梅小平 姚明 周清河 許瀏 周鴻鯤 李彥

肝細(xì)胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）發(fā)病率和死亡率高，是我國最常見的惡性腫瘤之一。HCC起病隱匿，早期多無典型癥狀，臨床發(fā)現(xiàn)時(shí)多已進(jìn)入腫瘤中晚期，錯(cuò)過了可行根治性手術(shù)的最佳時(shí)機(jī)。即便接受了手術(shù)切除，HCC患者5年生存率仍較低［1］。CRNDE（Colorectal neoplasia differentially expressed）具有組織表達(dá)特異性，參與了多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程，是腫瘤的潛在治療靶點(diǎn)［2］。CDK6（cyclin-dependent kinase 6）是影響細(xì)胞周期的重要蛋白之一，CDK6過表達(dá)可通過多種方式促進(jìn)HCC的增殖，是細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的“中心節(jié)點(diǎn)”［3］。通過生物信息學(xué)分析，作者發(fā)現(xiàn)miR-33a-5p與CRNDE及CDK6均有潛在的結(jié)合位點(diǎn)［4］。本研究通過探討CRNDE介導(dǎo)miR-33a-5p/CDK6軸影響細(xì)胞周期調(diào)控人體肝癌細(xì)胞增殖的作用機(jī)制，發(fā)現(xiàn)CRNDE能通過靶向調(diào)節(jié)作用抑制miR-33a-5p的表達(dá)，進(jìn)而介導(dǎo)CDK6的升高，促進(jìn)肝細(xì)胞肝癌的增殖，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 HL-7702人體肝細(xì)胞株和HuH-7人體肝癌細(xì)胞株均購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。細(xì)胞株按期進(jìn)行傳代，維持指數(shù)生長(zhǎng)。構(gòu)建穩(wěn)定干擾CRNDE/低表達(dá)CRNDE人體肝癌細(xì)胞模型。正義鏈按5′→3′順序序列為：酶切位點(diǎn)（Xho I）、干擾序列（21bp）、loop環(huán)（TTCAAGAGA）、干擾序列的反向序列、終止信號(hào)（TTTTTT）；反義鏈按5′→3′順序序列為：酶切位點(diǎn)（BamH I）、終止序列的序列（AAAAAA）、干擾序列（21bp）、環(huán)路環(huán)的序列（TCTCTTGAA）和干擾序列的反向序列。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組 HL-7702人體肝細(xì)胞組、HuH-7人體肝癌細(xì)胞組及穩(wěn)定干擾CRNDE/低表達(dá)CRNDE人體肝癌細(xì)胞shRNA-CRNDE-HuH-7組。

1.3 RT-qPCR及Western blotting檢測(cè)HL-7702細(xì)胞株、HuH-7細(xì)胞株 shRNA-CRNDE-HuH-細(xì)胞株中CRNDE、miR-33a-5p及CDK6 mRNA的表達(dá)情況 （1）細(xì)胞RNA提取和實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-qPCR）：總RNA提取使用SYBR? Green Realtime PCR Master Mix反應(yīng)系統(tǒng)。在PCR擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后繪制溶解曲線，Ct值的獲取采用MJ Opticon Monitor2.5分析軟件進(jìn)行計(jì)算，最后以GAPDH mRNA作為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化核算，計(jì)算標(biāo)本中各RNA相對(duì)表達(dá)量。（2）Western blotting分析：總蛋白提取，BCA法測(cè)定蛋白濃度，采用超敏型ECL化學(xué)發(fā)光顯色試劑對(duì)其進(jìn)行顯色，使用UVP凝膠成像儀檢測(cè)其蛋白灰度并成像。

1.4 對(duì)HL-7702細(xì)胞株、HuH-7細(xì)胞株及shRNACRNDE-HuH-7細(xì)胞株分別進(jìn)行細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) CCK8（收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測(cè)在450 nm處 24 h、48 h、72 h OD值）；細(xì)胞凋亡檢測(cè)（收集細(xì)胞懸液，重懸于Binging Buffer，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，NovoExpressTM分析軟件進(jìn)行分析）；細(xì)胞侵襲測(cè)試（采用Transwell檢測(cè)，通過細(xì)胞血清饑餓、接種消化、染色等步驟后，顯微鏡觀察細(xì)胞數(shù)/視野）；細(xì)胞周期檢測(cè)（收集細(xì)胞懸液，加入碘化丙啶，通過流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)量細(xì)胞DNA含量，確定每個(gè)細(xì)胞周期中細(xì)胞的比例，NovoExpressTM分析軟件進(jìn)行分析）。通過上述方法評(píng)估在不同CRNDE表達(dá)情況下個(gè)別細(xì)胞株增殖、凋亡、侵襲能力及細(xì)胞周期的變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件包。計(jì)量資料以（）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 穩(wěn)定干擾CRNDE/低表達(dá)CRNDE人體肝癌細(xì)胞株構(gòu)建檢測(cè) RT-qPCR 檢測(cè)結(jié)果顯示：shRNA-CRNDEHuH-7細(xì)胞株中CRNDE表達(dá)量（1.081±0.141）相比HuH-7細(xì)胞株（3.014±0.361）減少，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1；Western blotting檢測(cè)結(jié)果同以上結(jié)論。由此說明穩(wěn)定干擾CRNDE/低表達(dá)CRNDE的shRNA-CRNDE-HuH-7人體肝癌細(xì)胞株的構(gòu)建成功。

