靳洪振，王玲玲，2，3，吳亞鑫，彭康堯，袁漢文，2，3，雷連成，4，張付賢，2，3

(1.長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北荊州 434023；2.濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心，湖北荊州 434023；3.澇漬災(zāi)害與濕地農(nóng)業(yè)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北荊州 434023；4.吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)春 130062)

黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)俗稱“黃辣丁”、“黃姑子”，為鲿科(Bagridae)黃顙魚屬(Pelteobagrus)，是中國(guó)特色淡水魚類。2020年黃顙魚養(yǎng)殖總產(chǎn)量為5.655×105t，在特色魚類中產(chǎn)量排名第二。黃顙魚肉質(zhì)滑嫩、刺少味美、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、深受廣大消費(fèi)者喜愛，是人們餐桌上的不可或缺的佳肴。但隨著黃顙魚養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，特別是養(yǎng)殖規(guī)模及密度不斷增加，導(dǎo)致水產(chǎn)病害頻發(fā)；再加上抗生素的不規(guī)范使用，黃顙魚的病害問題越發(fā)嚴(yán)重，其中以細(xì)菌病最為突出。比較常見的黃顙魚致病菌有遲緩愛德華氏菌(Edwardsiellatarda，Et)、類志賀鄰單胞菌(Plesiomonasshigelloides)、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)等[1，2]。

遲緩愛德華氏菌屬于腸桿菌科，無莢膜、無芽孢、有運(yùn)動(dòng)力的革蘭氏陰性菌，其在動(dòng)物體內(nèi)、海洋、湖泊、河流、泥土中廣泛存在，是一種人-魚共患的條件致病菌[3，4]。遲緩愛德華氏菌宿主范圍廣，可引起鳥類、爬行類、魚類、兩棲類感染和人類胃腸道癥狀。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，遲緩愛德華氏菌已經(jīng)成為引起水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物發(fā)病的重要病原菌。研究發(fā)現(xiàn)，該菌可感染多種水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物，如大口黑鱸(Micropterussalmoides)、羅非魚(Oreochromismossambicus)、龜(Mauremysreevesii)、牛蛙(Lithobatescatesbeiana)、鱖(Sinipercachuatsi)、黃鱔(Monopterusalbus)等[5]。魚類感染遲緩愛德華氏菌的主要癥狀表現(xiàn)為：腹部腫脹，并有腹水；肝臟、腎臟腫大，體表、鰭基和頭部皮膚有出血、潰爛現(xiàn)象。近年來，黃顙魚感染遲緩愛德華氏菌多次發(fā)生，傳染性強(qiáng)，死亡率高，給黃顙魚養(yǎng)殖造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[6]。

為查明2021年8月湖北荊州一養(yǎng)殖基地黃顙魚出現(xiàn)爛身、腹水等癥狀的病原，本研究從患病黃顙魚的肝臟、腎臟、脾臟等組織中分離純化出致病菌，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢、生理生化特性、16S rRNA基因序列分析鑒定分離菌株為遲緩愛德華氏菌，通過致病性分析和篩選對(duì)致病菌有抑制效果的抗菌藥物和中藥，為遲緩愛德華氏菌致病機(jī)理的研究和黃顙魚病害的防控提供科學(xué)依據(jù)和數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2021年8月采集湖北荊州某養(yǎng)殖基地出現(xiàn)魚體潰爛、腹腔腫大等臨床癥狀的發(fā)病黃顙魚，體質(zhì)量在100 g左右。人工感染實(shí)驗(yàn)材料為湖北省荊門市某黃顙魚養(yǎng)殖場(chǎng)健康黃顙魚，體質(zhì)量100～110 g，經(jīng)7 d暫養(yǎng)觀察，特定病原檢測(cè)為陰性的黃顙魚用于實(shí)驗(yàn)。

