劉鼎闊，董惠峰，寧未萌，劉闊，劉芳，李源，胡鵬程*

（1.鼎正新興生物技術(shù)（天津）有限公司，天津 300383；2.天津農(nóng)學(xué)院，天津 300393；3.天津市生物飼料添加劑企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300383；4.天津市飼用小分子蛋白工程中心，天津 300383）

蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段會(huì)產(chǎn)生外泌型的VIP 蛋白，進(jìn)入出芽生殖期后在芽孢內(nèi)會(huì)伴生一種特殊的伴孢晶體CRY 蛋白，這些蛋白均具有殺蟲效果，統(tǒng)稱BT 蛋白[1]。BT 蛋白的殺蟲機(jī)制已經(jīng)得到廣泛研究，基本途徑為蟲體的中腸上皮細(xì)胞存在特異位點(diǎn)，可以在與BT 蛋白結(jié)合后引起膜穿孔，最終導(dǎo)致蟲體死亡[2-4]。該機(jī)制主要作用于鱗翅目昆蟲，因哺乳動(dòng)物的腸細(xì)胞表層不含BT 蛋白受體，所以人和家畜動(dòng)物對(duì)這種蛋白不敏感，因此BT 蛋白作為一種無害殺蟲劑在殺蟲領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[5-6]。但是BT 蛋白的毒理作用是否會(huì)因?yàn)槠湓隗w內(nèi)積累而引起哺乳動(dòng)物的病變目前尚無確定結(jié)論，所以本文旨在通過加大蘇云金芽孢桿菌濃度，選擇健康小鼠為靶動(dòng)物，了解BT 蛋白純化液對(duì)動(dòng)物的臨床表現(xiàn)、生理生化指標(biāo)的影響，為該產(chǎn)品在臨床上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雌性健康小鼠40 只（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證：SYXK(京)2020-0053），體重18 ～22 g；蘇云金發(fā)酵BT 蛋白純化液，鼎正新興生物技術(shù)（天津）有限公司；蛋白胨、酵母粉，天津市北聯(lián)精細(xì)化學(xué)品開發(fā)有限公司。

SHY-2A 恒溫水浴搖床，上海比郎儀器制造有限公司；H1850R 低溫離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司；Countess 3 血球計(jì)數(shù)儀，賽默飛世爾科技公司；FDC NX500iVC 血生化儀，富士膠片醫(yī)療系統(tǒng)有限公司；HS-3315 組織切片機(jī)，北京萊博瑞杰科技有限公司；ECLIPSE SI 顯微鏡，尼康精機(jī)（上海）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)動(dòng)物分組

將試驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為4 組，每組10 只，分組情況見表1。

表1 試驗(yàn)動(dòng)物分組與處置

1.2.2觀察指標(biāo)

一般動(dòng)物安全性實(shí)驗(yàn)觀察周期在7 ～28 d，本實(shí)驗(yàn)考慮發(fā)酵制品儲(chǔ)存周期不宜過久，且儲(chǔ)存期越長(zhǎng)，污染風(fēng)險(xiǎn)越高；另考慮BT 蛋白在胃腸環(huán)境極易吸收，7 d足以產(chǎn)生足夠的積累，所以確定第7 d 觀察相關(guān)指標(biāo)。

1.2.2.1臨床觀察

試驗(yàn)期間每日觀察受試動(dòng)物是否出現(xiàn)與藥物相關(guān)的不良反應(yīng)，如呼吸與行為異常、精神抑制及排糞異常等情況。

1.2.2.2體重

對(duì)試驗(yàn)前及試驗(yàn)結(jié)束后受試小鼠稱量體重，做好記錄。

1.2.2.3血樣分析

（1）采血及處理方法。所有動(dòng)物分別在給藥前和給藥結(jié)束后采血，分兩管放置；其中1 管為帶抗凝劑的離心管，用于血常規(guī)分析；另一管不帶抗凝劑，血液樣品于室溫下靜置2 h，2 500 r/min 離心5 min，取上層血清，-20 ℃保存，用于血液生化指標(biāo)分析。

