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        一株黃顙魚源遲緩愛德華氏菌弱毒株的分離鑒定及特性分析

        2023-09-19 07:18:06靳洪振王玲玲吳亞鑫彭康堯袁漢文雷連成張付賢
        淡水漁業(yè) 2023年5期
        關(guān)鍵詞:氏菌愛德華毒力

        靳洪振,王玲玲,2,3,吳亞鑫,彭康堯,袁漢文,2,3,雷連成,4,張付賢,2,3

        (1.長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院,湖北荊州 434023;2.濕地生態(tài)與農(nóng)業(yè)利用教育部工程研究中心,湖北荊州 434023;3.澇漬災(zāi)害與濕地農(nóng)業(yè)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北荊州 434023;4.吉林大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院,長(zhǎng)春 130062)

        黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)俗稱“黃辣丁”、“黃姑子”,為鲿科(Bagridae)黃顙魚屬(Pelteobagrus),是中國(guó)特色淡水魚類。2020年黃顙魚養(yǎng)殖總產(chǎn)量為5.655×105t,在特色魚類中產(chǎn)量排名第二。黃顙魚肉質(zhì)滑嫩、刺少味美、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高、深受廣大消費(fèi)者喜愛,是人們餐桌上的不可或缺的佳肴。但隨著黃顙魚養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展,特別是養(yǎng)殖規(guī)模及密度不斷增加,導(dǎo)致水產(chǎn)病害頻發(fā);再加上抗生素的不規(guī)范使用,黃顙魚的病害問題越發(fā)嚴(yán)重,其中以細(xì)菌病最為突出。比較常見的黃顙魚致病菌有遲緩愛德華氏菌(Edwardsiellatarda,Et)、類志賀鄰單胞菌(Plesiomonasshigelloides)、嗜水氣單胞菌(Aeromonashydrophila)等[1,2]。

        遲緩愛德華氏菌屬于腸桿菌科,無莢膜、無芽孢、有運(yùn)動(dòng)力的革蘭氏陰性菌,其在動(dòng)物體內(nèi)、海洋、湖泊、河流、泥土中廣泛存在,是一種人-魚共患的條件致病菌[3,4]。遲緩愛德華氏菌宿主范圍廣,可引起鳥類、爬行類、魚類、兩棲類感染和人類胃腸道癥狀。隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大,遲緩愛德華氏菌已經(jīng)成為引起水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物發(fā)病的重要病原菌。研究發(fā)現(xiàn),該菌可感染多種水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物,如大口黑鱸(Micropterussalmoides)、羅非魚(Oreochromismossambicus)、龜(Mauremysreevesii)、牛蛙(Lithobatescatesbeiana)、鱖(Sinipercachuatsi)、黃鱔(Monopterusalbus)等[5]。魚類感染遲緩愛德華氏菌的主要癥狀表現(xiàn)為:腹部腫脹,并有腹水;肝臟、腎臟腫大,體表、鰭基和頭部皮膚有出血、潰爛現(xiàn)象。近年來,黃顙魚感染遲緩愛德華氏菌多次發(fā)生,傳染性強(qiáng),死亡率高,給黃顙魚養(yǎng)殖造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[6]。

        為查明2021年8月湖北荊州一養(yǎng)殖基地黃顙魚出現(xiàn)爛身、腹水等癥狀的病原,本研究從患病黃顙魚的肝臟、腎臟、脾臟等組織中分離純化出致病菌,經(jīng)革蘭氏染色鏡檢、生理生化特性、16S rRNA基因序列分析鑒定分離菌株為遲緩愛德華氏菌,通過致病性分析和篩選對(duì)致病菌有抑制效果的抗菌藥物和中藥,為遲緩愛德華氏菌致病機(jī)理的研究和黃顙魚病害的防控提供科學(xué)依據(jù)和數(shù)據(jù)參考。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)材料

        2021年8月采集湖北荊州某養(yǎng)殖基地出現(xiàn)魚體潰爛、腹腔腫大等臨床癥狀的發(fā)病黃顙魚,體質(zhì)量在100 g左右。人工感染實(shí)驗(yàn)材料為湖北省荊門市某黃顙魚養(yǎng)殖場(chǎng)健康黃顙魚,體質(zhì)量100~110 g,經(jīng)7 d暫養(yǎng)觀察,特定病原檢測(cè)為陰性的黃顙魚用于實(shí)驗(yàn)。

