胡佳雯，聶志娟，鄭兆偉，李士恒，孫 毅，邵乃麟，徐鋼春，徐 跑

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，江蘇無錫 214081；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇無錫 214081；3.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306)

大口黑鱸(Micropterussalmoides)俗稱加州鱸，源產(chǎn)于北美洲，是一種肉質(zhì)鮮美、無肌間刺、生長快、適溫廣的淡水肉食性魚類[1]。從我國1983年引進(jìn)以來，其人工繁育和全程專用配套飼料研發(fā)技術(shù)不斷突破，現(xiàn)已成為國內(nèi)重要的優(yōu)質(zhì)淡水池塘養(yǎng)殖品種[2]。中國大口黑鱸養(yǎng)殖產(chǎn)量逐年遞增，據(jù)2020中國漁業(yè)統(tǒng)計(jì)，大口黑鱸年產(chǎn)量已達(dá)到47.7萬噸，僅次于羅非魚，養(yǎng)殖區(qū)域遍布華南、華東、華中、西南等區(qū)域[3]。大部分區(qū)域主要以中高密度集約化池塘養(yǎng)殖為主[4]，在養(yǎng)殖過程中大量投喂人工配合飼料，50%～80%攝食氮源、60%～75%飼料磷被作為殘餌或排泄物釋放養(yǎng)殖水體中[5-6]，易導(dǎo)致水體富營養(yǎng)化，爆發(fā)藍(lán)藻，嚴(yán)重阻礙了大口黑鱸養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。

養(yǎng)殖水體和沉積物修復(fù)可通過物理、化學(xué)和生物方法進(jìn)行。其中，生物修復(fù)因具有綠色環(huán)保、生態(tài)友好、經(jīng)濟(jì)實(shí)惠等特點(diǎn)而被廣泛認(rèn)可[7]，益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中的環(huán)境修復(fù)也受到越來越多的關(guān)注和應(yīng)用[8]。許多研究表明，養(yǎng)殖水體潑灑益生菌，可優(yōu)化水體菌群結(jié)構(gòu)，從源頭上降低養(yǎng)殖水體中氨氮、亞硝酸鹽等有毒害物質(zhì)的含量，營造良好的水域生態(tài)系統(tǒng)環(huán)境[9-13]。而生態(tài)環(huán)境改善，有利于菌群結(jié)構(gòu)的多樣性和穩(wěn)定性[14]。EM復(fù)合益生菌為一種混合菌，一般包括光合菌、酵母菌、乳酸菌等有益菌類，可調(diào)控水體微生物結(jié)構(gòu)，減少病原菌，平衡微生態(tài)，提高水產(chǎn)動(dòng)物免疫力。李士恒等[15]采用EM復(fù)合益生菌開展對蟹鱸混養(yǎng)模式下養(yǎng)殖水體菌群結(jié)構(gòu)的影響研究，發(fā)現(xiàn)EM復(fù)合益生菌能夠優(yōu)化菌群結(jié)構(gòu)，具有顯著的水體原位修復(fù)功能。本實(shí)驗(yàn)以此為基礎(chǔ)進(jìn)行拓展研究，延長實(shí)驗(yàn)周期，探究EM復(fù)合益生菌對大口黑鱸池塘養(yǎng)殖水體原位修復(fù)效果，及其對養(yǎng)殖水體菌群結(jié)構(gòu)的影響，以期為益生復(fù)合菌合理科學(xué)使用提供指導(dǎo)，促進(jìn)我國大口黑鱸池塘養(yǎng)殖業(yè)的長期可持續(xù)發(fā)展。

1 材料方法

1.1 材料方法

養(yǎng)殖大口黑鱸購自安徽張林漁業(yè)有限公司；EM復(fù)合益生菌購自江蘇恒泰環(huán)?？萍及l(fā)展有限公司，(pH 3.0～4.0；菌種類數(shù)>80；總菌數(shù)≥107CFU/mL；乳酸菌數(shù)1.0×106～107CFU/mL；酵母菌數(shù)1.0×104～105CFU/mL；光合菌數(shù)(1.0～2.0)×103CFU/mL；放線菌數(shù)(1.0～3.0)×103CFU/mL)。

