張婷婷，佟廣香，孫志鵬，閆 婷，唐國(guó)盤(pán)，周慧杰，6，匡友誼

(1.上海海洋大學(xué) 水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，哈爾濱 150070；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)生物技術(shù)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150070；4.淡水魚(yú)類(lèi)育種國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱 150070；5.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，鄭州 450046；6.天津農(nóng)學(xué)院，天津 300000)

金魚(yú)(Carassiusauratus)是我國(guó)主要養(yǎng)殖的觀賞魚(yú)種類(lèi)之一，蛋種金魚(yú)因其背鰭缺失而深受人們喜愛(ài)[1、2]。在研究背鰭缺失的分子機(jī)制中發(fā)現(xiàn)，eomesa(eomesodermina)是調(diào)控背鰭發(fā)育的關(guān)鍵基因。如DU等[3]通過(guò)TILLING(Targeting induced local lesions in genomes)技術(shù)構(gòu)建斑馬魚(yú)(Daniorerio)eomesafh105突變體，該突變將第100位酪氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)榻K止密碼子使eomesa功能異常，并使eomesafh105純合突變體缺失背鰭[4]；宋詩(shī)穎[5]利用CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat)技術(shù)獲得了甌江彩鯉(Cyprinuscarpiovar.color)背鰭缺失突變系。以上研究說(shuō)明可利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)敲除eomesa進(jìn)行背鰭缺失型金魚(yú)、錦鯉等觀賞魚(yú)的培育，但也有一些研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)eomesa的突變可致使雌魚(yú)生殖障礙，阻礙了利用此基因開(kāi)展背鰭缺失觀賞魚(yú)新品種的培育[6-8]。

eomesa基因?qū)儆谥匾霓D(zhuǎn)錄因子T-box基因家族成員，廣泛存在于各種生物中[9]。eomesa是目前斑馬魚(yú)中發(fā)現(xiàn)的唯一一個(gè)母源T-box因子，主要在中內(nèi)胚層的前體細(xì)胞中表達(dá)[8]。eomesa在斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育的多個(gè)過(guò)程中起關(guān)鍵作用，尤其是在中內(nèi)胚層的形成中起著決定性作用，并影響斑馬魚(yú)胚胎的外包運(yùn)動(dòng)[6]；eomesa在早期囊胚中抑制外胚層基因表達(dá)，在胚盾期eomesa過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)中胚層標(biāo)記基因gsc(goosecoid)、chd(coronaryheartdisease)和flh(floatinghead)的異位表達(dá)[8]，與mixer(mixfamily)、foxh1(forkheadboxh1)一起介導(dǎo)Nodal信號(hào)，進(jìn)而影響中內(nèi)胚層的發(fā)育[10]。但關(guān)于eomesa在生殖中的作用鮮有報(bào)道，霍錦倩等[11]通過(guò)qPCR(Quantitative real-time PCR)分析表明eomesa基因在斑馬魚(yú)的卵巢中高表達(dá)，說(shuō)明eomesa也可能在性腺發(fā)育中起到調(diào)控作用。

母源因子eomesa在斑馬魚(yú)早期發(fā)育中起著關(guān)鍵的調(diào)控作用，其功能缺失導(dǎo)致雌魚(yú)生殖障礙，并使斑馬魚(yú)背鰭缺失，但其機(jī)制仍未知。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建eomesa功能缺失突變系，進(jìn)一步通過(guò)表型測(cè)定、繁殖行為觀察、卵巢組織學(xué)比較分析，以及性腺發(fā)育相關(guān)基因的qRT-PCR分析，以期探討eomesa對(duì)斑馬魚(yú)雌魚(yú)生殖的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用魚(yú)