        主要試劑:革蘭氏染色劑、瓊脂均購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司;Labselect純醫(yī)用級(jí)聚苯乙烯96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,購(gòu)自北京蘭杰柯科技有限公司;Mueller-Hinton(MH)肉湯培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博生物技術(shù)有限公司;藥敏紙片、空白藥敏紙片、細(xì)菌微量生化管購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司;2×PCR Mix酶、DL2000 DNA Marker購(gòu)自北京聚合美生物科技有限公司;細(xì)菌基因組提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;引物合成及測(cè)序委托生工生物工程(上海)股份有限公司。

        1.2 病原菌的分離與培養(yǎng)

        檢查記錄患病黃顙魚的外觀癥狀,用75%的酒精擦拭病魚體表進(jìn)行消毒;在無菌條件下解剖病魚,觀察其內(nèi)部組織器官病變情況;取病變組織肝、腎、脾、腸和腹水至無菌1.5 mL EP管內(nèi),充分研磨后,添加適量PBS溶液充分混勻。使用組織研磨液劃線接種于LB瓊脂培養(yǎng)基上,28 ℃培養(yǎng)24 h。隨機(jī)挑取單個(gè)優(yōu)勢(shì)菌落純化培養(yǎng),革蘭氏染色后使用光學(xué)顯微鏡鏡檢。

        1.3 病原檢測(cè)

        使用無菌剪刀和鑷子取患病黃顙魚病變組織(約200 mg)放入無酶的1.5 mL的EP管中進(jìn)行研磨,使用病毒DNA和RNA基因組提取試劑盒提取基因組作為病毒檢測(cè)的模板;以恒溫培養(yǎng)24 h后長(zhǎng)出的單菌落為檢測(cè)細(xì)菌的模板。以嗜水氣單胞菌OmpA基因(登錄號(hào):NZ.CP050851.1)設(shè)計(jì)特異性引物,參考文獻(xiàn)[7-14]合成遲緩愛德華氏菌、溫和氣單胞菌和草魚呼腸孤病毒等病原的引物序列(表1),反應(yīng)體系(20 μL):模板1 μL、2×PCR mix 10 μL、上下游引物(10 μmol/L)各1 μL、dd H2O 7 μL;PCR擴(kuò)增條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,31個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。反應(yīng)后用5 μL產(chǎn)物使用1.0%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,恒壓120 V電泳25 min。

        表1 患病黃顙魚病原檢測(cè)引物信息Tab.1 Primer information for pathogen detection of diseased P.fulvidraco

        以分離和提取病魚臟器的基因組DNA作為模板,使用特異性引物體系,通過PCR檢測(cè)遲緩愛德華氏菌在黃顙魚的肝臟、腎臟、脾臟、腸道和腹水中的分布情況。

        1.4 生理生化鑒定

        挑取分離菌株的單菌落接入5 mL的LB液體培養(yǎng)基中,在28 ℃、180 r/min的搖床過夜培養(yǎng)16 h;取10 μL菌液加入細(xì)菌微量生化管中,28 ℃培養(yǎng)24 h或48 h后進(jìn)行生理生化分析;將氧化酶試紙用蒸餾水浸濕,用接種環(huán)挑取單菌落,涂在試紙上,在30 s之內(nèi)變?yōu)樗{(lán)色或藍(lán)紫色為強(qiáng)陽性,2 min內(nèi)不變色為陰性。

        1.5 測(cè)序分析和系統(tǒng)發(fā)育樹

        1.5.1 16S rRNA鑒定

        取分離菌株的純培養(yǎng)物提取基因組作為模板,以通用引物27-F:AGAGTTTGATCMTGGCTCAG和1492-R:GGTTACCTTGTTACGACTT進(jìn)行PCR擴(kuò)增。25 μL反應(yīng)體系如下:模板1 μL、2×PCR mix 12.5 μL、上下游引物(10 μmol/L)各1 μL、dd H2O 9.5 μL。PCR擴(kuò)增條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,33個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。反應(yīng)后用25 μL產(chǎn)物使用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。PCR產(chǎn)物委托上海生工生物工程有限公司武漢測(cè)序部進(jìn)行測(cè)序;測(cè)序結(jié)果在GeneBank數(shù)據(jù)庫上進(jìn)行序列同源性比對(duì)分析。