主要試劑：革蘭氏染色劑、瓊脂均購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；Labselect純醫(yī)用級(jí)聚苯乙烯96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，購(gòu)自北京蘭杰柯科技有限公司；Mueller-Hinton(MH)肉湯培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司；藥敏紙片、空白藥敏紙片、細(xì)菌微量生化管購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；2×PCR Mix酶、DL2000 DNA Marker購(gòu)自北京聚合美生物科技有限公司；細(xì)菌基因組提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；引物合成及測(cè)序委托生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 病原菌的分離與培養(yǎng)

檢查記錄患病黃顙魚的外觀癥狀，用75%的酒精擦拭病魚體表進(jìn)行消毒；在無菌條件下解剖病魚，觀察其內(nèi)部組織器官病變情況；取病變組織肝、腎、脾、腸和腹水至無菌1.5 mL EP管內(nèi)，充分研磨后，添加適量PBS溶液充分混勻。使用組織研磨液劃線接種于LB瓊脂培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)24 h。隨機(jī)挑取單個(gè)優(yōu)勢(shì)菌落純化培養(yǎng)，革蘭氏染色后使用光學(xué)顯微鏡鏡檢。

1.3 病原檢測(cè)

使用無菌剪刀和鑷子取患病黃顙魚病變組織(約200 mg)放入無酶的1.5 mL的EP管中進(jìn)行研磨，使用病毒DNA和RNA基因組提取試劑盒提取基因組作為病毒檢測(cè)的模板；以恒溫培養(yǎng)24 h后長(zhǎng)出的單菌落為檢測(cè)細(xì)菌的模板。以嗜水氣單胞菌OmpA基因(登錄號(hào)：NZ.CP050851.1)設(shè)計(jì)特異性引物，參考文獻(xiàn)[7-14]合成遲緩愛德華氏菌、溫和氣單胞菌和草魚呼腸孤病毒等病原的引物序列(表1)，反應(yīng)體系(20 μL)：模板1 μL、2×PCR mix 10 μL、上下游引物(10 μmol/L)各1 μL、dd H2O 7 μL；PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，31個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)后用5 μL產(chǎn)物使用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，恒壓120 V電泳25 min。

表1 患病黃顙魚病原檢測(cè)引物信息Tab.1 Primer information for pathogen detection of diseased P.fulvidraco

以分離和提取病魚臟器的基因組DNA作為模板，使用特異性引物體系，通過PCR檢測(cè)遲緩愛德華氏菌在黃顙魚的肝臟、腎臟、脾臟、腸道和腹水中的分布情況。

1.4 生理生化鑒定

挑取分離菌株的單菌落接入5 mL的LB液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、180 r/min的搖床過夜培養(yǎng)16 h；取10 μL菌液加入細(xì)菌微量生化管中，28 ℃培養(yǎng)24 h或48 h后進(jìn)行生理生化分析；將氧化酶試紙用蒸餾水浸濕，用接種環(huán)挑取單菌落，涂在試紙上，在30 s之內(nèi)變?yōu)樗{(lán)色或藍(lán)紫色為強(qiáng)陽性，2 min內(nèi)不變色為陰性。

1.5 測(cè)序分析和系統(tǒng)發(fā)育樹

1.5.1 16S rRNA鑒定

取分離菌株的純培養(yǎng)物提取基因組作為模板，以通用引物27-F：AGAGTTTGATCMTGGCTCAG和1492-R：GGTTACCTTGTTACGACTT進(jìn)行PCR擴(kuò)增。25 μL反應(yīng)體系如下：模板1 μL、2×PCR mix 12.5 μL、上下游引物(10 μmol/L)各1 μL、dd H2O 9.5 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，33個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)后用25 μL產(chǎn)物使用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。PCR產(chǎn)物委托上海生工生物工程有限公司武漢測(cè)序部進(jìn)行測(cè)序；測(cè)序結(jié)果在GeneBank數(shù)據(jù)庫上進(jìn)行序列同源性比對(duì)分析。