實(shí)驗(yàn)于中國水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心揚(yáng)中基地開展，單個(gè)養(yǎng)殖池塘面積為1 666.7 m2，水深2 m。實(shí)驗(yàn)分為EM鱸實(shí)驗(yàn)組(EL)和鱸對照組(L)，每組設(shè)三個(gè)重復(fù)。鱸放養(yǎng)時(shí)間為2020年4月2號(hào)，放養(yǎng)規(guī)格為184 g/尾，放養(yǎng)密度為1 500尾/666.7 m2。養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)期間，每天投喂兩次，投喂量為鱸體質(zhì)量的3%～5%。實(shí)驗(yàn)開始后，實(shí)驗(yàn)組池塘每10 d按500 g/667 m2比例進(jìn)行EM潑灑。每個(gè)養(yǎng)殖池塘均配備微孔增氧機(jī)，夜間開啟增氧設(shè)備，溶解氧維持在6～8 mg/L。

1.2 樣品的采集和處理

1.3 樣品DNA提取及PCR擴(kuò)增

取3 L混勻水樣，在4 ℃、12 000 r/min的條件下離心30 min，取沉淀放于離心管中用于后續(xù)DNA提取。根據(jù)E.Z.N.A.?soil試劑盒(Omega Bio-tek，Norcross，GA，U.S.)抽提總DNA，通過NanoDrop 2000檢測DNA的濃度和純度，以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量；用338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACH VG GG TW TCTAAT-3′)引物[15]對細(xì)菌16S rRNA基因的V3-V4可變區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共計(jì)27個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)體系為(20 μL)：4 μL 5×FastPfu緩沖液、2 μL 2.5 mmol/L dNTPs、0.8 μL引物(5 μmol/L)、0.4 μL FastPfu聚合酶；10 ng DNA模板。

1.4 Illumina Miseq測序

PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠回收，利用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen，U.S.)進(jìn)行純化，三(羥甲基)氨基甲烷(Tris-HCl)洗脫，2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并通過QuantiFluorTM-ST(Promega，U.S.)進(jìn)行定量檢測。根據(jù)Illumina MiSeq平臺(tái)(Illumina，SanDiego，USA)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程將純化后的擴(kuò)增片段構(gòu)建測序文庫，然后利用Illumina公司的Miseq PE300平臺(tái)進(jìn)行高通量測序(上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

原始測序序列用Trimmomatic軟件質(zhì)控，通過FLASH軟件進(jìn)行拼接：首先設(shè)置50 bp的窗口，當(dāng)窗口內(nèi)的平均質(zhì)量低于20 bp時(shí)，從窗口前端位置截去該堿基后端所有序列，再去除質(zhì)控后長度低于50 bp的序列；根據(jù)重疊堿基overlap，將兩端序列拼接，長度要大于10 bp，overlap間的最大錯(cuò)配率為0.2；根據(jù)序列首尾兩端的barcode及引物將序列拆分到每個(gè)樣本，barcode匹配需精確，引物可有2 個(gè)堿基的容錯(cuò)，除去模糊堿基序列。使用UPARSE 軟件，以97%的相似度水平對序列進(jìn)行OTU聚類。使用雙因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，(P<0.05)認(rèn)為差異顯著；水體理化指標(biāo)、微生物多樣性指數(shù)及主要菌屬的相對豐度間的差異通過上海美吉云平臺(tái)軟件分析。

2 結(jié)果

2.1 水質(zhì)指標(biāo)

水質(zhì)測定結(jié)果顯示(表2)：Ⅰ期和Ⅱ期亞硝酸氮含量較低，無顯著差異，但在Ⅲ期EL組亞硝酸氮含量顯著低于L組；硝酸氮含量在Ⅰ期和Ⅱ期實(shí)驗(yàn)組顯著高于對照組，但Ⅲ期和Ⅳ期顯著低于對照組；EL組總氮含量在Ⅰ期顯著低于L組，其它時(shí)期無顯著差異；EL組總磷含量在Ⅱ期、Ⅲ期、Ⅳ期顯著高于L組，Ⅰ期差異不顯著；氨氮指標(biāo)在整個(gè)測定期無顯著差異。

