錢 瑋， 陳 新， 陳宏偉， 高 宇

（1.蘇州科技大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 蘇州 215009；2.張家港市園林苗圃園林科技研究所，江蘇 蘇州 215600）

近年來，隨著城市外擴(kuò)步伐的不斷推進(jìn)，城市綠化也得以快速發(fā)展。園林廢棄物作為重要的生物質(zhì)原料，其體量逐年增加[1]。因此，如何高效實現(xiàn)廢棄物的資源化與清潔生產(chǎn)已受到廣泛關(guān)注[2]。目前對于廢棄物堆肥化處理的研究，主要集中于外源微生物菌劑的研制，以期改善堆體微生物的豐富度與多樣性，從而構(gòu)建出更多的降解酶系來完成對物料的選擇性破壞，使之成為可再生利用的資源[3-4]。 自20 世紀(jì)40 年代以來，我國彭家元與陳禹平就通過添加高溫富集培養(yǎng)出的纖維分解菌，短時間內(nèi)實現(xiàn)了物料腐熟，為我國農(nóng)業(yè)積肥造肥開辟了新道路。 但早期此類菌劑微生物較為單一，功能菌株抗逆性不足且很難長時間維持較高活性，因此，以復(fù)配菌劑作為堆肥的外源添加物已逐漸成為近年來的主流趨勢[5-6]。 如席北斗[7]等在生活垃圾中添加的復(fù)合菌群（固氮菌、酵母菌、纖維素分解菌等），可使堆體溫度24 h 上升至68 ℃，15 d 內(nèi)有機(jī)物下降33.3%，腐熟時間也同比縮短了18 d。 Hou T[8]等將耐熱的硝化細(xì)菌和硫氧化細(xì)菌復(fù)合加至污水污泥中進(jìn)行堆肥，從而提高了生境中氮硫代謝的關(guān)鍵酶活與元素轉(zhuǎn)化。 Zheng W[9]等研究表明添加蚯蚓糞和生物炭使秸稈堆肥中不動桿菌相對豐度增加，細(xì)菌群落Shannon 和Pielou 指數(shù)分別增加了9.42%和9.33%，實際應(yīng)用中黃瓜增產(chǎn)達(dá)46%。因此，為了園林廢棄物的高效利用，從而深入復(fù)配菌劑的探究，促使其在堆肥過程中協(xié)同發(fā)揮出更為顯著的效果具有重要意義。

1 復(fù)配菌劑的研制

園林廢棄物是一種富含木質(zhì)纖維的堆肥材料，其中大量的木質(zhì)素與半纖維素牢固地結(jié)合在一起，將纖維素致密地包裹起來，從而嚴(yán)重影響了微生物的降解與外界氧化[10-11]。 同時，其強烈的季節(jié)性與空間異質(zhì)性，也直接阻礙了園林廢棄物專用菌系的研制。 因此，通過合適的方法構(gòu)建出一組關(guān)于木質(zhì)素纖維素降解能力強的復(fù)合菌系，已成為園林廢棄物高溫快速堆肥的關(guān)鍵所在。 目前復(fù)配菌劑的研制方法主要包括：

1.1 功能菌株的組合

功能菌株的組合是指研究者根據(jù)自己的實驗意圖，選擇一些已知的菌株或從堆肥物料中篩選的功能菌進(jìn)行優(yōu)化組合，從而得到一組針對性較強的復(fù)合菌劑[12]。 目前常見的組合方式有：①根據(jù)菌株的不同功能進(jìn)行復(fù)配，如何慧中[13]等通過3 株具有木質(zhì)素降解能力的真菌與7 種營養(yǎng)菌進(jìn)行組合，發(fā)現(xiàn)菌群間可以彼此協(xié)同、聯(lián)合作用，既能實現(xiàn)對外界環(huán)境的快速適應(yīng)，又可完成對木質(zhì)素的高效降解；②利用統(tǒng)計學(xué)方法（正交設(shè)計、均勻設(shè)計等）重組菌劑，如尹爽[14]等通過正交試驗對不同菌株的比例、發(fā)酵時間與溫度進(jìn)行探索，從而得出S-3 菌株與白腐菌等比混合而成的復(fù)合菌劑，在30 ℃條件下發(fā)酵17 d 的作用效果最佳，其對纖維素和木質(zhì)素的降解率分別可達(dá)35.60%和37.41%；③根據(jù)自然狀態(tài)下的原始比例配制菌劑，如李天樞[15]等將不同溫度下所分離篩選的菌株按照自然比例進(jìn)行增殖和復(fù)配，由此而來的菌劑升溫迅速，且對碳、氮的固定效果皆優(yōu)于市場所售菌劑。

