郭偉強(qiáng)， 吳天惠， 陳子明， 張 杰， 張佳鈺， 胡翠英， 秦粉菊

（蘇州科技大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，江蘇 蘇州 215009）

癌癥是排位第二的死亡原因，嚴(yán)重危害人民群眾的身心健康。 據(jù)統(tǒng)計(jì)，2022 年，美國(guó)新發(fā)腫瘤195 多萬例，新增死亡病例接近61 萬；而我國(guó)新增406.4 萬例癌癥患者，且我國(guó)惡性腫瘤發(fā)病率高于全球平均水平[1-2]。 目前，腫瘤治療仍以手術(shù)、化療、放療及靶向治療為主，但化療和靶向治療的耐藥現(xiàn)象以及毒副作用等因素使得患者難以獲得較為合適的治療效果。 因此，探討找尋更加有效且安全的治療藥物或方法極具臨床意義和價(jià)值。

中草藥是中華民族的傳統(tǒng)瑰寶，其療效在長(zhǎng)期的實(shí)踐中已得到確認(rèn)，從中草藥中尋找有活性的成分是藥物開發(fā)及先導(dǎo)藥物篩選的有效途徑和捷徑[3]。 甘草酸（Glycyrrhizic Acid，GA，如圖1 所示），屬五環(huán)三萜類化合物，是甘草中含量最高、生物活性較強(qiáng)的有效成分之一，具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤等作用。 已有研究發(fā)現(xiàn)，GA 通過抑制SIRT3、ROS、AKT 等通路實(shí)現(xiàn)抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)凋亡等作用[4-6]。 雖然GA 的抗腫瘤活性和作用機(jī)制研究取得一定的成果，但由于中藥成分存在著多靶點(diǎn)、多作用通路現(xiàn)象，深入全面地分析其作用靶點(diǎn)和作用機(jī)制具有重要意義。

圖1 甘草酸結(jié)構(gòu)式

隨著生物信息學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)、分子藥理學(xué)等科學(xué)的飛速發(fā)展，建立在組學(xué)和多向藥理學(xué)基礎(chǔ)上的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)備受關(guān)注。其已被廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物的活性成分分析、作用靶蛋白找尋和藥理機(jī)制詮釋之中，極大地促進(jìn)了藥物發(fā)現(xiàn)和重定位[7]。 文中研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，經(jīng)反向?qū)宇A(yù)測(cè)、GO/KEGG 富集分析、蛋白-蛋白互作用分析、分子對(duì)接驗(yàn)證等，預(yù)測(cè)分析GA 抗腫瘤的作用機(jī)制和潛在作用靶蛋白，為以GA 為先導(dǎo)物的抗腫瘤藥物開發(fā)提供參考和依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 GA 的靶蛋白預(yù)測(cè)

利用Super-PRED 數(shù)據(jù)庫中的Target Prediction 模塊（https：//prediction.charite.de/subpages/target_prediction.php）導(dǎo)入GA 結(jié)構(gòu)式，預(yù)測(cè)其潛在作用靶蛋白，隨后將預(yù)測(cè)結(jié)果保存，以便后續(xù)分析。

1.2 相關(guān)疾病分析和抗腫瘤靶蛋白的篩選

將上述所預(yù)測(cè)的潛在靶蛋白輸入CTD 數(shù)據(jù)庫（ctdbase.org/about/），根據(jù)醫(yī)學(xué)主題詞的疾病分類，篩選獲得癌癥的相關(guān)條目，得到GA 相關(guān)的潛在抗腫瘤靶蛋白。

1.3 “GA-靶蛋白-腫瘤”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

以GA、 潛在抗腫瘤靶蛋白和對(duì)應(yīng)癌癥類型等為節(jié)點(diǎn)， 在Excel 中建立彼此對(duì)應(yīng)關(guān)系， 隨后導(dǎo)入Cytoscape 軟件中，利用Network Analyzer 插件構(gòu)建“GA-靶蛋白-腫瘤”藥理網(wǎng)絡(luò)。

