振西[14]同樣利用該法提取辣木多糖，獲得超聲協(xié)同復(fù)合酶的最大提取率為33.03%，比單獨(dú)采用超聲法提取多糖的得率高出近2 倍。基于此，本文通過(guò)添加纖維素酶和果膠酶，采用超聲輔助復(fù)合酶法提取茶樹(shù)菇多糖，并通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化茶樹(shù)菇多糖提取工藝，以期為茶樹(shù)菇多糖在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮茶樹(shù)菇，購(gòu)于溫江大潤(rùn)發(fā)超市；葡萄糖、硫酸、苯酚、95%乙醇、80%乙醇，分析純，天津市化學(xué)試劑有限公司；纖維素酶（100 000 U/g），食品添加劑，寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司；果膠酶（酶活力≥500 000 U/g），生化試劑，成都科龍化工試劑廠。

1.2 儀器和設(shè)備

KQ-250DE 型數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；ME204E 電子天平（萬(wàn)分之一），廣州廣電計(jì)量檢測(cè)股份有限公司；XL-30C 型超微粉碎機(jī)，南京威利朗食品機(jī)械有限公司；HWS28 型電熱恒溫水浴鍋，歐萊博科學(xué)儀器有限公司；LD5-2B 低速離心機(jī)，北京京立離心機(jī)有限公司；GM-1.0A 隔膜真空泵，天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；UV-1100 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，歐萊博科學(xué)儀器有限公司；MIX2000漩渦振蕩器，杭州睿城儀器有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 原料預(yù)處理

將新鮮茶樹(shù)菇置于烘箱中，60 ℃，烘12 h；取干茶樹(shù)菇子實(shí)體樣品剪碎，粉碎機(jī)粉碎，過(guò)80 目篩備用。

1.3.2 茶樹(shù)菇多糖的提取

參考陳巧玲等[15]的研究方法并進(jìn)行適當(dāng)修改。稱取1 g干茶樹(shù)菇粉，按一定的料液比加入適量蒸餾水，超聲波（680 W）處理一定時(shí)間后，50 ℃水浴0.5 h。稱取一定量的果膠酶和纖維素酶，按酶底比1.5%加入食用菌溶液中，反應(yīng)1 h 后抽濾（微孔過(guò)濾膜水系0.45 μm），濾液于沸水中滅酶10 min。用水將上述濾液轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶，加入50 mL 蒸餾水，裝上磨口的空氣冷凝管，于沸水浴中提取2 h，冷卻至室溫，將溶液轉(zhuǎn)移至100 mL 容量瓶中，加水定容，得到樣品測(cè)定液，采用苯酚-硫酸法測(cè)定多糖總量。

1.3.3 單因素實(shí)驗(yàn)

選取果膠酶∶纖維素酶質(zhì)量比（1.0 ∶1.0、1.5 ∶1.0、2.0 ∶1.0、2.5 ∶1.0 和3.0 ∶1.0）、超聲時(shí)間（20 min、25 min、30 min、35 min 和40 min）、料液比（1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25 和1 ∶30，g ∶mL）3 個(gè)因素進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，以多糖提取率為考察指標(biāo)，探究各因素對(duì)茶樹(shù)菇多糖提取效果的影響。研究某一因素時(shí)，其他因素的控制量為料液比1 ∶20（g ∶mL）、果膠酶和纖維素酶（質(zhì)量比，2.0 ∶1.0）、超聲時(shí)間20 min。

1.3.4 響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。使用Design-Expert 軟件進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，如表1 所示。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化因素水平表

1.4 多糖含量測(cè)定

1.4.1 試劑、溶液配制

苯酚試劑的配制：稱取80 g 苯酚于100 mL 燒杯中，加水溶解，定容至100 mL 后轉(zhuǎn)移至棕色瓶中，置于4 ℃冰箱中避光儲(chǔ)存。吸取5 mL 80%苯酚溶液，溶于75 mL 水中，混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 mg/L）的配制：稱取0.100 0 g干燥恒重的葡萄糖于100 mL 燒杯中，加水溶解，定容至1 000 mL，于4 ℃冰箱中儲(chǔ)存。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

分別吸取0.0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL和1.0 mL的標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖工作溶液置于20 mL具塞玻璃試管中，用蒸餾水補(bǔ)至1.0 mL。向試液中加入1.0 mL苯酚溶液，然后快速加入5 mL 硫酸，靜置10 min，使用漩渦振蕩器使反應(yīng)液充分混合，然后將試管置于30 ℃水浴中反應(yīng)20 min，于490 nm 處測(cè)定吸光度，以葡萄糖質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到的線性回歸方程為y=0.004 9x-0.002 4，R2=0.998 5。

1.5 多糖提取率計(jì)算

多糖提取率按公式（1）計(jì)算。

式中：c為茶樹(shù)菇多糖的質(zhì)量濃度，mg/mL；V為提取液的體積，mL；N為多糖溶液的稀釋倍數(shù)；W為茶樹(shù)菇粉末質(zhì)量，g。

1.6 數(shù)據(jù)處理及分析

采用SPSS 22.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，采用Design-Expert 11.0 軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 復(fù)合酶比對(duì)茶樹(shù)菇多糖提取率的影響

如圖1 所示，隨著果膠酶添加量的增大，多糖提取率呈先增大后減小的趨勢(shì)。當(dāng)復(fù)合酶比為1.5∶1.0，多糖提取率達(dá)到峰值，酶解催化效率已達(dá)最大，隨后提取率逐漸趨于穩(wěn)定。