（2）血常規(guī)分析。取加抗凝劑管全血進(jìn)行白細(xì)胞計(jì)數(shù)（WBC）、白細(xì)胞分類[嗜中性粒細(xì)胞（NE）、淋巴細(xì)胞（LY）、單核細(xì)胞（MO）、嗜酸性粒細(xì)胞（EO）、嗜堿性粒細(xì)胞（BA）]、紅細(xì)胞計(jì)數(shù)（RBC）、血紅蛋白（HGB）、紅細(xì)胞壓積（HCT）、血小板計(jì)數(shù)（PLT）等指標(biāo)分析。

（3）血液生化指標(biāo)分析。取血清進(jìn)行丙氨酸氨基轉(zhuǎn)換酶（ALT）、天門冬氨酸轉(zhuǎn)換酶（AST）、尿素氮（BUN）、肌酐（Cr）、白蛋白（ALB）、總蛋白（TP）、總膽固醇（CHO）、甘油三酯（TG）等指標(biāo)分析。

1.2.2.4解剖學(xué)檢查

對(duì)靶動(dòng)物進(jìn)行大體解剖學(xué)檢查，對(duì)心、肝、脾、肺、腎等臟器有選擇地做病理學(xué)剖檢和病變組織觀察，了解該制劑臨床應(yīng)用的安全性。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差格式展示，采用SPSS 13.0中卡方檢驗(yàn)分析組間差異，P＜0.05 和P＜0.01 分別表示差異顯著和極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 給藥后臨床觀察

各組動(dòng)物給藥后的呼吸、行為、精神、排糞、食欲等均正常，未出現(xiàn)不良反應(yīng)。

2.2 給藥前后體重變化

給藥前和給藥后動(dòng)物體重結(jié)果見表2。結(jié)果表明，給藥前后各組小鼠的體重差異不顯著（P＞0.05）。

表2 給藥前和給藥后小鼠體重變化（單位：g）

2.3 血常規(guī)分析結(jié)果

各組小鼠的血常規(guī)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果見表3。從表3中可以看出，各劑量組給藥前后的血常規(guī)指標(biāo)與正常組比較差異不顯著（P＞0.05），說明Bt 發(fā)酵純化上清液在0.2 mL/kg、0.6 mL/kg、1.0 mL/kg 劑量范圍對(duì)血液常規(guī)指標(biāo)沒有明顯的影響。

表3 不同劑量Bt 發(fā)酵純化上清液對(duì)小鼠血常規(guī)指標(biāo)的影響

2.4 血液生化分析結(jié)果

小鼠的血液生化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果見表4。從表4 中可以看出，各劑量組給藥前后的血液生化指標(biāo)與正常組比較差異不顯著（P＞0.05），說明Bt 發(fā)酵純化上清液在0.2 mL/kg、0.6 mL/kg、1.0 mL/kg 劑量范圍對(duì)血液生化指標(biāo)沒有明顯的影響。

表4 不同劑量Bt 發(fā)酵純化上清液對(duì)小鼠血液生化指標(biāo)的影響

2.5 尸體解剖及組織觀察結(jié)果

1.0 mL/kg 劑量組和對(duì)照組的心、肝、脾、肺、腎的組織切片見圖1。大體剖檢結(jié)果和組織學(xué)檢查均無明顯的肉眼可見病理變化。

圖1 組織切片

3 結(jié)論

綜上所述，Bt 發(fā)酵純化上清液按0.2 mL/kg、0.6 mL/kg、1.0 mL/kg 劑量給藥，小鼠體態(tài)特征與對(duì)照組相比未見異常；血常規(guī)、血液生化分析等檢測(cè)結(jié)果顯示兩組差異不顯著；給藥結(jié)束后解剖小鼠，制作組織切片，通過10 倍和40 倍顯微鏡觀測(cè)仍未見病理變化。由此說明，Bt 發(fā)酵純化上清液的生物安全性極高。