本研究所用的AB品系斑馬魚(yú)購(gòu)買(mǎi)自國(guó)家斑馬魚(yú)資源中心，飼養(yǎng)于中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所斑馬魚(yú)養(yǎng)殖中心，飼養(yǎng)條件為28.5 ℃，每天投喂2次豐年蟲(chóng)。斑馬魚(yú)受精卵于28.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，受精后4～5 d可平游后轉(zhuǎn)移至10 L養(yǎng)殖缸中養(yǎng)殖，投喂草履蟲(chóng)，15 dpf(days post fertilization，dpf)轉(zhuǎn)入循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中養(yǎng)殖，投喂豐年蟲(chóng)。

1.2 eomesa-/-純合系構(gòu)建

根據(jù)曹頂臣等[12]和唐國(guó)盤(pán)等[13]描述的方法構(gòu)建eomesa敲除純合系(eomesa-/-)，簡(jiǎn)要描述如下：利用CHOPCHOP(http：//chopchop.cbu.uib.no)在1號(hào)外顯子處設(shè)計(jì)基因敲除靶位點(diǎn)(GGTTCGGTTCTTCCACCCGCCGG)，采用HiScribeTMT7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit(NEB E2050s，MA，USA)試劑盒體外合成sgRNA，將sgRNA與Cas9蛋白(NEB M0646M，MA，USA)按終濃度為5 pmol/μL混合后，顯微注射至單細(xì)胞斑馬魚(yú)胚胎中。利用唐國(guó)盤(pán)等[13]描述的PCR產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠電泳方法檢測(cè)突變體，檢測(cè)引物為eomesa-F：ATCTGGGCACTGATCGATACTT，eomesa-R：AACTGATAACCACCCCCAAAC。對(duì)突變體的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，確定突變體基因型。因eomesa-/-突變體無(wú)法自然繁殖，采用人工授精方式構(gòu)建eomesa-/-純合系。

1.3 突變體表型觀察

隨機(jī)選擇60 dpf野生型和eomesa-/-突變體斑馬魚(yú)進(jìn)行表型觀察和骨骼染色。參照楊建等[14]的方法對(duì)骨骼進(jìn)行茜素紅染色。隨機(jī)選取健康成魚(yú)，經(jīng)麻醉劑安樂(lè)死后，在解剖鏡下分離并觀察卵巢、輸卵管，用Zessis SteREO Discovery V8體視顯微鏡進(jìn)行觀察、拍照。

1.4 卵巢組織學(xué)分析

隨機(jī)選擇60、90 dpf野生型和無(wú)背鰭eomesa-/-突變體斑馬魚(yú)各3尾，在解剖鏡下分離卵巢組織，采用波恩試液固定24～48 h，經(jīng)酒精梯度脫水和二甲苯透明后，進(jìn)行石蠟包埋。利用MICROM HM200石蠟切片機(jī)以厚度為6 μm進(jìn)行切片。切片經(jīng)蘇木精-伊紅染色后在OLYMPUS BX53生物顯微鏡下觀察、拍照。

1.5 繁殖行為觀察及繁殖性能測(cè)定

隨機(jī)選擇養(yǎng)殖3個(gè)月后達(dá)到性成熟的野生型和無(wú)背鰭表型eomesa-/-突變體斑馬魚(yú)，取野生型、eomesa-/-的雄魚(yú)分別與野生型、eomesa-/-雌魚(yú)按雌雄比為1∶1的比例放入產(chǎn)卵盒，在產(chǎn)卵盒中用透明隔板隔開(kāi)雌雄魚(yú)。次日光照后，去除擋板，觀察其繁殖行為，交配后記錄產(chǎn)卵量。

采用人工授精方法按雌雄比為1∶1的比例構(gòu)建無(wú)背鰭表型突變體自交和野生型自交家系，人工授精參照胥鵬飛[6]描述的方法進(jìn)行。受精卵置于28.5 ℃培養(yǎng)箱中孵化，孵化過(guò)程中統(tǒng)計(jì)并計(jì)算產(chǎn)卵量、受精卵數(shù)、孵化率和仔魚(yú)畸形率。實(shí)驗(yàn)家系每周繁殖一次，分4周完成試驗(yàn)，其中初產(chǎn)家系和孵化過(guò)程中因水霉等原因受精卵死亡超過(guò)10%的家系不計(jì)入統(tǒng)計(jì)結(jié)果。按照KIMMEL等[15]的標(biāo)準(zhǔn)確定統(tǒng)計(jì)斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育時(shí)期，實(shí)驗(yàn)家系飼喂至成魚(yú)，統(tǒng)計(jì)雌雄比例。