        1.5.2 系統(tǒng)發(fā)育樹建立

        將測(cè)序得到的菌株的16S rRNA序列在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì),選取腸桿菌科同源性較高以及其他的愛德華氏菌屬的水產(chǎn)病原菌,如殺魚愛德華氏菌EIB202、鰻魚愛德華氏菌和人源遲緩愛德華氏菌作為內(nèi)群;再選取克雷伯氏菌屬、埃希氏菌屬和沙門氏菌屬作為外群,利用MEGA11.0軟件進(jìn)行多序列比對(duì),Neighbor-joining法構(gòu)建分子系統(tǒng)樹,并且取1 000次Bootstrap檢驗(yàn)置信度。

        1.6 毒力基因檢測(cè)

        參考SRINIVASA等[15]遲緩愛德華氏菌的毒力基因報(bào)道,合成遲緩愛德華氏菌的4個(gè)主要毒力基因(esaV、katB、fimA和gadB)的引物(表2),PCR分析遲緩愛德華氏菌分離株攜帶毒力基因情況。使用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取分離菌株Et-4的基因組作為模板,PCR反應(yīng)體系25 μL:模板1 μL、2×PCR mix 12.5 μL、上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL、dd H2O 10.5 μL。PCR擴(kuò)增條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,33個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。反應(yīng)后用5 μL產(chǎn)物使用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳。

        表2 遲緩愛德華氏菌毒力基因引物序列Tab.2 Primers sequences of virulence gene associated with E.tarda

        1.7 人工回歸感染實(shí)驗(yàn)

        分離菌株Et-4經(jīng)活化后,挑取單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中,28 ℃、180 r/min搖床培養(yǎng)6 h,4 000 r/min離心5 min收集菌體,無菌PBS洗滌三次,PBS重懸菌體,采用平板法進(jìn)行計(jì)數(shù)并測(cè)定菌液濃度[16,17]。

        健康黃顙魚于實(shí)驗(yàn)室內(nèi)暫養(yǎng)一周,選取健康且不攜帶嗜水氣單胞菌、類志賀鄰單胞菌、草魚呼腸孤病毒、遲緩愛德華氏菌等特定病原體的黃顙魚用于人工感染實(shí)驗(yàn)。人工腹腔注射感染實(shí)驗(yàn)共設(shè)立4個(gè)實(shí)驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組,每組12尾,注射0.3 mL,實(shí)驗(yàn)組每尾魚攻毒劑量分別為1.248×108、3.12×107、7.8×106、1.95×106CFU/g,對(duì)照組每尾魚接種0.3 mL無菌PBS。實(shí)驗(yàn)魚均隔離養(yǎng)殖在玻璃缸內(nèi),加熱棒控制水溫為23 ℃,pH值6.8~7.5,溶氧大于5 mg/L,氨氮小于0.06 mg/L。每天進(jìn)行觀察,按魚體質(zhì)量0.5%的量每日投喂一次;連續(xù)觀察7 d,記錄感染后黃顙魚的發(fā)病癥狀與死亡情況,根據(jù)寇氏法[18]計(jì)算其半數(shù)致死劑量;比對(duì)人工感染死亡黃顙魚與自然感染死亡黃顙魚的臨床癥狀和病理變化,并對(duì)發(fā)病死亡的實(shí)驗(yàn)黃顙魚進(jìn)行病原菌的再次分離和鑒定。

        1.8 生物被膜形成能力測(cè)定

        活化后的分離菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中,在28 ℃,180 r/min搖床培養(yǎng)12 h;在96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中加入 100 μL的LB培養(yǎng)基和1 μL的菌液,未接種菌液的空白培養(yǎng)基孔作為對(duì)照;28 ℃孵育 8~10 h后,吸棄 96 孔板內(nèi)液體,;加入甲醇固定25 min,并洗凈晾干;0.1%的結(jié)晶紫染色10 min,洗凈晾干后加入冰醋酸溶解結(jié)晶紫,10 min后在550 nm處測(cè)定OD值;實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,判定分離菌株生物被膜形成能力[19,20]。