1.5.2 系統(tǒng)發(fā)育樹建立

將測(cè)序得到的菌株的16S rRNA序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，選取腸桿菌科同源性較高以及其他的愛德華氏菌屬的水產(chǎn)病原菌，如殺魚愛德華氏菌EIB202、鰻魚愛德華氏菌和人源遲緩愛德華氏菌作為內(nèi)群；再選取克雷伯氏菌屬、埃希氏菌屬和沙門氏菌屬作為外群，利用MEGA11.0軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，Neighbor-joining法構(gòu)建分子系統(tǒng)樹，并且取1 000次Bootstrap檢驗(yàn)置信度。

1.6 毒力基因檢測(cè)

參考SRINIVASA等[15]遲緩愛德華氏菌的毒力基因報(bào)道，合成遲緩愛德華氏菌的4個(gè)主要毒力基因(esaV、katB、fimA和gadB)的引物(表2)，PCR分析遲緩愛德華氏菌分離株攜帶毒力基因情況。使用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取分離菌株Et-4的基因組作為模板，PCR反應(yīng)體系25 μL：模板1 μL、2×PCR mix 12.5 μL、上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL、dd H2O 10.5 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，33個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)后用5 μL產(chǎn)物使用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。

表2 遲緩愛德華氏菌毒力基因引物序列Tab.2 Primers sequences of virulence gene associated with E.tarda

1.7 人工回歸感染實(shí)驗(yàn)

分離菌株Et-4經(jīng)活化后，挑取單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)6 h，4 000 r/min離心5 min收集菌體，無菌PBS洗滌三次，PBS重懸菌體，采用平板法進(jìn)行計(jì)數(shù)并測(cè)定菌液濃度[16，17]。

健康黃顙魚于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)暫養(yǎng)一周，選取健康且不攜帶嗜水氣單胞菌、類志賀鄰單胞菌、草魚呼腸孤病毒、遲緩愛德華氏菌等特定病原體的黃顙魚用于人工感染實(shí)驗(yàn)。人工腹腔注射感染實(shí)驗(yàn)共設(shè)立4個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，每組12尾，注射0.3 mL，實(shí)驗(yàn)組每尾魚攻毒劑量分別為1.248×108、3.12×107、7.8×106、1.95×106CFU/g，對(duì)照組每尾魚接種0.3 mL無菌PBS。實(shí)驗(yàn)魚均隔離養(yǎng)殖在玻璃缸內(nèi)，加熱棒控制水溫為23 ℃，pH值6.8～7.5，溶氧大于5 mg/L，氨氮小于0.06 mg/L。每天進(jìn)行觀察，按魚體質(zhì)量0.5%的量每日投喂一次；連續(xù)觀察7 d，記錄感染后黃顙魚的發(fā)病癥狀與死亡情況，根據(jù)寇氏法[18]計(jì)算其半數(shù)致死劑量；比對(duì)人工感染死亡黃顙魚與自然感染死亡黃顙魚的臨床癥狀和病理變化，并對(duì)發(fā)病死亡的實(shí)驗(yàn)黃顙魚進(jìn)行病原菌的再次分離和鑒定。

1.8 生物被膜形成能力測(cè)定

活化后的分離菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，在28 ℃，180 r/min搖床培養(yǎng)12 h；在96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入 100 μL的LB培養(yǎng)基和1 μL的菌液，未接種菌液的空白培養(yǎng)基孔作為對(duì)照；28 ℃孵育 8～10 h后，吸棄 96 孔板內(nèi)液體，；加入甲醇固定25 min，并洗凈晾干；0.1%的結(jié)晶紫染色10 min，洗凈晾干后加入冰醋酸溶解結(jié)晶紫，10 min后在550 nm處測(cè)定OD值；實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次，判定分離菌株生物被膜形成能力[19，20]。

1.9 藥物敏感性實(shí)驗(yàn)

1.9.1 抗菌藥物藥敏實(shí)驗(yàn)

將分離菌株Et-4用無菌生理鹽水稀釋到0.5麥?zhǔn)蠞舛?，用無菌棉簽蘸取菌液均勻涂布在MH固體培養(yǎng)基(Mueller-Hinton agar，MHA)上，采用Kirb-Bauer(K-B)紙片擴(kuò)散法，將30種抗菌藥物紙片貼在培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，測(cè)量藥敏片的抑菌圈直徑，結(jié)果判斷參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)[21]。