1.6 eomesa-/-突變體卵巢基因表達(dá)分析

隨機(jī)選擇45、60、90 dpf 3個(gè)生長(zhǎng)階段的野生型和無(wú)背鰭表型突變體斑馬魚(yú)各5尾采集卵巢組織，以及采集5組12 hpf(hours past fertilization)胚胎期(體節(jié)期，PGCs在此時(shí)期遷移至生殖嵴[16])的胚胎，每組10枚受精卵，用于性腺發(fā)育相關(guān)基因的qRT-PCR分析。采用Trizol(Life Teachnologies，USA)提取總RNA，使用PrimeScriptTM RT reagent Kit with gRNA Eraser(Takara，USA)合成cDNA。用SYBR Green法檢測(cè)cyp17a1、amh、dnd1、vasa、nanos3和dmrt1這6個(gè)性腺發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)水平，擴(kuò)增引物采用Primer3 plus設(shè)計(jì)(表1)，以actb1為內(nèi)參。采用10 μL反應(yīng)體系進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，包括：5 μL 2×Luna Universal qPCR Master Mix(NEB，MA，USA)，0.5 μL 10 ρmol/μL的正向、反向引物，2 μL 50 ng/μL cDNA，2 μL nuclease-free水。qRT-PCR于QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR(Thermo Fisher，CA，USA)系統(tǒng)中進(jìn)行擴(kuò)增，程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性20 s；之后，95 ℃變性10 s，60 ℃延伸20 s，循環(huán)40次。

表1 性腺發(fā)育相關(guān)基因qRT-PCR引物序列Tab.1 Primer sequences of gonadal development-related genes for qRT-PCR

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用2-ΔΔCt法[17]評(píng)估野生型和突變體樣本在胚胎發(fā)育和胚后發(fā)育各時(shí)期中性腺發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)量，使用SPSS軟件進(jìn)行T檢驗(yàn)(Student′s T-test)分析基因表達(dá)量、繁殖性能相關(guān)指標(biāo)在野生型和突變體中的顯著差異，采用卡方檢驗(yàn)分析雌雄性比在野生型和突變體中的差異，當(dāng)P<0.05表示差異顯著。使用GraphPad Prism 8軟件繪制斑馬魚(yú)繁殖性能相關(guān)指標(biāo)以及基因表達(dá)量分布圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 eomesa-/-純合系構(gòu)建

采用CRISPR/Cas9對(duì)eomesa的第1外顯子進(jìn)行敲除(圖1a)，構(gòu)建了eomesa-/-純合系，通過(guò)Sanger測(cè)序的序列分析發(fā)現(xiàn)eomesa-/-突變體在靶位點(diǎn)處缺失5 bp，并顛換2 bp(圖1b)。根據(jù)DNA序列推斷的氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，eomesa-/-突變體在第157位氨基酸處發(fā)生移碼，并在第203位氨基酸處出現(xiàn)終止密碼子(圖1c，紅色框所示)。

圖1 eomesa敲除示意圖Fig.1 Schematic diagram of eomesa knockoutwt：野生型；mut：eomesa-/-突變體。a：eomesa結(jié)構(gòu)示意圖；b：eomesa-/-突變體堿基序列比對(duì)，紅色框?yàn)閟gRNA靶位點(diǎn)，PAM序列為CGG(343～345處)；c：eomesa-/-突變體氨基酸序列比對(duì)，紅色框中X為終止密碼子。