        1.9 藥物敏感性實(shí)驗(yàn)

        1.9.1 抗菌藥物藥敏實(shí)驗(yàn)

        將分離菌株Et-4用無菌生理鹽水稀釋到0.5麥?zhǔn)蠞舛?,用無菌棉簽蘸取菌液均勻涂布在MH固體培養(yǎng)基(Mueller-Hinton agar,MHA)上,采用Kirb-Bauer(K-B)紙片擴(kuò)散法,將30種抗菌藥物紙片貼在培養(yǎng)基上,28 ℃恒溫培養(yǎng)24 h,測(cè)量藥敏片的抑菌圈直徑,結(jié)果判斷參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)[21]。

        1.9.2 耐藥基因檢測(cè)

        取分離菌株Et-4的純培養(yǎng)物提取基因組作為模板,合成耐藥基因的特異性引物[22,23](表3),PCR檢測(cè)分離菌株Et-4攜帶耐藥基因情況。PCR反應(yīng)體系25 μL:模板1 μL、2×PCR mix 12.5 μL、上下游引物(10 μmol/L)各1 μL、dd H2O 9.5 μL。PCR擴(kuò)增條件:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,33個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。反應(yīng)后用5 μL反應(yīng)產(chǎn)物使用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,恒壓120 V電泳25 min。

        表3 耐藥基因引物信息以及目標(biāo)產(chǎn)物大小Tab.3 Primer information and target product size of drug resistance genes

        1.10 中藥藥敏實(shí)驗(yàn)

        選取42種中藥:黃芩、紫蘇子、獨(dú)活、麻黃、款冬花、桑皮、川貝母、天竹黃、大黃(熟)、白術(shù)、荊芥、半夏、黃連、僵蠶(炒)、白附子(炙)、茯苓、羌活、桔梗、明雄黃、朱砂、枳殼、連翹、板藍(lán)根、魚腥草、全蝎、野菊花、薄荷、五味子,金銀花,胖大海。五倍子、秦皮、石榴皮、首烏藤、肉桂、丁香、蒲公英、板藍(lán)根、地榆、檳榔、大青葉、烏梅[24-26],體外實(shí)驗(yàn)分析其對(duì)分離菌株Et-4的抑制情況。

        中藥藥液和藥敏片的制備:取中藥材2 g,加入40 mL水浸泡1 h后煎煮,沸騰后轉(zhuǎn)文火繼續(xù)煎煮2 h,用三層紗布過濾并收集濾液;過濾后的藥渣繼續(xù)加入40 mL水,按上述方法進(jìn)行煎煮過濾;兩次過濾的藥液濃縮為2 mL,最終濃度為1 g/mL;高壓滅菌后,放于4 ℃保存。取空白藥敏片,將濾紙片放入制備好中藥藥液中浸泡1 min,經(jīng)高壓滅菌后放入55~65 ℃烘箱內(nèi)烘干備用。

        取200 μL菌懸液均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基,均勻貼上制備的中藥藥敏紙片,37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h;測(cè)量抑菌圈大小,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,計(jì)算抑菌圈平均直徑,參照徐曉津[27]提供的抑菌標(biāo)準(zhǔn)判斷不同中藥的抑菌能力。

        2 結(jié)果

        2.1 病原鑒定

        發(fā)病黃顙魚出現(xiàn)打圈、浮頭、爛身和腹部腫大等癥狀,剖檢可見腹腔內(nèi)積有大量腹水,肝臟、腎臟腫大,肝臟和腸道有出血。采集病變組織進(jìn)行PCR鑒定特定病原。PCR結(jié)果如圖1所示,嗜水氣單胞菌、維氏氣單胞菌、溫和氣單胞菌、無乳鏈球菌、蛙屬虹彩病毒、草魚呼腸孤病毒、病毒性出血敗血癥病毒的引物均未擴(kuò)增出特異性條帶,結(jié)果為陰性;遲緩愛德華氏菌的引物擴(kuò)增出陽性條帶,表明黃顙魚疑似遲緩愛德華氏菌感染。