1.2 直接篩選法

直接篩選法擺脫了復(fù)合菌劑以純培養(yǎng)手段為基礎(chǔ)的固有模式， 是一種通過對特定時期的土著微生物進(jìn)行富集或連續(xù)傳代馴化，使之保持原有的協(xié)同關(guān)系而對物料產(chǎn)生降解效果的研制方法。其主要操作包括：①擴(kuò)大培養(yǎng)，如徐智[16]等將特定環(huán)境下的堆肥原料直接接種至液體培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)， 使其有效活菌數(shù)達(dá)到理想數(shù)量級的培養(yǎng)物作為內(nèi)源復(fù)合菌劑。研究表明，接種該菌劑的物料升溫迅速且腐熟效果明顯優(yōu)于外源菌劑。 ②連續(xù)傳代馴化培養(yǎng)，如崔宗均[17-18]等將高溫階段的物料接種至含濾紙的蛋白胨纖維素培養(yǎng)液（PCS）中，50 ℃下靜止培養(yǎng)。 當(dāng)浸在培養(yǎng)液中的濾紙條剛要斷裂時，將其轉(zhuǎn)接至相同的新鮮培養(yǎng)液中，重復(fù)傳代數(shù)次，最終得到一組纖維素分解能力強的復(fù)合菌系MC1。 該菌系4 d 內(nèi)對稻草秸稈的降解率可達(dá)60%以上。 ③腐料回用，如宋修超[19]等將堆肥腐熟后的物料直接作為復(fù)合菌劑，并將其添加至新的堆肥處理中。 結(jié)果表明，腐料使得堆肥的高溫期提前了20 d，且平均溫度同比上升了5 ℃左右。 兩種復(fù)配菌劑研制方法的比較見表1。

表1 兩種復(fù)配菌劑研制方法的比較

2 復(fù)配菌劑在堆肥中的群落結(jié)構(gòu)演替研究

2.1 宏基因組學(xué)的應(yīng)用

微生物的群落結(jié)構(gòu)是動態(tài)變化的，它們與環(huán)境變量息息相關(guān)，其中劣勢菌株因生長限制而被相繼淘汰。相反，其他菌株卻因此優(yōu)勢代之，最終達(dá)到一個相對穩(wěn)定的狀態(tài)。 故在針對復(fù)合菌劑的研究過程中，有必要采取一種合適的分析方法，用以揭示堆肥各階段的群落結(jié)構(gòu)以及演替規(guī)律，為菌劑微生物的后續(xù)影響提供一定的理論依據(jù)。

傳統(tǒng)的分析方法是建立在分離與培養(yǎng)的基礎(chǔ)上，通過對純種微生物的形態(tài)特征或顯微觀察來了解群落結(jié)構(gòu)的分布情況[20]。該方法操作簡單、廉價，但由于培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的限制，目前可通過此法鑒定的微生物僅占環(huán)境總量的0.1%～10%，這顯然不足以描述自然條件下群落結(jié)構(gòu)的真實狀態(tài)[21]。