1.4 GO、KEGG 富集分析

為進(jìn)一步分析GA 的抗腫瘤潛在作用機(jī)制， 將GA 的潛在抗腫瘤靶蛋白輸入DAVID 在線分析系統(tǒng)，將研究對(duì)象限定為人，進(jìn)行GO、KEGG 富集分析，并借助Omicshare 在線平臺(tái)所得通路構(gòu)建氣泡圖。

1.5 蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

在STRING 數(shù)據(jù)庫（www.string-db.org）中，輸入GA 的抗腫瘤靶蛋白進(jìn)行在線分析，研究物質(zhì)限定為人，數(shù)據(jù)導(dǎo)出為TSV 格式，隨后利用Cytoscape 構(gòu)建GA 抗腫瘤靶點(diǎn)的PPI 網(wǎng)絡(luò)。

1.6 分子對(duì)接驗(yàn)證

為進(jìn)一步驗(yàn)證GA 與潛在靶蛋白的結(jié)合能力，采用iGEMDOCK 分子軟件進(jìn)行對(duì)接分析。 首先，從PDB數(shù)據(jù)庫（www.rcsb.org）中下載GA 相關(guān)靶蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，并用Autodock Vina 去掉多余的分子、加氫等，將其轉(zhuǎn)換為Pdbpt 格式。 隨后，進(jìn)行對(duì)接分析，并使用Pymol 進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 GA 的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)分析

經(jīng)Super-PRED 數(shù)據(jù)庫中的Target Prediction 模塊預(yù)測(cè)，得到110 個(gè)GA 的潛在作用靶蛋白，見表1。 將所得到的110 個(gè)靶蛋白，通過CTD 數(shù)據(jù)庫分析，篩選得到56 個(gè)與腫瘤相關(guān)的靶蛋白和41 種腫瘤類型相關(guān)。隨后，借助Cytoscape 構(gòu)建“GA-靶蛋白-腫瘤”網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)一步對(duì)GA、與腫瘤相關(guān)靶蛋白及腫瘤類型之間的關(guān)系進(jìn)行可視化分析（如圖2 所示）。 這些預(yù)測(cè)結(jié)果表明，GA 在乳腺癌、肝癌、非小細(xì)胞肺癌、腸癌等多種腫瘤中具有抑制活性和治療作用。

表1 甘草酸反向?qū)咏Y(jié)果單位：%

圖2 GA-靶蛋白-腫瘤的網(wǎng)絡(luò)

2.2 腫瘤相關(guān)靶蛋白的GO、KEGG 富集分析

使用DAVID 數(shù)據(jù)庫對(duì)GA 的56 個(gè)抗腫瘤靶蛋白進(jìn)行GO、KEGG 富集分析。如圖3（A）所示，GO 富集結(jié)果顯示，positive regulation of angiogenesis （正調(diào)控血管生成）、transmembrane receptor protein tyrosine kinase activity（蛋白酪氨酸激酶活性）、vascular endothelial growth factor-activated receptor activity（血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子激活受體活性）、positive regulation of ERK1 and ERK2 cascade（ERK1 和ERK2 級(jí)聯(lián)正向調(diào)節(jié)）等與GA 的關(guān)聯(lián)度較高、P 值較低。 KEGG 富集分析發(fā)現(xiàn)，GA 的腫瘤靶蛋白富集于PI3K/AKT、HIF-1、JAK/STAT 等通路（如圖3（B）所示）。此外，筆者發(fā)現(xiàn)GA 也與EGFR 抑制劑耐藥存在關(guān)聯(lián)。上述結(jié)果表明，GA 可能通過作用于多靶點(diǎn)、調(diào)控多通路發(fā)揮抗腫瘤作用。

圖3 GA 潛在抗腫瘤靶蛋白的GO 和KEGG 通路富集分析

2.3 腫瘤相關(guān)靶蛋白的PPI 分析

將經(jīng)CTD 數(shù)據(jù)庫篩選后的GA 潛在抗腫瘤靶蛋白輸入STRING 數(shù)據(jù)庫， 得到GA 潛在靶蛋白之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)，使用Cytoscape 軟件，根據(jù)“degree”進(jìn)行進(jìn)行PPI 網(wǎng)絡(luò)繪制和優(yōu)化。 該網(wǎng)絡(luò)中含有53 個(gè)蛋白（GPR55、HSD17810、CNR2 等3 個(gè)蛋白與其他蛋白未發(fā)生互作，故未在該網(wǎng)絡(luò)中顯示），159 條邊；節(jié)點(diǎn)中字體的大小代表“degree”的大小。 因此，由圖4 可知，HSP90AA1、mTOR、PI3KR1、STAT3 等蛋白在該網(wǎng)絡(luò)中占據(jù)重要地址，表明這些蛋白可能是GA 的抗腫瘤關(guān)鍵蛋白。