        圖1 病原的PCR鑒定Fig.1 Identification of the pathogens by PCRM.DL 2000 DNA Marker;泳道2~9為陰性對(duì)照,11~18為陽性對(duì)照,20~27為檢測(cè)樣品;As.溫和氣單胞菌;Av.維氏氣單胞菌;Ah.嗜水氣單胞菌;Et.遲緩愛德華氏菌;GBS.無乳鏈球菌;VHSV.病毒性出血敗血癥病毒;RV.蛙屬虹彩病毒;GCRV.草魚呼腸孤病毒。

        分別采集患病黃顙魚不同的病變組織并提取基因組,以遲緩愛德華氏菌特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增,結(jié)果如圖2所示,在患病黃顙魚的肝臟、腎臟和腹水中均能擴(kuò)增出遲緩愛德華氏菌特異的條帶,表明在黃顙魚的肝、腎和腹水中均存在遲緩愛德華氏菌。

        圖2 分離菌株在組織中分布Fig.2 Detection of isolated strain in tissuesM.2000bp DNA Marker;1.陰性對(duì)照;2.陽性對(duì)照;3.肝;4.腎;5.脾;6.腸;7.腹水。

        2.2 細(xì)菌分離與菌落形態(tài)

        用患病黃顙魚的肝臟和腹水劃線接種LB固體平板,28 ℃培養(yǎng)24 h生成灰白色、濕潤(rùn)有光澤、表面光滑的菌落;在光學(xué)顯微鏡下可見紅色、兩端鈍圓的短桿菌,為革蘭氏陰性桿菌(圖3),與遲緩愛德華氏菌的形態(tài)特征一致。

        圖3 分離菌株的形態(tài)學(xué)觀察Fig.3 Morphological observation of the isolated straina.培養(yǎng)基生長(zhǎng)形態(tài);b.革蘭氏染色鏡檢(100×)。

        2.3 分離菌的生理生化鑒定

        分離菌株的氧化酶實(shí)驗(yàn)呈陰性,可使葡萄糖產(chǎn)氣,MR、賴氨酸脫羧酶、硫化氫、麥芽糖、鳥氨酸脫羧酶、葡萄糖和靛基藍(lán)呈陽性,其余精氨酸雙水解酶等呈陰性(表4)。分離菌株的生理生化特性與伯杰氏細(xì)菌分類手冊(cè)中遲緩愛德華氏菌的生理生化特性一致。

        表4 Et-4的生理生化鑒定結(jié)果Tab.4 Physiological and biochemical identification results of Et-4

        2.4 16S rRNA序列分析

        對(duì)分離菌株的16S rRNA基因進(jìn)行擴(kuò)增,擴(kuò)增出的基因片段大小為1 443 bp;基因片段測(cè)序發(fā)現(xiàn),分離菌株與遲緩愛德華氏菌ATCC23685(GenBank:GG739637.1)的同源性為99.79%;利用MEGA 11.0軟件進(jìn)行多序列比對(duì),Neighbor-joining法構(gòu)建分子系統(tǒng)樹,結(jié)果如圖4所示,分離菌株與愛德華氏菌屬菌株聚為一支,與克雷伯氏菌屬、埃希氏菌屬和沙門氏菌屬較遠(yuǎn)。結(jié)合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可判定分離菌株為遲緩愛德華氏菌,命名為Et-4。

        圖4 基于分離菌株Et-4的16S rRNA的基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic tree constructed based on 16S rRNA gene sequences of isolated strain Et-4

        2.5 分離菌株毒力基因分析

        采用4種毒力基因的特異性引物對(duì)遲緩愛德華氏菌Et-4進(jìn)行PCR擴(kuò)增,結(jié)果表明,在4種毒力基因目的條帶處均未出現(xiàn)清晰條帶(圖5),表明遲緩愛德華氏菌分離株Et-4缺失上述4種毒力基因,其毒力基因型為esaV-fimA-gadB-katB-,初步判定其為弱毒株。

        圖5 毒力基因檢測(cè)Fig.5 Detection of virulence genes of isolated strain Et-4M.DL 2000 DNA Marker;泳道2-5為陰性對(duì)照;泳道7-10為菌株Et-4。

        2.6 人工感染實(shí)驗(yàn)