宏基因組學(xué)技術(shù)是一種不依賴于傳統(tǒng)微生物的分離與培養(yǎng)，而是直接通過提取環(huán)境樣品中所有微生物（可培養(yǎng)、不可培養(yǎng)的活菌以及未降解的死菌）完整的遺傳學(xué)信息，并經(jīng)過合適的載體將其轉(zhuǎn)運至穩(wěn)定表達(dá)的宿主細(xì)胞中，以實現(xiàn)對所需目的基因的篩選[22-23]。 同時，隨著高通量測序與分子鑒定技術(shù)的飛速發(fā)展，使得宏基因組學(xué)在挖掘有效生物學(xué)信息的過程中具備更加準(zhǔn)確、全面、可操作性等優(yōu)勢，從而充分保障了后續(xù)微生物的種屬鑒定以及相應(yīng)功能的預(yù)測， 全面闡釋了各群落結(jié)構(gòu)間的差異性或與環(huán)境因子間的關(guān)聯(lián)程度。 如Nagata N[24]等利用宏基因組鳥槍法對胰腺導(dǎo)管癌（PDAC）患者的腸道和唾液進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，患者樣本中的物種組成與相對豐度在疾病早期就已出現(xiàn)嚴(yán)重失調(diào)。進(jìn)一步說明了PDAC 對腸道和口腔微生物的影響。Du C[25]等通過構(gòu)建宏基因組文庫對岱海湖沉積物中抗生素抗性基因（ARGs）和金屬抗性基因（MRGs）的多樣性進(jìn)行了研究。 其中共鑒定分析出了16 種ARGs 類型（主要是桿菌肽、鏈霉素、四環(huán)素、β-內(nèi)酰胺和磺胺的耐藥基因）與15 種MRGs 類型（主要為多金屬耐藥基因），從而解釋了湖泊生境中的多種抗性行為。

2.2 群落結(jié)構(gòu)及演替規(guī)律

2.2.1 復(fù)配菌劑的影響

在微生物的群落組成與演替規(guī)律的探索過程中，宏基因組測序技術(shù)向研究者提供了更加全面準(zhǔn)確的信息。研究表明，復(fù)合菌劑的施加對原始微生物的群落組成有著顯著影響。其中真菌對環(huán)境變化的適應(yīng)能力較弱，往往在物種組成的方面表現(xiàn)出比細(xì)菌更大的差異性[26]。而相比之下，細(xì)菌的多樣性受接種的影響較小，整體呈現(xiàn)出比真菌更多的種類和數(shù)量，這是由于細(xì)菌可利用的資源廣，遇復(fù)雜因素的抗性強[24]。 而在園林廢棄物的堆肥過程中，菌劑的添加也同樣對微生物的群落演替造成了影響。如夏金利[28]等通過對堆肥樣本的PCA分析發(fā)現(xiàn)，各處理中真菌的群落結(jié)構(gòu)因菌劑的施加而出現(xiàn)了明顯差異，這種差異隨時間的延長而逐漸減小，10 d 后幾乎消除。但細(xì)菌群落卻與此相反，在前期物料升溫的過程中，像Sphingobacterium、Thermobifida 等具有木質(zhì)纖維降解能力的優(yōu)勢菌屬在各處理中基本呈現(xiàn)出相同的變化趨勢，而中后期僅能在含菌劑的物料中被檢測到。 同樣，Liu[29]等通過高通量測序技術(shù)對園林廢物堆體中的細(xì)菌多樣性進(jìn)行了全面分析，結(jié)果表明菌劑的施加改變了堆肥中期細(xì)菌的演替方向，在此階段中各處理的多樣性指數(shù)（Shannon）最大，物種差異最為明顯，從而進(jìn)一步驗證了菌劑對生境微生物群落的影響。