2.2 eomesa-/-突變體骨骼表型觀察

外形和骨骼染色觀察發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于野生型(圖2 a～c)，eomesa-/-突變體骨骼具有兩種表型，即背鰭缺失表型(mut1，圖2d～f)，以及背鰭和臀鰭同時(shí)缺失表型(mut2，圖2g～i)。茜素紅染色發(fā)現(xiàn)，mut1除缺失背鰭鰭條外，其支鰭骨也嚴(yán)重缺失(圖2e～f)；mut2的背鰭鰭條和支鰭骨全部缺失(圖2h)，但保留了少部分臀鰭支鰭骨(圖2i)。以上說(shuō)明，敲除eomesa后導(dǎo)致了背鰭和臀鰭支鰭骨和鰭條的發(fā)育異常。

圖2 60 dpf eomesa-/-突變體和野生型斑馬魚(yú)外形及骨骼染色觀察Fig.2 Observation of body shape and skeleton staining of 60 dpf eomesa-/- mutants and wild-type D.rerio(a～c)：野生型斑馬魚(yú)；(d～f)：突變體1，無(wú)背鰭；(g～i)：突變體2，無(wú)背鰭及無(wú)臀鰭；黑色箭頭：支鰭骨。

2.3 eomesa-/-突變體繁殖能力分析

野生型與eomesa-/-突變體自然交配的繁殖情況分析發(fā)現(xiàn)，eomesa-/-雄魚(yú)能正常繁殖，與野生型雌魚(yú)自然交配的受精卵數(shù)量為(152±50)枚，與野生型雌、雄自然交配的受精卵數(shù)量無(wú)顯著性差異。但eomesa-/-雌魚(yú)不能與eomesa-/-雄魚(yú)和野生型雄魚(yú)自然繁殖(表2)。繁殖行為學(xué)觀察表明，雖然eomesa-/-雌魚(yú)有正常的求偶行為，但不能自然排卵，說(shuō)明eomesa的敲除未影響雄魚(yú)的生殖能力，但可能通過(guò)影響卵巢的發(fā)育或排卵，從而影響雌魚(yú)的生殖。

表2 突變體1與野生型斑馬魚(yú)自然交配繁殖數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Tab.2 Summary of the natural spawn of eomesa-/- mutants 1 and wild-type D.rerio

為分析eomesa功能異常是否影響卵子的發(fā)育，對(duì)eomesa-/-突變體進(jìn)行了人工繁殖實(shí)驗(yàn)。研究表明，eomesa-/-雌魚(yú)可通過(guò)人工授精方式進(jìn)行繁殖，其子代發(fā)育正常。對(duì)通過(guò)人工授精構(gòu)建的eomesa-/-家系(n=10)和野生型家系(n=12)的繁殖性能分析發(fā)現(xiàn)，野生型家系的受精率、孵化率及畸形率分別為73.5%、78.6%和9.9%，突變體家系的受精率、孵化率及畸形率分別為70.8%、70.3%和47.9%；與野生型家系相比，突變體家系中受精率和孵化率無(wú)明顯差異，但突變體家系中胚胎的畸形率顯著高于野生型家系(表3，圖3)。胚胎發(fā)育觀察發(fā)現(xiàn)，8 hpf野生型胚胎發(fā)育至70%外包期(圖4a)，而突變體胚胎發(fā)育至胚盾期(圖4e)，由此可得eomesa-/-突變體的胚胎從原腸胚盾期開(kāi)始發(fā)育延遲；eomesa-/-突變體胚胎在22 hpf時(shí)出現(xiàn)畸形表型，胚胎卵黃異常膨大(圖4b～c，f～g)；孵化后，突變體幼魚(yú)出現(xiàn)明顯卵黃囊膨大、脊柱彎曲、心囊水腫的現(xiàn)象(圖4d，圖4h)。以上說(shuō)明，敲除eomesa基因后，雖然可通過(guò)人工授精方式進(jìn)行繁殖，但其導(dǎo)致了胚胎發(fā)育異常，從而使畸形率顯著升高。