        將分離菌株Et-4通過腹腔注射的方式感染健康黃顙魚,攻毒后患病魚出現(xiàn)明顯的食欲下降,游動(dòng)無力,反應(yīng)遲鈍;病魚體表粘液脫落,皮膚組織出現(xiàn)紅腫、出血和潰瘍;鰓蓋、鰭條基部充血,腹部腫大等臨床癥狀(圖6),以1.248×108CFU/g組和3.12×107CFU/g組黃顙魚的臨床癥狀最為顯著。在攻毒后6 d,1.248×108CFU/g組和3.12×107CFU/g組黃顙魚全部死亡,7.8×106CFU/g組死亡8尾,1.95×106CFU/g組死亡4尾,PBS組死亡2尾(圖7)。剖檢病魚可見嚴(yán)重的腹水、肝臟和腎臟病變,PCR鑒定為遲緩愛德華氏菌感染,從肝臟、腎臟和腹水中分離出的優(yōu)勢(shì)菌群經(jīng)16S rRNA測(cè)序分析與攻毒菌株一致;PBS組病死魚未見明顯病變,也未檢出攻毒菌株。統(tǒng)計(jì)分離菌株Et-4對(duì)黃顙魚的半致死劑量為3.9×106CFU/g,結(jié)合毒力基因檢測(cè)結(jié)果進(jìn)一步確定分離株Et-4為esaV-fimA-gadB-katB-的弱毒株。

        圖6 人工感染后黃顙魚患病癥狀Fig.6 Symptoms of P.fulvidraco after artificial infection1.頭部點(diǎn)狀出血;2.腹部腫大。

        圖7 不同實(shí)驗(yàn)組黃顙魚的存活曲線Fig.7 Survival curve of P.fulvidraco in different experimental groups

        2.7 生物被膜形成能力測(cè)定結(jié)果

        分離菌株Et-4的生物被膜形成能力測(cè)定的OD550 nm值為0.409 7,而空白組OD550 nm值僅為0.075 0,表明遲緩愛德華氏菌分離菌株Et-4具有較強(qiáng)的生物被膜形成能力。

        2.8 藥物敏感性實(shí)驗(yàn)

        2.8.1 抗菌藥物藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        采用藥敏紙片瓊脂平板擴(kuò)散法對(duì)菌株Et-4進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn),結(jié)果如表5所示,分離菌株Et-4對(duì)頭孢類藥物、慶大霉素、新霉素、卡那霉素、丁胺卡那、呋喃唑酮和多粘菌素B敏感;對(duì)米諾環(huán)素、氯霉素、頭孢哌酮中度敏感,對(duì)四環(huán)素類、青霉素類、萬古菌素、復(fù)方新諾明等13種藥物耐藥。藥敏結(jié)果表明,遲緩愛德華氏菌分離菌株Et-4為多重耐藥菌株。

        表5 抗菌藥物藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Drug susceptibility test of isolated strain Et-4

        2.8.2 Et-4耐藥基因結(jié)果

        耐藥基因檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),分離菌株Et-4攜帶耐藥基因tetA、sul1和aadA1(圖8),表明分離菌株Et-4對(duì)四環(huán)素類、磺胺類和氨基糖苷類抗菌藥物有一定的耐藥性。

        圖8 耐藥基因檢測(cè)Fig.8 Detection results of drug resistance gene of isolated strain Et-4M:2000 bp DNA Marker;2~4泳道:陰性對(duì)照;6~8泳道:Et-4。

        2.9 中藥藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        采用藥敏紙片瓊脂平板擴(kuò)散法對(duì)菌株Et-4進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn),結(jié)果如表6所示,Et-4對(duì)烏梅和丁香較為敏感,其次五倍子、生地榆、秦皮、蒲公英等中藥對(duì)菌株Et-4也有一定的抑菌效果。