2.2.2 不利因素的影響

總體而言，復(fù)合菌劑的施加賦予了微生物更高的能量代謝與物質(zhì)降解效率[27，30]。 但是，堆肥系統(tǒng)中群落的組成通常也會受到許多不利因素的干擾而導(dǎo)致理想的演替方向出現(xiàn)偏差，最終致使所呈現(xiàn)出來的菌劑效果微乎其微，甚至完全失敗[31]。 如Xi[32]等認(rèn)為，菌劑與土著微生物之間的競爭關(guān)系將會引起某些功能菌株的衰退，從而導(dǎo)致優(yōu)勢種群的多樣性降低、菌劑的作用效果減弱。 同樣，Zhao[33]等指出物料中殘留的抗生素也會抑制菌劑微生物的數(shù)量與活性，從而造成肥力的大量損失。 另外，更為關(guān)鍵的因素在于園林廢棄物的本質(zhì)是一種富含木質(zhì)纖維素的堆肥材料。 其在未經(jīng)任何處理的條件下，僅憑微生物的降解作用是很難打破木質(zhì)素和半纖維素之間的屏障，而使纖維素從中釋放出來并轉(zhuǎn)化為可發(fā)酵利用的糖。 最終大部分功能菌株由于營養(yǎng)匱乏而導(dǎo)致種類和數(shù)量急劇減少，引起發(fā)酵失敗[34]。 因此，研究者必須采取相應(yīng)的措施消除不利因素的影響（見表2），以確保功能菌株能隨著群落的正常演替而發(fā)揮積極作用。

表2 生境中不利因素的消除措施

2.2.3 溫度變化的影響

高溫好氧發(fā)酵是園林廢棄物菌劑快速堆肥的典型特征。 在保證氧氣含量充足的條件下，微生物群落將會隨著溫度的變化而不斷進(jìn)行自我調(diào)節(jié)與生態(tài)位的分離，以實現(xiàn)群落演替[12，29]。 而對于堆肥的不同階段，功能菌株的種類和數(shù)量越多，木質(zhì)纖維的降解酶系就越豐富，反應(yīng)速率就越快[43]。因此在施加復(fù)合菌劑后，系統(tǒng)中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化趨勢應(yīng)盡量符合物料溫度的整體走向，以確保每個階段的生物活性都維持在一個較高的水平。

（1）升溫階段。 堆肥初期，微生物優(yōu)先利用各種可溶性有機(jī)物（脂肪、單糖和碳水化合物）進(jìn)行生長繁殖并釋放熱量，從而引起堆體溫度的迅速上升。 在此階段中，微生物的種類和數(shù)量極為豐富（細(xì)菌、放線菌、真菌），其中主要以中溫、好氧型為優(yōu)勢菌群[43]。 雖然這些菌類都具備有機(jī)物的分解能力，但對于不同化合物的親和程度卻有所差異。 如在園林廢棄物堆肥的升溫階段，主要的優(yōu)勢細(xì)菌為厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（proteobacteria）等，這是因為它們能有效吸收糖類等易分解的物質(zhì)[28-29，44]。 相比之下，真菌的多樣性卻遠(yuǎn)低于細(xì)菌，大致與放線菌相當(dāng)。 其中主要包括子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）等，它們在降解纖維素、木質(zhì)素方面表現(xiàn)出超強的效果[28，44]。

（2）高溫階段。當(dāng)物料溫度上升至50 ℃以上時，即可認(rèn)為進(jìn)入高溫階段[43，45]。 此時，生境中的物種多樣性與豐富度發(fā)生了顯著變化，它們整體朝著嗜熱性的方向進(jìn)行演替。 在此階段中，嗜熱性細(xì)菌和放線菌的代謝活動逐漸加劇，存在明顯的優(yōu)勢種群地位。 而大多數(shù)真菌受高溫抑制甚至死亡，僅部分耐高溫的真菌（Thermomyces dupontii、Thermomyces lanuginosus、Thermophilic sporotrichum）開始大量增殖且對木質(zhì)素、纖維素等復(fù)雜化合物表現(xiàn)出強烈的降解能力[46-47]。 而當(dāng)溫度繼續(xù)升高至60 ℃以上時，生境中幾乎所有的真菌完全停止活動，此時嗜熱性細(xì)菌與放線菌（Acidothermus cellulolyticus、Bacillus subtilis、Rhodothermus marinus、Thermobifida fusca）占據(jù)主導(dǎo)地位，繼而對一些難降解的有機(jī)化合物加以分解并開始腐殖質(zhì)的形成[46，48]。