2.2 菌群多樣性特征

測序結(jié)果顯示為24個(gè)樣品的有效序列數(shù)共1 011 929條，有效序列的平均長度為416 bp，以97%相似水平對測序樣品進(jìn)行OTU劃分，可分為1 372個(gè)OTU，物種注釋結(jié)果顯示共26個(gè)門，76個(gè)綱，190個(gè)目，318個(gè)科，555個(gè)屬，857個(gè)種。顯示菌群豐富度的Chao指數(shù)在4個(gè)采樣期無代表意義的顯著差異，而多樣性pd指數(shù)顯示較多顯著差異(圖1)。其中，EL組在Ⅰ期pd指數(shù)顯著低于對照組，而在Ⅲ期pd指數(shù)極其顯著高于對照組。從Ⅱ期開始，隨著采樣月份的增長，EL組和L組水體pd多樣性指數(shù)不斷增加，說明養(yǎng)殖期不同月份溫度氣候差異等因素對養(yǎng)殖水體微生物多樣性組成存在影響。

圖1 樣品中細(xì)菌豐富性和多樣性Fig.1 Richness and diversity of becteria in samples A：Chao指數(shù)；B：Pd指數(shù)；*代表0.01≤P≤0.05；**代表0.001≤P≤0.01；***代表P≤0.001

基于屬水平PCoA分析(圖2)結(jié)果顯示，橫軸(PC1)貢獻(xiàn)度為34.2%，縱軸(PC2)貢獻(xiàn)度為20.72%。EL組與L組在不同月份其水體菌群結(jié)構(gòu)組成上存在顯著差異，距離較遠(yuǎn)，但在I期和Ⅱ期，同一采樣期實(shí)驗(yàn)組和對照組樣品距離較近，而在Ⅲ期，兩組樣品距離則較遠(yuǎn)。

圖2 基于屬水平的主坐標(biāo)分析結(jié)果Fig.2 Result of principal co-ordinates analysis(PCoA)based on the genus level

2.3 菌群結(jié)構(gòu)組成

樣本在門水平的物種組成結(jié)構(gòu)(圖3)結(jié)果顯示，在實(shí)驗(yàn)開始(I期)，實(shí)驗(yàn)組與對照組優(yōu)勢菌門(豐度大于1%)都為擬桿菌、變形菌、放線菌、藍(lán)細(xì)菌、Verrucomicrobiota。在Ⅱ期，實(shí)驗(yàn)組絕對優(yōu)勢菌為變形菌(43.98%)，高于對照組(30.76%)，厚壁菌門為對照組的絕對優(yōu)勢菌豐度為46.22%，高于實(shí)驗(yàn)組(1.56%)。在Ⅲ期和Ⅳ期，實(shí)驗(yàn)組的豐度最高菌為擬桿菌，豐度分別為42.07%、38.52%；而對照組豐度最高菌為放線菌，豐度分別為71.83%%、31.37%；此外，放線菌在實(shí)驗(yàn)組為優(yōu)勢菌，分別為23.65%、26.34%；而擬桿菌在對照組含量豐度相對低，為2.22%、19.28%。變形菌在養(yǎng)殖水體整個(gè)采樣期都為優(yōu)勢菌，在實(shí)驗(yàn)組(20.25%～43.98%)，對照組(14.77%～30.76%)；綠彎菌僅在養(yǎng)殖后期(Ⅲ期和Ⅳ期)豐度增加，高于1%，實(shí)驗(yàn)組分別為2.18%、2.31%，對照組分別為3.48%、13.21%；藍(lán)細(xì)菌在實(shí)驗(yàn)組的養(yǎng)殖前期豐度較大，但在后期(Ⅲ期和Ⅳ期)豐度小于1%，而在對照組整個(gè)采樣期都為豐度大于1%的優(yōu)勢菌門出現(xiàn)，說明添加EM菌可以改變影響?zhàn)B殖水體的菌群結(jié)構(gòu)，且對藍(lán)藻有一定的控制和抑制效應(yīng)。