圖1 RT-qPCR檢測(cè)shRNA-CRNDE-HuH-7及HuH-7組CRNDE基因表達(dá)

2.2 HL-7702、shRNA-CRNDE-HuH-7及HuH-7三組細(xì)胞株中CRNDE、miR-33a-5p及CDK6的表達(dá)情況及相關(guān)性分析 RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果見表1；Western blotting檢測(cè)結(jié)果同以上結(jié)論，見圖2。當(dāng)控制位點(diǎn)為CDK6時(shí)，HL-7702、shRNA-CRNDE-HuH-7及HuH-7三組細(xì)胞株中CRNDE表達(dá)量與其呈正相關(guān)（r=0.856，P＜0.05；）；當(dāng)控制位點(diǎn)為miR-33a-5p時(shí)，三組細(xì)胞株中miR-33a-5p表達(dá)量與CDK6及CRNDE均呈負(fù)相關(guān)（r=-0.883，P＜0.05；r=-0.937，P＜0.05）。

表1 三組細(xì)胞株RT-qPCR 檢測(cè)結(jié)果分析（）

表1 三組細(xì)胞株RT-qPCR 檢測(cè)結(jié)果分析（）

組別CRNDEmiR-33a-5pCDK6 HL-77020.798±0.2133.014±0.3610.992±0.227 shRNA-CRNDE-HuH-71.081±0.1412.211±0.3431.981±0.276 HuH-73.014±0.3611.081±0.1413.021±0.303 t值2.7662.6982.031 P值0.0090.0090.027

圖2 Western blotting檢測(cè)三組細(xì)胞株CRNDE、miR-33a-5p及CDK6表達(dá)情況。

2.3 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 采用CCK8法分別檢測(cè)24 h、48 h、72 h OD值，繪制生長(zhǎng)曲線，檢測(cè)結(jié)果顯示：HuH-7組細(xì)胞增殖能力顯著，shRNA-CRNDE-HuH-7細(xì)胞增殖能力明顯受到抑制，基本與HL-7702組細(xì)胞增殖曲線重合，見圖3A；shRNA-CRNDE-HuH-7組24 h、48 h及72 h相對(duì)OD值與HL-7702組接近，但明顯低于HuH-7組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3B。

圖3 CCK8法檢測(cè)三組細(xì)胞聲勢(shì)浩大細(xì)胞增殖能力（*P＜0.05）

2.4 Transwell測(cè)定法檢測(cè) shRNA-CRNDE-HuH-7細(xì)胞株遷移及侵襲能力，相比HuH-7組，shRNA-CRNDEHuH-7組細(xì)胞數(shù)明顯減少，基本接近于HL-7702組細(xì)胞數(shù)，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明shRNACRNDE-HuH-7細(xì)胞株相比HuH-7細(xì)胞株遷移及侵襲能力明顯下降，見圖4。

圖4 Transwell 測(cè)定法檢測(cè)三組細(xì)胞株遷移及侵襲能力（*P＜0.05）

2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 三組細(xì)胞株凋亡率分別為：HL-7702組33.19%±6.14%，shRNA-CRNDE-HuH-7組23.26%±4.86%，HuH-7組14.21%±3.92%。通過單因素方差分析統(tǒng)計(jì)，三組細(xì)胞株凋亡率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=34.219，P＜0.001），表明三組間細(xì)胞計(jì)數(shù)差異不同或不完全相同，進(jìn)一步組間兩兩比較q檢驗(yàn)：三組細(xì)胞凋亡率在不同欄，表明P值均＜0.05，說明三組間細(xì)胞凋亡率兩兩比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。流式細(xì)胞儀檢測(cè)三組細(xì)胞株，觀察CRNDE低表達(dá)對(duì)肝癌細(xì)胞周期影響，結(jié)果顯示，shRNA-CRNDE-HuH-7組G1期細(xì)胞比例增加，S期和G2期細(xì)胞比例減少，相比HuH-7組有明顯差異（P＜0.05），見圖5，說明CRNDE低表達(dá)抑制了細(xì)胞從G1期向S期和G2期的轉(zhuǎn)變。

圖5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)下調(diào)CRNDE對(duì)HuH-7細(xì)胞株細(xì)胞周期影響（*P＜0.05）