圖3 野生型與eomesa-/-突變體1斑馬魚(yú)受精率、孵化率、畸形率的比較Fig.3 Comparison of fertilization rate，hatching rate and deformity rate between wild-type and eomesa-/- mutants 1 D.rerio采用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示野生型和eomesa-/-突變體1斑馬魚(yú)的受精率、孵化率和仔魚(yú)畸形率。***：(P<0.001)；ns：無(wú)顯著差異。

圖4 野生型與eomesa-/-突變體1斑馬魚(yú)胚胎及幼魚(yú)發(fā)育觀察Fig.4 Developmental observation of embryos and larvae of wild-type and eomesa-/- mutants 1 D.rerio embryos and larvae(a～c)：野生型胚胎；d：野生型幼魚(yú)；(e～g)：eomesa-/-突變體1胚胎；h：eomesa-/-突變體1幼魚(yú)；Pe：心囊水腫；Yse：卵黃囊水腫；Sd：脊柱彎曲。

對(duì)人工授精的eomesa-/-突變體與野生型家系雌雄個(gè)體統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，野生型雌雄比約為1∶1，與野生型相比突變體1中雌雄比約為1∶3，雌魚(yú)比例明顯更低，eomesa-/-突變體斑馬魚(yú)的雄魚(yú)數(shù)量顯著增加(表4，圖5)，說(shuō)明eomesa功能異常除影響雌魚(yú)的生殖外，也影響了雌雄的性別分化。

表4 野生型和eomesa-/-突變體1斑馬魚(yú)家系雌雄數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)Tab.4 Summary of male and female in wild-type and eomesa-/- mutants 1 families

2.4 斑馬魚(yú)卵巢組織學(xué)分析

雖然可通過(guò)人工授精方式使eomesa-/-突變體進(jìn)行繁殖，但其eomesa敲除是否影響卵子的發(fā)育仍未知。斑馬魚(yú)卵巢組織切片觀察發(fā)現(xiàn)，60 dpf野生型的卵母細(xì)胞處于卵黃發(fā)生中期向成熟卵母細(xì)胞過(guò)渡的階段(圖6a～b)，而eomesa-/-的卵巢發(fā)育處于初級(jí)生長(zhǎng)期向卵黃發(fā)生中期過(guò)渡的階段(圖6c～d)，與野生型相比eomesa-/-突變體的卵母細(xì)胞發(fā)育在卵黃發(fā)生中期明顯滯后。90 dpf野生型斑馬魚(yú)已經(jīng)性成熟，此時(shí)卵母細(xì)胞已經(jīng)進(jìn)入成熟期，卵黃顆粒充滿(mǎn)卵母細(xì)胞(圖6e～f)，而eomesa-/-突變體的卵母細(xì)胞發(fā)育略有滯后，其內(nèi)部的卵黃顆粒數(shù)目明顯少于野生型斑馬魚(yú)卵母細(xì)胞中的卵黃顆粒數(shù)目(圖6g～h)。

進(jìn)一步的解剖觀察發(fā)現(xiàn)eomesa-/-突變體輸卵管與野生型相比無(wú)明顯差異，并未發(fā)現(xiàn)輸卵管堵塞缺失現(xiàn)象(圖7)，結(jié)合上述的人工授精實(shí)驗(yàn)表明eomesa功能異常可能通過(guò)影響斑馬魚(yú)的排卵機(jī)制，使其不能自然排卵。

圖7 eomesa-/-突變體1與野生型斑馬魚(yú)輸卵管的觀察Fig.7 Observation of oviducts in eomesa-/- mutants 1 and wild-type D.rerioa：野生型；b：突變體；紅色框：卵巢；紅箭頭：輸卵管。

2.5 性腺發(fā)育相關(guān)基因在胚胎發(fā)育階段和卵巢組織中的表達(dá)