1.9.2 耐藥基因檢測(cè)

取分離菌株Et-4的純培養(yǎng)物提取基因組作為模板，合成耐藥基因的特異性引物[22，23](表3)，PCR檢測(cè)分離菌株Et-4攜帶耐藥基因情況。PCR反應(yīng)體系25 μL：模板1 μL、2×PCR mix 12.5 μL、上下游引物(10 μmol/L)各1 μL、dd H2O 9.5 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，33個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)后用5 μL反應(yīng)產(chǎn)物使用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，恒壓120 V電泳25 min。

表3 耐藥基因引物信息以及目標(biāo)產(chǎn)物大小Tab.3 Primer information and target product size of drug resistance genes

1.10 中藥藥敏實(shí)驗(yàn)

選取42種中藥：黃芩、紫蘇子、獨(dú)活、麻黃、款冬花、桑皮、川貝母、天竹黃、大黃(熟)、白術(shù)、荊芥、半夏、黃連、僵蠶(炒)、白附子(炙)、茯苓、羌活、桔梗、明雄黃、朱砂、枳殼、連翹、板藍(lán)根、魚腥草、全蝎、野菊花、薄荷、五味子，金銀花，胖大海。五倍子、秦皮、石榴皮、首烏藤、肉桂、丁香、蒲公英、板藍(lán)根、地榆、檳榔、大青葉、烏梅[24-26]，體外實(shí)驗(yàn)分析其對(duì)分離菌株Et-4的抑制情況。

中藥藥液和藥敏片的制備：取中藥材2 g，加入40 mL水浸泡1 h后煎煮，沸騰后轉(zhuǎn)文火繼續(xù)煎煮2 h，用三層紗布過濾并收集濾液；過濾后的藥渣繼續(xù)加入40 mL水，按上述方法進(jìn)行煎煮過濾；兩次過濾的藥液濃縮為2 mL，最終濃度為1 g/mL；高壓滅菌后，放于4 ℃保存。取空白藥敏片，將濾紙片放入制備好中藥藥液中浸泡1 min，經(jīng)高壓滅菌后放入55～65 ℃烘箱內(nèi)烘干備用。

取200 μL菌懸液均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基，均勻貼上制備的中藥藥敏紙片，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h；測(cè)量抑菌圈大小，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算抑菌圈平均直徑，參照徐曉津[27]提供的抑菌標(biāo)準(zhǔn)判斷不同中藥的抑菌能力。

2 結(jié)果

2.1 病原鑒定

發(fā)病黃顙魚出現(xiàn)打圈、浮頭、爛身和腹部腫大等癥狀，剖檢可見腹腔內(nèi)積有大量腹水，肝臟、腎臟腫大，肝臟和腸道有出血。采集病變組織進(jìn)行PCR鑒定特定病原。PCR結(jié)果如圖1所示，嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌、溫和氣單胞菌、無乳鏈球菌、蛙屬虹彩病毒、草魚呼腸孤病毒、病毒性出血敗血癥病毒的引物均未擴(kuò)增出特異性條帶，結(jié)果為陰性；遲緩愛德華氏菌的引物擴(kuò)增出陽性條帶，表明黃顙魚疑似遲緩愛德華氏菌感染。

圖1 病原的PCR鑒定Fig.1 Identification of the pathogens by PCRM.DL 2000 DNA Marker；泳道2～9為陰性對(duì)照，11～18為陽性對(duì)照，20～27為檢測(cè)樣品；As.溫和氣單胞菌；Av.維氏氣單胞菌；Ah.嗜水氣單胞菌；Et.遲緩愛德華氏菌；GBS.無乳鏈球菌；VHSV.病毒性出血敗血癥病毒；RV.蛙屬虹彩病毒；GCRV.草魚呼腸孤病毒。