        3 討論

        近年來,黃顙魚養(yǎng)殖中出現(xiàn)體表潰爛癥狀的臨床病例較多,主要由遲緩愛德華氏菌、擬態(tài)弧菌(V.miminus)、溫和氣單胞菌(A.sobria)和維氏氣單胞菌(A.veronii)等細(xì)菌感染引起[28,29]。本研究從患病黃顙魚組織中分離到的優(yōu)勢(shì)菌株經(jīng)16S rRNA基因序列鑒定為遲緩愛德華氏菌,其主要存在于病魚肝臟、腎臟和腹水中,具有一定的組織嗜性;自然發(fā)病黃顙魚和人工感染黃顙魚觀察到的臨床癥狀與PANDEY等[30]、MURWANTOKO等[31]、YANG等[32]學(xué)者所報(bào)道的一致,并且均能從肝臟、腎臟和腹水中分離到攻毒菌,證實(shí)遲緩愛德華氏菌為湖北荊州某養(yǎng)殖基地黃顙魚身體潰爛、嚴(yán)重腹水的致病菌。胡兵等[33]分離的遲鈍愛德華氏菌導(dǎo)致黃顙魚頭部出現(xiàn)“頭穿孔”的典型臨床癥狀,與本研究分離毒株感染出現(xiàn)的臨床癥狀存在顯著差異,可能與分離毒株的分布區(qū)域以及致病性有關(guān)。因此,臨床上開展黃顙魚爛身病診治時(shí),應(yīng)綜合考慮臨床癥狀、分子生物學(xué)檢測(cè)以及致病菌的毒力、耐藥性進(jìn)行針對(duì)性的治療。

        經(jīng)鑒定遲緩愛德華氏菌分離菌株Et-4不攜帶四種主要的毒力基因:esaV、fimA、gadA1和katB,這與羅非魚源遲緩愛德華氏菌天然弱毒株的毒力基因譜型相似[34]。程俊茗等[35]分離的鯽源遲緩愛德華氏菌攜帶fimA、citC、gadB、mukF、katB、esrB和sodB等7個(gè)毒力基因,與本研究分離菌株的毒力基因攜帶情況顯著不同。人工感染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),遲緩愛德華氏菌分離菌株Et-4在低劑量感染時(shí)對(duì)黃顙魚沒有明顯的致病性;當(dāng)攻毒劑量增加至1.95×106CFU/g時(shí),黃顙魚出現(xiàn)爛身、腹水等癥狀;統(tǒng)計(jì)分離株Et-4對(duì)黃顙魚的半致死劑量為3.9×106CFU/g,綜合其毒力基因型確定遲緩愛德華氏菌分離株Et-4為弱毒株。

        本研究通過藥敏試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)遲緩愛德華氏菌分離菌株Et-4對(duì)四環(huán)素類、青霉素類、萬古菌素、磺胺類的復(fù)方新諾明等13種藥物耐藥,是一株多重耐藥菌;篩查耐藥基因發(fā)現(xiàn),分離菌株Et-4攜帶耐藥基因tetA、sul1和aadA1,其對(duì)四環(huán)素類藥物的耐藥性可能與tetA基因有關(guān),對(duì)磺胺類藥物的耐藥性可能與sul1基因有關(guān),對(duì)氨基糖苷類抗菌藥物的耐藥性可能與其攜帶的aadA1耐藥基因有關(guān)。在生物被膜形成能力方面,分離株Et-4具有較強(qiáng)的生物被膜形成能力,屬于易產(chǎn)生生物被膜的細(xì)菌,這與其在藥敏試驗(yàn)中呈現(xiàn)的多重耐藥結(jié)果相符。綜合分離菌株的生物被膜能力、耐藥基因、藥物敏感性和致病性,表明分離株Et-4為多重耐藥的弱毒株,這也在一定程度上解釋了生產(chǎn)上抗生素使用時(shí)效果不佳的原因。

        本研究發(fā)現(xiàn),中藥烏梅和丁香對(duì)分離株Et-4具有較好的抑菌效果。因此,在開展遲緩愛德華氏菌防治時(shí),可考慮使用中藥烏梅、丁香、地榆和蒲公英的復(fù)方藥劑或單味中藥的有效成分。針對(duì)近年來黃顙魚的遲緩愛德華氏菌病多發(fā)的問題,養(yǎng)殖戶在生產(chǎn)上應(yīng)提升水質(zhì),改善養(yǎng)殖環(huán)境;合理調(diào)配飼料,提高黃顙魚的基礎(chǔ)免疫力;充分考慮條件致病菌的耐藥性和致病性,結(jié)合敏感抗菌藥物和中藥進(jìn)行聯(lián)合用藥和精準(zhǔn)施治。本實(shí)驗(yàn)黃顙魚源的遲緩愛德華氏菌致病性和耐藥性研究結(jié)果,可為黃顙魚遲緩愛德華氏菌感染的防控提供理論依據(jù)。

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