3個(gè)原始生殖細(xì)胞發(fā)育標(biāo)志基因(dnd1、vasa、nanos3)在斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育體節(jié)期(12 hpf)及3個(gè)卵巢發(fā)育階段(45、60、90 dpf)的表達(dá)量如圖8所示。結(jié)果表明：12 hpf時(shí)，dnd1和nanos3在突變體胚胎中的表達(dá)量顯著低于其在野生型胚胎中的表達(dá)量，而突變體胚胎中vasa基因的表達(dá)量則顯著高于其在野生型胚胎中的表達(dá)量。在45 dpf時(shí)期，dnd1、vasa和nanos3在突變體卵巢中的表達(dá)量顯著高于其在野生型卵巢中的表達(dá)量；在60 dpf和90 dpf階段，dnd1和vasa在突變體卵巢中的表達(dá)量與其在野生型卵巢中的表達(dá)量無(wú)顯著性差異；nanos3在60 dpf突變體與野生型卵巢中的表達(dá)量無(wú)顯著性差異，但90 dpf時(shí)其在突變體卵巢中的表達(dá)量顯著高于其在野生型卵巢中的表達(dá)量。

圖8 3個(gè)原始生殖細(xì)胞標(biāo)志基因在eomesa-/-突變體1和野生型斑馬魚(yú)胚胎及4個(gè)發(fā)育階段的表達(dá)量Fig.8 Expressed levels of three marker genes of PGCs in eomesa-/- mutants 1 and wild-type D.rerio embryos and four developmental stages′ ovaries采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示基因的表達(dá)水平。**：P<0.01；***：P<0.001；****：P<0.000 1；ns：無(wú)顯著差異。

3個(gè)性腺發(fā)育基因(cyp17a1、amh、dmrt1)在斑馬魚(yú)胚胎發(fā)育體節(jié)期(12 hpf)及三個(gè)卵巢發(fā)育階段(45、60、90 dpf)的表達(dá)量如圖9所示。結(jié)果表明：在體節(jié)期中，cyp17a1在突變體中的表達(dá)量顯著低于其野生型中的表達(dá)量，而amh和dmrt1的表達(dá)量則相反，其在突變體中的表達(dá)量顯著高于其在野生型中的表達(dá)量。在45 dpf和60 dpf時(shí)，突變體卵巢中cyp17a1基因的表達(dá)量顯著高于其在野生型卵巢中的表達(dá)量，而amh在45 dpf突變體中的表達(dá)量顯著低于野生型中的表達(dá)量，在60 dpf突變體的表達(dá)量顯著高于野生型中的表達(dá)量。在90 dpf時(shí)，突變體卵巢中dmrt1的表達(dá)量顯著高于其在野生型卵巢中的表達(dá)量，而cyp17a1、amh的表達(dá)量則相反。根據(jù)以上結(jié)果得知，cyp17a1和amh在不同發(fā)育時(shí)期野生型和突變體中的表達(dá)量均體現(xiàn)出顯著性差異。

圖9 3個(gè)性腺發(fā)育基因在eomesa-/-突變體1和野生型斑馬魚(yú)4個(gè)發(fā)育階段的表達(dá)Fig.9 Expression of three gonadal developmental genes in eomesa-/- mutant 1 and wild-type D.rerio at four developmental stages采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示野生型和突變體斑馬魚(yú)3個(gè)性腺發(fā)育特異性基因表達(dá)水平。*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001；****：P<0.000 1；ns：無(wú)顯著差異。