圖4 GA 抗腫瘤靶蛋白的蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

2.4 GA 與HSP90AA1、mTOR、PI3KR1、STAT3 等靶蛋白的分子對(duì)接驗(yàn)證分析

為進(jìn)一步驗(yàn)證HSP90AA1、mTOR、PI3KR1、STAT3 等靶蛋白是否為GA 的潛在抗腫瘤關(guān)鍵蛋白， 使用iGEMDOCK 分子對(duì)接軟件進(jìn)行對(duì)接分析。對(duì)接結(jié)果顯示，GA 與HSP90AA1、mTOR、PI3KR1、STAT3 等靶蛋白的結(jié)合能分別為：-98.2、-111.7、-132.9、-135.9 kcal·mol-1。

如圖5 所示，GA 與HSP90AA1 活性口袋中的ASN51、ILE96、GLY97、ASN105、GLY108 等位點(diǎn)產(chǎn)生氫鍵或范德華力結(jié)合；GA 與PI3KR1 的ARG770、GLU798、ARG852、ASP933 等位點(diǎn)產(chǎn)生結(jié)合， 這些位點(diǎn)處于PI3KR1 的功能域之中；GA 與mTOR 的磷酸化活性區(qū)域中的ILE2163、LYS2171、VAL2183、TRP2239、PHE2184 等氨基酸產(chǎn)生作用；GA 與STAT3 的SH2 區(qū)域產(chǎn)生結(jié)合， 結(jié)合位點(diǎn)為L(zhǎng)YS591、SER611、GLU612、SER613、THR620 等。 這些結(jié)果說明GA 與HSP90AA1、mTOR、PI3KR1、STAT3 等有很好的結(jié)合，且對(duì)接結(jié)果與反向?qū)宇A(yù)測(cè)相一致。

圖5 GA 與潛在抗腫瘤靶蛋白的分子對(duì)接驗(yàn)證

3 討論

近年來，GA 的抗腫瘤活性和作用機(jī)制不斷被發(fā)現(xiàn)。Wang 等人發(fā)現(xiàn)GA 在結(jié)腸癌細(xì)胞中可有效抑制細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[8]。 Tsai 等在肝癌體內(nèi)外研究中證實(shí)GA 通過抑制PKB 誘導(dǎo)凋亡[6]。 上述研究顯示了GA 在抗腫瘤治療中的潛在應(yīng)用價(jià)值，但其作用機(jī)制和潛在作用靶蛋白仍有待深入。 由此，文中通過網(wǎng)絡(luò)藥理和分子對(duì)接驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，HSP90AA1、MTOR、PI3KR1、STAT3 等可能是GA 抗腫瘤的關(guān)鍵靶蛋白。

HSP90AA1 是熱激蛋白（Heat shock protein，HSP）家族的重要成員之一，其在諸如肺癌、乳腺癌等多種腫瘤中存在高表達(dá)，是腫瘤檢測(cè)和治療的重要靶點(diǎn)之一[9-10]。 Xiao 等在骨肉瘤細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)HSP90AA1 不僅能夠調(diào)控細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，還參與調(diào)控細(xì)胞自噬以及化療耐藥等過程[11]。 HSP90AA1 在腫瘤細(xì)胞中的調(diào)控作用依賴于下游HIF-1α、AKT 和ERK 等信號(hào)通路[12-13]。 結(jié)合KEGG、GO 富集結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)GA 可能通過靶向HSP90AA1 調(diào)控PI3K/AKT、HIF-1α、ERK 等通路實(shí)現(xiàn)抗腫瘤作用。