圖3 基于門水平的細(xì)菌組成結(jié)構(gòu)Fig.3 The microbiota composition at Phylum level

水體微生物群落豐度大于1%的菌屬如圖4所示，在實(shí)驗(yàn)前期(Ⅰ期和Ⅱ期)，同一月份的實(shí)驗(yàn)組和對照組聚為一類，在實(shí)驗(yàn)后期(Ⅲ期和Ⅳ期)，實(shí)驗(yàn)組聚為一類，這和PCoA分析結(jié)果一致。水體中的主要菌屬為Dinghuibacter、norank-f-norank-o-chloroplast、分支桿菌屬(Mycobacterium)、黃桿菌屬(Flavobacterium)等，實(shí)驗(yàn)組Ⅰ期最優(yōu)勢菌屬為黃桿菌屬(35.57%)，Ⅱ期norank-f-norank-o-chloroplast(37.86%)，Ⅲ期和Ⅳ期皆為Dinghuibacter(40.18%～32.87%)；對照組Ⅰ期最優(yōu)勢菌屬為黃桿菌屬(8.52%)，Ⅱ期微小桿菌屬(Exiguobacterium40.44%)，Ⅲ期CL500-29-marine-group(26.74%)，Ⅳ期Dinghuibacter(15.06%)。Dinghuibacter主要存在于實(shí)驗(yàn)組Ⅲ期和Ⅳ期，而對照組主要為分支桿菌屬，黃桿菌屬主要存在于實(shí)驗(yàn)組和對照組的Ⅰ期水體中，在其余時(shí)期皆低于1%。

圖4 兩種處理下的優(yōu)勢菌屬熱圖Fig.4 Heatmap of dominant bacteria at the genus level under the two treatments

2.4 菌群差異分析

所有樣品進(jìn)行菌屬差異分析，顯著差異菌屬主要為Dinghuibacter、分支桿菌屬、黃桿菌屬、微小桿菌屬、酸化菌屬(Acidibacter)(圖5)。將這5種差異菌屬在同一采樣期進(jìn)行單獨(dú)差異分析顯示，Dinghuibacter豐度在實(shí)驗(yàn)開始(Ⅰ期)兩組含量都較低，且實(shí)驗(yàn)組極顯著低于對照組，但在之后實(shí)驗(yàn)期(Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ)實(shí)驗(yàn)組中豐度明顯增加，豐度都顯著高于對照組；黃桿菌屬(Flavobacterium)實(shí)驗(yàn)開始(Ⅰ期)含量高，在實(shí)驗(yàn)組極顯著高于對照組，但在之后實(shí)驗(yàn)期實(shí)驗(yàn)組中豐度明顯降低；微小桿菌屬顯示有差異，但在兩組同一時(shí)期單獨(dú)分析顯示結(jié)果為差異不顯著；實(shí)驗(yàn)前期，分支桿菌屬差異不顯著，但在Ⅲ期和Ⅳ期，對照組水體中分支桿菌屬相對豐度極顯著高于實(shí)驗(yàn)組。

2.5 菌群與水質(zhì)理化因子相關(guān)性

圖6 優(yōu)勢菌屬與水質(zhì)理化因子之間的RDA分析Fig.6 RDA bioplot of water environment factors and differential microorganismsB1：Dinghuibacter；B2：Mycobacterium；B3：Flavobacterium；B4：norank_f_norank_o_chloroplast；B5：Exiguobacterium；B6：CL500_29_marine-group；B7：Acidibacter；B8：Norank_f_Rhizobiales_Incertae_Sedis

3 討論

水質(zhì)的優(yōu)劣是衡量水產(chǎn)養(yǎng)殖特別是集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖成敗的關(guān)鍵，加強(qiáng)對池塘養(yǎng)殖水質(zhì)的凈化，已成為社會(huì)和養(yǎng)殖系統(tǒng)本身關(guān)注的重要問題，也是池塘養(yǎng)殖可持續(xù)發(fā)展的迫切需要[14]。微生物修復(fù)已被廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖水體的調(diào)控凈化[15]。微生物修復(fù)即為有益微生物的凈水生態(tài)過程，通過菌群分泌的各種酶將養(yǎng)殖水體中不斷產(chǎn)生的殘余餌料、排泄物等有機(jī)物，通過其氧化、氨化、反硝化、解磷、硫化、固氮等作用迅速分解，有效降低水體氨氮和亞硝酸鹽等有害物質(zhì)的濃度[17]。水質(zhì)凈化是一系列生物化學(xué)反應(yīng)，單一菌種微生物在控制、凈化水質(zhì)方面都有一定的局限性[18-19]。趙留群等[20]得出內(nèi)含芽孢桿菌、釀酒酵母、植物乳桿菌、光合細(xì)菌的EM菌改善水質(zhì)的效果優(yōu)于單一的芽孢桿菌與海洋紅酵母。陳紅菊等[21]將篩選的氨氮降解菌用于養(yǎng)殖水體水質(zhì)調(diào)控，具有明顯的降氨氮特性，并能有效增加藻類數(shù)量，但對亞硝酸鹽降解效果不顯著。因此實(shí)際應(yīng)用中，往往需要多種菌組合的復(fù)合有益菌參與共同發(fā)揮作用，改善水質(zhì)，維持水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境的生態(tài)平衡[22]。本研究采用日本比嘉照夫發(fā)明的包含乳酸菌、酵母菌、光合菌和放線菌4大類為主的EM復(fù)合益生菌，在三個(gè)月試驗(yàn)期，顯著增加水體微生物多樣性，顯著降低水體亞硝酸的含量，而課題組李士恒等[15]研究得出，在一個(gè)月四次采樣后期顯著降低氨氮，但是亞硝酸鹽降解效果不顯著，說明養(yǎng)殖水體微生物修復(fù)需要一定的效應(yīng)期，需長期合理使用復(fù)合益生菌。