高溫期是園林廢棄實現(xiàn)快速堆肥并獲取高品質(zhì)腐料的重要階段。 在此過程中，功能性微生物不僅代謝活躍，對木質(zhì)纖維表現(xiàn)出超強的降解能力。 同時，高溫等物理條件也促使了大分子復(fù)雜化合物的結(jié)構(gòu)裂解，使得大量芳香類物質(zhì)得以釋放，為腐殖質(zhì)的合成提供了更多前體，有利于后期生物途徑（微生物合成、細(xì)胞自溶）與非生物途徑（美拉德反應(yīng)、多酚自縮合等）對腐殖質(zhì)的積累[49]。因此有必要通過宏基因組學(xué)技術(shù)，全面獲悉堆肥各階段的群落演替規(guī)律，從而階段性補足不同時期的功能性微生物（見表3）。 特別在高溫階段，通過添加合適比例的嗜熱性微生物，這對有效解決園林廢棄物堆肥周期長、降解不徹底的問題具有重要意義[35]。

表3 不同物料中的功能微生物

（3）腐熟階段。 當(dāng)溫度持續(xù)下降并穩(wěn)定維持在40 ℃左右時，堆肥進(jìn)入腐熟階段[12]。 此時園林廢棄物中可利用的有機(jī)物基本完成了礦質(zhì)化和腐殖化， 體系中僅剩下一些較難分解的殘留物以及新合成的腐殖質(zhì)[3，15]。此時，由于營養(yǎng)的嚴(yán)重匱乏以及對溫度環(huán)境的不適應(yīng)，大量嗜熱性微生物的多樣性與豐富度開始逐漸降低。而那些經(jīng)過高溫期殘留下來的中溫細(xì)菌、真菌、放線菌又重新活躍起來并再次恢復(fù)優(yōu)勢地位，進(jìn)而對上階段的難降解物質(zhì)繼續(xù)分解、腐殖。

3 復(fù)配菌劑的群落結(jié)構(gòu)的影響因素研究

如今，隨著鑒定技術(shù)與數(shù)據(jù)處理能力的飛速發(fā)展，環(huán)境因素與物種之間的聯(lián)系也越加明確。 研究者可通過對相關(guān)影響因子（如：原料含水率、C/N 比、氧氣濃度、pH 值等）的定向調(diào)控，以確保復(fù)合菌劑的高效作用。

3.1 含水率

含水率是指示堆肥特性的一個重要參數(shù)，如果含水率過高，物料各組分間的空隙將會被水膜填充，導(dǎo)致堆體供氧不足而形成厭氧狀態(tài)，并產(chǎn)生惡臭。 同樣，過低的含水率也將嚴(yán)重阻礙微生物的生長繁殖、物質(zhì)交換以及代謝速率，甚至導(dǎo)致整個堆肥工藝的失敗[52]。目前大量研究表明，堆肥的起始含水率控制在50%～60%最為適宜[43，45]。 但由于園林廢棄物中結(jié)構(gòu)致密的木質(zhì)纖維素對水分的持有能力較弱，往往會引起堆體底部積水，不利于好氧發(fā)酵[53]。因此還需通過翻堆或加入表面活性劑等措施加以改善[54]。

3.2 C/N

園林廢棄物的C/N 比隨組分、地域、季節(jié)而變化，整體呈現(xiàn)出高碳低氮的性質(zhì)（見表4）。 理論情況下，微生物每消耗25 g 碳便需要吸收1 g 氮[43]。但當(dāng)物料中的C/N 比過高時， 微生物則需要經(jīng)過多次生命循環(huán)才能氧化掉多余的有機(jī)質(zhì)，進(jìn)而延緩了堆肥進(jìn)程。 若C/N 比過低，則過量的氮素又將以氨氣的形式流失，致使物料肥效下降。 通常來說，堆肥材料的初始C/N 比控制在25%～30%范圍內(nèi)最為適宜[12，55]。 因此對于園林廢棄物的前期預(yù)處理，可以選擇一些含氮量較高的經(jīng)濟(jì)來源物（見表5）進(jìn)行調(diào)節(jié)。