分別采集患病黃顙魚不同的病變組織并提取基因組，以遲緩愛德華氏菌特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖2所示，在患病黃顙魚的肝臟、腎臟和腹水中均能擴(kuò)增出遲緩愛德華氏菌特異的條帶，表明在黃顙魚的肝、腎和腹水中均存在遲緩愛德華氏菌。

圖2 分離菌株在組織中分布Fig.2 Detection of isolated strain in tissuesM.2000bp DNA Marker；1.陰性對(duì)照；2.陽性對(duì)照；3.肝；4.腎；5.脾；6.腸；7.腹水。

2.2 細(xì)菌分離與菌落形態(tài)

用患病黃顙魚的肝臟和腹水劃線接種LB固體平板，28 ℃培養(yǎng)24 h生成灰白色、濕潤(rùn)有光澤、表面光滑的菌落；在光學(xué)顯微鏡下可見紅色、兩端鈍圓的短桿菌，為革蘭氏陰性桿菌(圖3)，與遲緩愛德華氏菌的形態(tài)特征一致。

圖3 分離菌株的形態(tài)學(xué)觀察Fig.3 Morphological observation of the isolated straina.培養(yǎng)基生長(zhǎng)形態(tài)；b.革蘭氏染色鏡檢(100×)。

2.3 分離菌的生理生化鑒定

分離菌株的氧化酶實(shí)驗(yàn)呈陰性，可使葡萄糖產(chǎn)氣，MR、賴氨酸脫羧酶、硫化氫、麥芽糖、鳥氨酸脫羧酶、葡萄糖和靛基藍(lán)呈陽性，其余精氨酸雙水解酶等呈陰性(表4)。分離菌株的生理生化特性與伯杰氏細(xì)菌分類手冊(cè)中遲緩愛德華氏菌的生理生化特性一致。

表4 Et-4的生理生化鑒定結(jié)果Tab.4 Physiological and biochemical identification results of Et-4

2.4 16S rRNA序列分析

對(duì)分離菌株的16S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增出的基因片段大小為1 443 bp；基因片段測(cè)序發(fā)現(xiàn)，分離菌株與遲緩愛德華氏菌ATCC23685(GenBank：GG739637.1)的同源性為99.79%；利用MEGA 11.0軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，Neighbor-joining法構(gòu)建分子系統(tǒng)樹，結(jié)果如圖4所示，分離菌株與愛德華氏菌屬菌株聚為一支，與克雷伯氏菌屬、埃希氏菌屬和沙門氏菌屬較遠(yuǎn)。結(jié)合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可判定分離菌株為遲緩愛德華氏菌，命名為Et-4。

圖4 基于分離菌株Et-4的16S rRNA的基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree constructed based on 16S rRNA gene sequences of isolated strain Et-4

2.5 分離菌株毒力基因分析

采用4種毒力基因的特異性引物對(duì)遲緩愛德華氏菌Et-4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，在4種毒力基因目的條帶處均未出現(xiàn)清晰條帶(圖5)，表明遲緩愛德華氏菌分離株Et-4缺失上述4種毒力基因，其毒力基因型為esaV-fimA-gadB-katB-，初步判定其為弱毒株。

圖5 毒力基因檢測(cè)Fig.5 Detection of virulence genes of isolated strain Et-4M.DL 2000 DNA Marker；泳道2-5為陰性對(duì)照；泳道7-10為菌株Et-4。

2.6 人工感染實(shí)驗(yàn)