3 討論

對(duì)斑馬魚(yú)[3-6]、金魚(yú)(Carassiusauratus)[18]和甌江彩鯉[5]等魚(yú)類(lèi)的研究發(fā)現(xiàn)，T-box家族的eomesa基因在奇鰭發(fā)育中扮演著重要角色。前期研究[7]和本研究均發(fā)現(xiàn)eomesa的功能缺失導(dǎo)致了斑馬魚(yú)背鰭和臀鰭的缺失，但純合突變體雌魚(yú)無(wú)法繁殖，阻礙了利用eomesa基因在無(wú)背鰭金魚(yú)育種中的應(yīng)用。目前，eomesa基因調(diào)控斑馬魚(yú)繁殖的機(jī)制未知，本研究在構(gòu)建eomesa-/-純合系的基礎(chǔ)上，通過(guò)繁殖行為觀察、繁殖性能測(cè)定、卵巢形態(tài)結(jié)構(gòu)分析和基因表達(dá)等方面探討了eomesa功能缺失對(duì)斑馬魚(yú)雌魚(yú)生殖的影響。研究表明，eomesa-/-雄魚(yú)可自然繁殖，但雌魚(yú)不能自然繁殖；繁殖行為觀察表明雌魚(yú)雖然可進(jìn)行求偶配對(duì)行為，但不能排卵。進(jìn)一步研究表明eomesa-/-雌魚(yú)可通過(guò)人工授精方式獲得正常發(fā)育的后代，并且后代可以達(dá)到性成熟，這與以前的研究一致[6-8]。解剖觀察發(fā)現(xiàn)eomesa-/-雌魚(yú)的卵巢和輸卵管形態(tài)正常，組織切片的分析表明eomesa基因的敲除不影響卵子的成熟，但使卵母細(xì)胞的發(fā)育滯后。由此推斷，eomesa應(yīng)在卵母細(xì)胞發(fā)育和排卵機(jī)制兩方面影響斑馬魚(yú)的繁殖，但主要通過(guò)影響排卵機(jī)制導(dǎo)致雌魚(yú)無(wú)法自然排卵。

魚(yú)類(lèi)的生殖排卵是多因素影響的復(fù)雜過(guò)程，包括性腺發(fā)育以及生殖系統(tǒng)與神經(jīng)系統(tǒng)的協(xié)調(diào)[19]。性腺由生殖細(xì)胞和周?chē)捏w細(xì)胞組成，生殖細(xì)胞主要負(fù)責(zé)產(chǎn)生配子將遺傳信息傳遞給子代，而性腺體細(xì)胞主要負(fù)責(zé)維持生殖細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育以及第二性征[20]。生殖細(xì)胞在胚胎早期由原始生殖細(xì)胞(PGC)發(fā)育而來(lái)，PGC進(jìn)行不對(duì)稱(chēng)分裂形成體細(xì)胞和PGCs[21]。在早期胚胎發(fā)育過(guò)程中，PGCs向生殖脊定向遷移，并與周?chē)捏w細(xì)胞衍生細(xì)胞一起發(fā)育成性腺[22、23]。那么eomesa的功能缺失是否可通過(guò)擾亂內(nèi)胚層的分化影響PGCs的發(fā)育和遷移，進(jìn)而影響雌魚(yú)的性腺發(fā)育呢？

為深入研究eomesa基因功能缺失對(duì)雌魚(yú)生殖的影響，本研究分析了6個(gè)性腺發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)量，包括3個(gè)PGC標(biāo)志基因和3個(gè)性腺發(fā)育相關(guān)基因。研究表明，eomesa功能缺失顯著性影響了dnd1、vasa和nanos3的表達(dá)。dnd1[24]、vasa[25]、nanos3[26]這些母源mRNA定位于生殖脊中，并且隨著胚胎發(fā)育被整合進(jìn)入體細(xì)胞和PGCs。在斑馬魚(yú)中，nanos3基因并不是原始生殖細(xì)胞形成所必需的，但缺少該基因，PGCs就不能夠正常遷移至生殖脊中，而過(guò)早地分化、凋亡[26]。dnd1是PGC細(xì)胞遷移的關(guān)鍵基因，缺失dnd1會(huì)導(dǎo)致原始生殖細(xì)胞的遷移受阻，并使PGC過(guò)早地分化、凋亡，但體細(xì)胞發(fā)育不受影響[27]。在斑馬魚(yú)中vasa基因是公認(rèn)的PGCs和生殖細(xì)胞的理想標(biāo)記，可以追蹤PGCs在胚胎發(fā)育過(guò)程中的遷移，揭示成熟卵母細(xì)胞的生殖脊位置和胚胎發(fā)育過(guò)程中PGCs的分布[25]。以上說(shuō)明dnd1、nanos3對(duì)原始生殖細(xì)胞的生存和遷移具有重要的調(diào)節(jié)作用，本研究表明，eomesa基因功能缺失導(dǎo)致了dnd1和nanos3在體節(jié)期(12 hpf)的mRNA水平降低(P<0.01)，可能阻礙PGCs遷移至生殖脊，進(jìn)而使卵母細(xì)胞的發(fā)育受到影響，造成卵巢發(fā)育遲緩。