表4 常見園林廢棄物的理化參數(shù)

表5 常見高氮物料的理化參數(shù)

3.3 pH 值

pH 值是影響微生物代謝活動的重要因素之一，其大小隨溫度和時間的變化而變化。一般認(rèn)為，中性或弱堿性為微生物堆肥發(fā)酵的最適環(huán)境[43，45]。當(dāng)pH 值過高或過低時，可通過翻堆或加入一些中和藥劑進(jìn)行調(diào)節(jié)，以避免微生物的生長繁殖和有機(jī)物的降解受到抑制。 但由于堆肥系統(tǒng)本身存在一定的自我緩沖能力，故在實踐操作中很少專門針對pH 值進(jìn)行調(diào)控[52]。

3.4 氧氣濃度

充足的氧氣供給是實現(xiàn)園林廢棄物高溫快速堆肥的關(guān)鍵所在。 研究發(fā)現(xiàn)，堆體的溶氧濃度維持在8%～18%范圍內(nèi)最為適宜[64-65]。若通氣太旺，則會引起微生物的活動加劇，致使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)以及水分嚴(yán)重流失。同時，熱量的大量散失也將導(dǎo)致底物中的蟲卵和病原菌無法有效殺滅；相反，若溶氧濃度低于8%時，堆體內(nèi)部又將形成厭氧環(huán)境，從而產(chǎn)生惡臭并影響堆肥質(zhì)量。 因此，研究者往往根據(jù)堆層中的氧氣濃度和耗氧速率，以翻堆、表面自然擴(kuò)散或強制通風(fēng)等方式對系統(tǒng)中的溶氧濃度加以調(diào)控[52]。 但值得注意的是，在通風(fēng)供氧的過程中，應(yīng)充分考慮物料密度與空隙的最大飽和度，以避免造成溫度的大幅度變化。

3.5 溫度

溫度是微生物活動強度的最好反映。 在堆肥初期，堆體中的嗜溫菌較為活躍，能迅速利用物料中的可溶性有機(jī)物并釋放出熱量，引起溫度的不斷上升[66]。 當(dāng)溫度到達(dá)55 ℃左右時，堆肥進(jìn)入高溫好氧階段。 此時嗜溫菌的生長活動受到限制甚至死亡，而嗜熱菌的繁殖進(jìn)入激發(fā)態(tài)，一些復(fù)雜難分解的有機(jī)化合物（半纖維素、纖維素、木質(zhì)素等）也開始逐漸降解[12]。 但高溫不宜超過60 ℃，否則將導(dǎo)致大部分微生物的代謝活動停止，僅剩下部分嗜熱菌[52]。 因此，一般認(rèn)為高溫階段最好在55～60 ℃范圍內(nèi)，并維持3 d 以上，這樣既能保證堆體微生物的豐富度和多樣性，又能達(dá)到無害化處理的標(biāo)準(zhǔn)[52，67]。

4 結(jié)語

添加外源復(fù)配菌劑的堆肥化處理因其綠色、環(huán)保、經(jīng)濟(jì)效益大等顯著優(yōu)勢，現(xiàn)已廣泛實踐應(yīng)用于園林廢棄物的資源化再利用。 但由于物料自身高C/N 比、親水性差、透氣性不足、高分子化合物（如纖維素、木質(zhì)素等）難降解等特性，這對未來復(fù)配菌劑的模型構(gòu)建、特性優(yōu)化以及相關(guān)配套設(shè)備與工藝提出了更高的要求。相信隨著研究的深入和產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用，復(fù)合堆肥菌劑能夠為園林廢棄物的科學(xué)化、綠色化、安全化處理提供強有力的支持，能夠有效改善園林廢棄物堆肥效率低的問題。