將分離菌株Et-4通過腹腔注射的方式感染健康黃顙魚，攻毒后患病魚出現(xiàn)明顯的食欲下降，游動(dòng)無力，反應(yīng)遲鈍；病魚體表粘液脫落，皮膚組織出現(xiàn)紅腫、出血和潰瘍；鰓蓋、鰭條基部充血，腹部腫大等臨床癥狀(圖6)，以1.248×108CFU/g組和3.12×107CFU/g組黃顙魚的臨床癥狀最為顯著。在攻毒后6 d，1.248×108CFU/g組和3.12×107CFU/g組黃顙魚全部死亡，7.8×106CFU/g組死亡8尾，1.95×106CFU/g組死亡4尾，PBS組死亡2尾(圖7)。剖檢病魚可見嚴(yán)重的腹水、肝臟和腎臟病變，PCR鑒定為遲緩愛德華氏菌感染，從肝臟、腎臟和腹水中分離出的優(yōu)勢(shì)菌群經(jīng)16S rRNA測(cè)序分析與攻毒菌株一致；PBS組病死魚未見明顯病變，也未檢出攻毒菌株。統(tǒng)計(jì)分離菌株Et-4對(duì)黃顙魚的半致死劑量為3.9×106CFU/g，結(jié)合毒力基因檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步確定分離株Et-4為esaV-fimA-gadB-katB-的弱毒株。

圖6 人工感染后黃顙魚患病癥狀Fig.6 Symptoms of P.fulvidraco after artificial infection1.頭部點(diǎn)狀出血；2.腹部腫大。

圖7 不同實(shí)驗(yàn)組黃顙魚的存活曲線Fig.7 Survival curve of P.fulvidraco in different experimental groups

2.7 生物被膜形成能力測(cè)定結(jié)果

分離菌株Et-4的生物被膜形成能力測(cè)定的OD550 nm值為0.409 7，而空白組OD550 nm值僅為0.075 0，表明遲緩愛德華氏菌分離菌株Et-4具有較強(qiáng)的生物被膜形成能力。

2.8 藥物敏感性實(shí)驗(yàn)

2.8.1 抗菌藥物藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用藥敏紙片瓊脂平板擴(kuò)散法對(duì)菌株Et-4進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表5所示，分離菌株Et-4對(duì)頭孢類藥物、慶大霉素、新霉素、卡那霉素、丁胺卡那、呋喃唑酮和多粘菌素B敏感；對(duì)米諾環(huán)素、氯霉素、頭孢哌酮中度敏感，對(duì)四環(huán)素類、青霉素類、萬古菌素、復(fù)方新諾明等13種藥物耐藥。藥敏結(jié)果表明，遲緩愛德華氏菌分離菌株Et-4為多重耐藥菌株。

表5 抗菌藥物藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Drug susceptibility test of isolated strain Et-4

2.8.2 Et-4耐藥基因結(jié)果

耐藥基因檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分離菌株Et-4攜帶耐藥基因tetA、sul1和aadA1(圖8)，表明分離菌株Et-4對(duì)四環(huán)素類、磺胺類和氨基糖苷類抗菌藥物有一定的耐藥性。

圖8 耐藥基因檢測(cè)Fig.8 Detection results of drug resistance gene of isolated strain Et-4M：2000 bp DNA Marker；2～4泳道：陰性對(duì)照；6～8泳道：Et-4。

2.9 中藥藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

采用藥敏紙片瓊脂平板擴(kuò)散法對(duì)菌株Et-4進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如表6所示，Et-4對(duì)烏梅和丁香較為敏感，其次五倍子、生地榆、秦皮、蒲公英等中藥對(duì)菌株Et-4也有一定的抑菌效果。

3 討論

近年來，黃顙魚養(yǎng)殖中出現(xiàn)體表潰爛癥狀的臨床病例較多，主要由遲緩愛德華氏菌、擬態(tài)弧菌(V.miminus)、溫和氣單胞菌(A.sobria)和維氏氣單胞菌(A.veronii)等細(xì)菌感染引起[28，29]。本研究從患病黃顙魚組織中分離到的優(yōu)勢(shì)菌株經(jīng)16S rRNA基因序列鑒定為遲緩愛德華氏菌，其主要存在于病魚肝臟、腎臟和腹水中，具有一定的組織嗜性；自然發(fā)病黃顙魚和人工感染黃顙魚觀察到的臨床癥狀與PANDEY等[30]、MURWANTOKO等[31]、YANG等[32]學(xué)者所報(bào)道的一致，并且均能從肝臟、腎臟和腹水中分離到攻毒菌，證實(shí)遲緩愛德華氏菌為湖北荊州某養(yǎng)殖基地黃顙魚身體潰爛、嚴(yán)重腹水的致病菌。胡兵等[33]分離的遲鈍愛德華氏菌導(dǎo)致黃顙魚頭部出現(xiàn)“頭穿孔”的典型臨床癥狀，與本研究分離毒株感染出現(xiàn)的臨床癥狀存在顯著差異，可能與分離毒株的分布區(qū)域以及致病性有關(guān)。因此，臨床上開展黃顙魚爛身病診治時(shí)，應(yīng)綜合考慮臨床癥狀、分子生物學(xué)檢測(cè)以及致病菌的毒力、耐藥性進(jìn)行針對(duì)性的治療。