圖1 復(fù)合酶比對(duì)多糖提取率的影響

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)多糖提取率的影響

由圖2 可知，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，茶樹(shù)菇多糖提取率呈先增大后減少的趨勢(shì)，當(dāng)超聲時(shí)間為30 min時(shí)，茶樹(shù)菇的多糖提取率最高?？赡苁且?yàn)槌暡▽?duì)茶樹(shù)菇的細(xì)胞膜破壞作用有限，短時(shí)間的超聲作用不能使胞內(nèi)物質(zhì)釋放，因此多糖提取率較低。隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞膜被破壞的程度增大，使多糖提取率上升。但當(dāng)超聲時(shí)間超過(guò)30 min 時(shí)，超聲時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，超聲波的機(jī)械剪切和熱作用使多糖被破壞與分解，導(dǎo)致多糖提取率減小[16]。由此可得最佳超聲時(shí)間為30 min。

2.1.3 料液比對(duì)多糖提取效果的影響

由圖3 可知，隨著提取液用量的增大，茶樹(shù)菇多糖提取率呈先增大后基本穩(wěn)定的趨勢(shì)。當(dāng)料液比在1 ∶10 到1 ∶25 之間時(shí)，隨著提取液用量的增大，多糖提取率大幅增加。在料液比為1 ∶25 時(shí)多糖提取率達(dá)到峰值，可能是因?yàn)槎嗵窃诹弦罕葹? ∶25時(shí)已經(jīng)全部溶解出來(lái)，而過(guò)量加入提取液可能會(huì)導(dǎo)致茶樹(shù)菇粉在超聲時(shí)所吸收的超聲波減少，從而導(dǎo)致多糖溶解不充分。

圖3 料液比對(duì)多糖提取率的影響

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

基于單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，以復(fù)合酶、超聲時(shí)間、料液比3 個(gè)因素為自變量，以多糖提取率為響應(yīng)值，進(jìn)行17 次實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2 所示。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.2.2 回歸方程方差分析及顯著性檢驗(yàn)

為了檢驗(yàn)回歸方程的有效性以及各種因素對(duì)多糖提取率的影響，對(duì)數(shù)據(jù)的回歸方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見(jiàn)表3。采用Design-Expert 8 軟件進(jìn)行回歸擬合，得到擬合回歸方程為Y=24.30+0.061A-0.04B-0.19C-0.015AB+0.098AC-2.5×10-3BC-0.31A2-0.60B2-0.27C2。

表3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果方差分析表

從表3 可以看出，模型P＜0.001，失擬項(xiàng)P=0.1771 ＞0.05，影響不顯著?；貧w模型的相關(guān)系數(shù)R2為0.993 2，修正后的相關(guān)系數(shù)R2Adj為0.984 5，說(shuō)明模型擬合度良好，預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值相關(guān)性好，實(shí)驗(yàn)誤差小。因此，本文建立的茶樹(shù)菇多糖提取率的回歸模型可用于分析和預(yù)測(cè)茶樹(shù)菇多糖的提取率。如表3所示，一次項(xiàng)C、交互項(xiàng)AC和二次項(xiàng)A2、B2、C2對(duì)多糖提取率影響極顯著，一次項(xiàng)A、B對(duì)多糖提取率影響顯著，其他因素的影響不顯著。

2.2.3 響應(yīng)面影響因素的交互作用

由上文可知，AC對(duì)多糖提取率的影響顯著，引文本實(shí)驗(yàn)選擇AC進(jìn)一步進(jìn)行交互作用分析，料液比與超聲時(shí)間的交互作用的響應(yīng)面如圖4 所示。隨著超聲時(shí)間和提取液用量的增加，多糖提取率呈先增加后降低的趨勢(shì)，并出現(xiàn)了爬坡最高點(diǎn)，結(jié)合底部的二維等高線圖可知，多糖的提取率具有最高點(diǎn)，料液比和超聲時(shí)間的交互作用顯著。

圖4 AC 交互作用

2.2.4 最佳工藝參數(shù)確定及驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

經(jīng)過(guò)模型預(yù)測(cè)，多糖的最佳提取條件為料液比為1 ∶29（g ∶mL）、復(fù)合酶比為1.5 ∶1.0、超聲時(shí)間為29 min，多糖提取率為24.14%。在該條件下進(jìn)行了3 組平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。3 組驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中多糖提取率的平均值為24.128%，與回歸方程所得的預(yù)測(cè)值相近，在誤差許可的范圍內(nèi)。此外，該條件下的多糖提取率約為對(duì)照組的1.5 倍，說(shuō)明超聲波輔助復(fù)合酶對(duì)于茶樹(shù)菇多糖率的提取效果顯著。

表4 驗(yàn)證及對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

本文采用超聲波輔助復(fù)合酶法優(yōu)化提取茶樹(shù)菇多糖工藝條件，結(jié)果表明最佳提取工藝條件為料液比1 ∶29（g ∶mL）、復(fù)合酶比1.5 ∶1.0、超聲波時(shí)間29 min，該條件下茶樹(shù)菇多糖的提取率為24.128%，約為對(duì)照組的1.5 倍，表明超聲波輔助纖維素酶及果膠酶對(duì)茶樹(shù)菇多糖提取率的影響顯著。本研究結(jié)果可為茶樹(shù)菇多糖產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供一定的理論基礎(chǔ)及參考。