性腺發(fā)育相關(guān)基因是動(dòng)物卵巢產(chǎn)生及生長(zhǎng)、發(fā)育的重要原因，例如cyp17a1、amh和dmrt1等基因共同調(diào)節(jié)卵巢的正常形成和功能。細(xì)胞色素cyp17或p450c17作為性腺類(lèi)固醇激素、孕激素及糖皮質(zhì)激素生物合成的關(guān)鍵限速酶，其在調(diào)控性腺發(fā)育、生殖細(xì)胞分化及維持第二性征等方面起到重要的作用[28]。ZHAI等[29]敲除斑馬魚(yú)cyp17a1基因后，導(dǎo)致雌性向雄性逆轉(zhuǎn)，雄性的交配行為和第二性征缺失。amh，又稱(chēng)繆勒氏管抑制物，是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)家族成員[30]，在雄性和雌性生殖細(xì)胞增殖和分化中起到重要作用[31]。在硬骨魚(yú)類(lèi)中，dmrt1在性腺中的表達(dá)量要高于其他組織，并且在很多物種的性腺中發(fā)現(xiàn)dmrt1的表達(dá)呈性別二態(tài)性，表現(xiàn)為雄性特異性或顯著的雄性偏向性[32]。林橋洪[33]研究表明，在斑馬魚(yú)中dmrt1缺失會(huì)導(dǎo)致雄性到雌性的部分性逆轉(zhuǎn)。以上研究表明amh和dmrt1對(duì)于斑馬魚(yú)正常的性別分化是必不可少的；并協(xié)同調(diào)控雄性生殖細(xì)胞的自我更新、增殖和分化，保證正常的精巢發(fā)育及精子形成[33]。此外，斑馬魚(yú)的性腺發(fā)育及分化比較特殊，在早期階段全部發(fā)育成“類(lèi)卵巢”結(jié)構(gòu)，可稱(chēng)為雌雄同體時(shí)期；在受精后的第40 ～ 50天性腺開(kāi)始分化；當(dāng)發(fā)育至60天時(shí)分化結(jié)束，卵巢和精巢形成[34]。本研究表明eomesa功能缺失顯著干擾了cyp17a1、amh和dmrt1的表達(dá)量，在性腺分化時(shí)期，amh基因表達(dá)量升高，而cyp17a1表達(dá)量降低，這可能是導(dǎo)致本研究中eomesa-/-突變體中雄魚(yú)顯著增加的原因。性成熟期eomesa-/-突變體中amh和cyp17a1的表達(dá)量都顯著低于野生型的表達(dá)量，而dmrt1的表達(dá)量顯著高于野生型的表達(dá)量，說(shuō)明eomesa功能缺失可能通過(guò)干擾這些基因的表達(dá)，導(dǎo)致卵母細(xì)胞的發(fā)育受到影響，使性腺發(fā)育滯后，并可能使卵子的質(zhì)量受到影響，致使畸形率偏高。此外，有研究表明cyp17a1對(duì)青鳉卵母細(xì)胞分化過(guò)程中雌二醇的形成具有重要的作用[35]，因此eomesa的功能缺失也可能通過(guò)影響cyp17a1的表達(dá)量，從而影響eomesa-/-雌魚(yú)的交配行為，如排卵，但其仍需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究通過(guò)構(gòu)建eomesa-/-突變系，從繁殖行為、繁殖性能測(cè)定、卵巢組織切片及性腺發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)等方面分析了eomesa功能缺失對(duì)雌性斑馬魚(yú)生殖的影響，為深入分析eomesa調(diào)控斑馬魚(yú)雌魚(yú)生殖的分子機(jī)制提供了基礎(chǔ)。