經(jīng)鑒定遲緩愛德華氏菌分離菌株Et-4不攜帶四種主要的毒力基因：esaV、fimA、gadA1和katB，這與羅非魚源遲緩愛德華氏菌天然弱毒株的毒力基因譜型相似[34]。程俊茗等[35]分離的鯽源遲緩愛德華氏菌攜帶fimA、citC、gadB、mukF、katB、esrB和sodB等7個(gè)毒力基因，與本研究分離菌株的毒力基因攜帶情況顯著不同。人工感染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，遲緩愛德華氏菌分離菌株Et-4在低劑量感染時(shí)對(duì)黃顙魚沒有明顯的致病性；當(dāng)攻毒劑量增加至1.95×106CFU/g時(shí)，黃顙魚出現(xiàn)爛身、腹水等癥狀；統(tǒng)計(jì)分離株Et-4對(duì)黃顙魚的半致死劑量為3.9×106CFU/g，綜合其毒力基因型確定遲緩愛德華氏菌分離株Et-4為弱毒株。

本研究通過藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)遲緩愛德華氏菌分離菌株Et-4對(duì)四環(huán)素類、青霉素類、萬古菌素、磺胺類的復(fù)方新諾明等13種藥物耐藥，是一株多重耐藥菌；篩查耐藥基因發(fā)現(xiàn)，分離菌株Et-4攜帶耐藥基因tetA、sul1和aadA1，其對(duì)四環(huán)素類藥物的耐藥性可能與tetA基因有關(guān)，對(duì)磺胺類藥物的耐藥性可能與sul1基因有關(guān)，對(duì)氨基糖苷類抗菌藥物的耐藥性可能與其攜帶的aadA1耐藥基因有關(guān)。在生物被膜形成能力方面，分離株Et-4具有較強(qiáng)的生物被膜形成能力，屬于易產(chǎn)生生物被膜的細(xì)菌，這與其在藥敏試驗(yàn)中呈現(xiàn)的多重耐藥結(jié)果相符。綜合分離菌株的生物被膜能力、耐藥基因、藥物敏感性和致病性，表明分離株Et-4為多重耐藥的弱毒株，這也在一定程度上解釋了生產(chǎn)上抗生素使用時(shí)效果不佳的原因。

本研究發(fā)現(xiàn)，中藥烏梅和丁香對(duì)分離株Et-4具有較好的抑菌效果。因此，在開展遲緩愛德華氏菌防治時(shí)，可考慮使用中藥烏梅、丁香、地榆和蒲公英的復(fù)方藥劑或單味中藥的有效成分。針對(duì)近年來黃顙魚的遲緩愛德華氏菌病多發(fā)的問題，養(yǎng)殖戶在生產(chǎn)上應(yīng)提升水質(zhì)，改善養(yǎng)殖環(huán)境；合理調(diào)配飼料，提高黃顙魚的基礎(chǔ)免疫力；充分考慮條件致病菌的耐藥性和致病性，結(jié)合敏感抗菌藥物和中藥進(jìn)行聯(lián)合用藥和精準(zhǔn)施治。本實(shí)驗(yàn)黃顙魚源的遲緩愛德華氏菌致病性和耐藥性研究結(jié)果，可為黃顙魚遲緩愛德華氏菌感染的防控提供理論依據(jù)。