I3KR1 是磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）的調(diào)節(jié)亞基p85α，當(dāng)上游因子與p85α 結(jié)合后，將進(jìn)一步激活PI3K的磷酸化。 Zhang 等人在胃癌中證實(shí)miR486-5p 通過負(fù)調(diào)控PI3KR1 抑制PI3K 磷酸化及其下游因子AKT[14]。 Lin 等研究發(fā)現(xiàn)PI3KR1 在三陰性乳腺癌中存在著高表達(dá)，且與AKT3 的磷酸化存在著密切相關(guān)性[15]。 GA 的相關(guān)藥理研究顯示，其可通過抑制PI3K/AKT 通路實(shí)現(xiàn)抗炎和抗腫瘤作用[16]。 故，PI3KR1 可能是GA 抗腫瘤作用靶蛋白之一。

哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin，mTOR），屬非典型高保守絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶， 具有調(diào)控細(xì)胞的增殖、 生長(zhǎng)、 自噬等作用。 在哺乳動(dòng)物中，mTOR 主要有兩種存在形式：mTORC1 和mTORC2，但mTOR 的大部分功能來自于mTORC1。當(dāng)上游因子AKT 活化后，磷酸化TSC2 使TSC1-TSC2 復(fù)合物解離，從而激活mTORC1，進(jìn)而磷酸化真核翻譯起始因子4E 結(jié)合蛋白1（4EBP1）、S6 激酶（S6K） 和固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（SREBP），以促進(jìn)蛋白質(zhì)翻譯，并抑制自噬過程。此外，Son 等還發(fā)現(xiàn)mTORC1 的酰基化也能調(diào)控自噬過程[17]。 因此，mTOR 成為抗腫瘤藥物篩選的重要靶點(diǎn)之一。 Wang 等發(fā)現(xiàn)二甲雙胍通過抑制mTORC1 和mTORC2 雙通路實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)自噬和細(xì)胞周期阻滯[18]。Allen 通過計(jì)算機(jī)高通量篩選發(fā)現(xiàn)桂利嗪和氫化嗪類化合物是mTORC1 的潛在抑制劑[19]。 研究結(jié)果表明，GA 能與mTORC1 產(chǎn)生結(jié)合，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤作用。

信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3），位于人17 號(hào)染色體q21.2，由約750～850 個(gè)氨基酸組成，包含：DNA 結(jié)合域（DBD）、SH2 結(jié)構(gòu)域、羧基端轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域等功能結(jié)構(gòu)域。 臨床病理研究顯示，其在多種惡性腫瘤中存在高表達(dá)、高活性。 因此，STAT3 被認(rèn)為是腫瘤診療、發(fā)病機(jī)制、治療藥物開發(fā)等領(lǐng)域的重要因子之一[20]。 針對(duì)STAT3 抑制劑的開發(fā)和找尋主要集中于上游信號(hào)因子的阻斷，或直接針對(duì)性抑制其SH2、DBD 等功能域或抑制其的表達(dá)等方面。 紅景天苷被證明通過與STAT3的DBD 結(jié)合，從而阻斷STAT3 與Nanog、MMP2 等基因的啟動(dòng)子的結(jié)合而發(fā)揮其抗三陰性乳腺癌的活性[21]。此外，抑制STAT3 的乙?；渤蔀镾TAT3 抑制劑開發(fā)的新思路。 如，一種新合成的咔唑——SH-I-14，通過抑制STAT3 乙酰化，破壞DNMT1-STAT3 相互作用，導(dǎo)致DNA 去甲基化和腫瘤抑制基因的重新表達(dá)[22]。 分子對(duì)接結(jié)果顯示，GA 可能是STAT3 的潛在抑制劑，其與STAT3 的SH2 區(qū)域產(chǎn)生結(jié)合，進(jìn)而抑制STAT3 磷酸化。

4 結(jié)語

論文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)相關(guān)方法深入分析了GA 抗腫瘤的潛在作用機(jī)制和作用靶蛋白， 結(jié)果表明GA 可作為治療多種實(shí)體腫瘤的潛在藥物。該研究為GA 的藥理研究、臨床應(yīng)用提供了重要的理論參考，也為以GA為先導(dǎo)物的靶向抗腫瘤藥物的開發(fā)提供了一定的技術(shù)支撐。