3 討論

CRNDE最早在結(jié)直腸惡性腫瘤的研究中被發(fā)現(xiàn)存在差異表達(dá)，可參與染色質(zhì)的表觀遺傳學(xué)調(diào)控［5］。隨著研究的進(jìn)展，GRNDE被發(fā)現(xiàn)可通過多種方式調(diào)控腫瘤的進(jìn)展，尤其是通過調(diào)節(jié)組蛋白甲基化狀態(tài)來影響相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，影響腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，起到了促進(jìn)腫瘤增殖的作用［6］。為探究CRNDE對(duì)人原發(fā)性肝癌細(xì)胞的影響，作者對(duì)人原發(fā)性肝癌細(xì)胞（Huh-7細(xì)胞株）CRNDE的表達(dá)進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)對(duì)比正常人體肝細(xì)胞（HL-7702細(xì)胞株），其表達(dá)量明顯增加。同時(shí)，利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)，沉默CRNDE的表達(dá)，作者構(gòu)建了CRNDE低表達(dá)的shRNA-CRNDE-HuH-7細(xì)胞株，發(fā)現(xiàn)其細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力相比Huh-7細(xì)胞株明顯下降。以上結(jié)果均表明CRNDE在人體肝癌中的高表達(dá)，促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生或發(fā)展。

為了進(jìn)一步探究CRNDE促進(jìn)肝癌增殖的機(jī)制及可能的下游靶基因，作者查閱相關(guān)文獻(xiàn)，ZHANG C等［7］通過生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-33a-5p可能是CRNDE及CDK6的潛在靶點(diǎn)。為了明確三者之間可能的關(guān)系，作者對(duì)其進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，CRNDE的表達(dá)與CDK6呈正相關(guān)（P＜0.05），而miR-33a-5p與CDK6及CRNDE均存在顯著的負(fù)相關(guān)性（P＜0.05），從側(cè)面驗(yàn)證了CRNDE可介導(dǎo)miR-33a-5p/CDK6軸的假說。

CDK6屬于細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（cyclindependent kinases，CDKs）家族成員，是細(xì)胞周期調(diào)控機(jī)制的最核心成員之一［8］。近年來，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，CDK6在惡性腫瘤中過表達(dá)并與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，被稱為細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)的“中心節(jié)點(diǎn)”。miRNA-33a是一種位于甾醇反應(yīng)元件結(jié)合蛋白基因（sequences of the sterol-response-element-binding protein gene，SREBF2）內(nèi)含子序列中的內(nèi)含子miRNA，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。WU等［9］發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌組織中，miRNA-33a的下調(diào)與淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)，其過表達(dá)可顯著降低細(xì)胞增殖和侵襲，抑制腫瘤生長(zhǎng)和肺轉(zhuǎn)移。HAN等［10］也發(fā)現(xiàn)，miRNA-33a-5p的下調(diào)與HCC轉(zhuǎn)移和生存不良顯著相關(guān)，低表達(dá)的miRNA-33a-5p預(yù)示較低的5年生存率及早期復(fù)發(fā)率。本研究結(jié)果也支持上述觀點(diǎn)，miRNA-33a-5p的表達(dá)在HL-7702、shRNACRNDE-HuH-7及HL-7702三組細(xì)胞株中逐漸下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而在CCK8、Transwell及流式細(xì)胞儀等檢測(cè)中，此三組細(xì)胞株的增殖、遷移、侵襲能力卻逐步增強(qiáng)，說明miRNA-33a-5p的低表達(dá)與人原發(fā)性肝癌的進(jìn)展及預(yù)后密切相關(guān)。

本研究中RT-qPCR及Western blotting結(jié)果顯示，Huh-7細(xì)胞株中miR-33a-5p為低表達(dá)，而通過慢病毒轉(zhuǎn)染CRNDE低表達(dá)的shRNA-CRNDE-HuH-7細(xì)胞株及HL-7702細(xì)胞株中miR-33a-5p的表達(dá)卻顯著上調(diào)（P＜0.05）。同時(shí)有研究［11］顯示，在人結(jié)直腸癌細(xì)胞雙熒光酶素實(shí)驗(yàn)中，CRNDE與miR-33a-5p能有效結(jié)合，抑制腫瘤增殖，使野生型CRNDE結(jié)合的熒光信號(hào)顯著降低，這與本研究中通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染沉默Huh-7細(xì)胞株CRNDE的效果相同。為了進(jìn)一步驗(yàn)證 miR-33a-5p與CDK6 間存在靶向關(guān)系。本研究通過RT-qPCR及Western blotting檢測(cè)，結(jié)果顯示Huh-7細(xì)胞株中CDK6的表達(dá)顯著升高，而沉默CRNDE或過表達(dá)miR-33a-5p后的shRNA-CRNDE-HuH-7及HL-7702細(xì)胞株中CDK6的表達(dá)逐級(jí)下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明CRNDE是miRNA-33a-5p的上游基因，而CDK6處于CRNDE及miR-33a-5p的下游，且miR-33a-5p與CDK6間存在靶向關(guān)系。

綜上所述，CRNDE能通過靶向調(diào)節(jié)作用抑制miR-33a-5p的表達(dá)，進(jìn)而介導(dǎo)CDK6的升高，可能通過CRNDE/miRNA-33a-5p/CDK6軸促進(jìn)肝癌增殖，其腫瘤生物學(xué)行為主要表現(xiàn)在影響腫瘤細(xì)胞周期的增殖調(diào)控上。作者預(yù)測(cè)CRNDE很可能成為人體肝細(xì)胞肝癌新的腫瘤標(biāo)志物和分子生物治療靶點(diǎn)。