復(fù)合益生菌對水體菌群的影響相對復(fù)雜，也容易受到外界氣溫等環(huán)境條件變化的限制[23-24]。本研究中，加州鱸魚養(yǎng)殖水體的菌群結(jié)構(gòu)在不同月份，同一月份不同處理組都發(fā)生變化。I期和Ⅱ期，同一月份采樣樣品距離較近，試驗(yàn)前期環(huán)境的變化對水體菌群相比較EM菌的添加影響更大，但養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)后期(Ⅲ期和Ⅳ期)EM實(shí)驗(yàn)組樣品間相比對照組距離更近，且樣品間重疊，說明合理使用EM菌一段時(shí)間可以穩(wěn)定養(yǎng)殖池溏的菌群結(jié)構(gòu)。菌群結(jié)構(gòu)顯示，在一個(gè)月實(shí)驗(yàn)期后(Ⅱ期)，厚壁菌門在實(shí)驗(yàn)組的含量(1.56%)顯著低于對照組(46.22%)。表明復(fù)合益生菌中的一些菌或者分泌的產(chǎn)物可能對水體本身的厚壁菌有競爭性或抑制效果，導(dǎo)致厚壁菌顯著變少，這一結(jié)果和鄭佳佳[25]研究復(fù)合益生菌對草魚養(yǎng)殖水體水質(zhì)和菌群結(jié)構(gòu)的影響一致，且其厚壁菌減少更多，為91.21%。在Ⅲ期和Ⅳ期，實(shí)驗(yàn)組的豐度最高菌為擬桿菌(42.07%、38.52%)，顯著高于對照組(2.22%、19.28%)，根據(jù)WAGNER[26]等關(guān)于廢水生物處理反應(yīng)器中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的研究，擬桿菌一直是廢水處理系統(tǒng)中的最優(yōu)勢類群。擬桿菌是藻類衍生碳水化合物最主要的分解者，除此之外還可分解蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等復(fù)雜結(jié)構(gòu)營養(yǎng)物質(zhì)，水體中擬桿菌的存在可積極推動(dòng)水體碳和營養(yǎng)循環(huán)。其中實(shí)驗(yàn)組中擬桿菌主要為Dinghuibacter(40.18%～32.87%)，隸屬于Chitinophagaceae科，李繼兵[27]應(yīng)用DNA的穩(wěn)定同位素探針(DNA-SIP)和高通量測序技術(shù)首次證實(shí)Chitinophagaceae對菲有降解能力。此外，Dinghuibacter也是調(diào)節(jié)小龍蝦腸道和養(yǎng)殖水體重要的關(guān)鍵菌屬[28]。在Ⅲ期和Ⅳ期，復(fù)合益生菌的使用極顯著降低了養(yǎng)殖水體中分支桿菌屬相對豐度(P≤0.001)，分支桿菌多數(shù)為致病菌，通過浸泡的方式可致條紋鱸、鱘魚、斑馬魚等水生動(dòng)物感染[29-32]，嚴(yán)重可產(chǎn)生爆發(fā)性死亡。

4 結(jié)論

綜上所述，在傳統(tǒng)養(yǎng)殖池塘長期定期潑灑復(fù)合益生菌，可降低水體亞硝酸鹽，改善養(yǎng)殖水體水質(zhì)，增加水體微生物物種多樣性，調(diào)節(jié)水體菌群結(jié)構(gòu)，減少致病菌群的豐度，使養(yǎng)殖水體的生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定性有所提高。復(fù)合有效微生物減少池塘養(yǎng)殖的負(fù)荷，利于養(yǎng)殖水體的原位修復(fù)，應(yīng)大力推廣，促進(jìn)池塘養(yǎng)殖可持續(xù)綠色發(fā)展。