岳靜 陳雪琴 程卓安

據(jù)最新癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)，肺癌仍是全球癌癥死亡的主要原因［1］。肺癌中80%～85%的分型為非小細(xì)胞肺癌（Non-small cell lung cancer，NSCLC），而肺腺癌和肺鱗狀細(xì)胞癌（簡稱肺鱗癌）是NSCLC中的兩種主要組織學(xué)亞型。長非編碼RNA（long non- coding RNA，lncRNA）是一類長度＞200個核苷酸的非編碼RNA（non- coding RNA，ncRNA），其表達(dá)具有細(xì)胞和組織特異性［2］，并且參與調(diào)控多種癌癥增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移等過程［3］，在NSCLC發(fā)生、發(fā)展中也起著關(guān)鍵作用［4］，然而，只有少數(shù)lncRNA被鑒定出來，大多數(shù)lncRNA在癌癥中的作用尚不清楚，lncRNA與NSCLC的相關(guān)性有待進(jìn)一步研究。本課題組前期通過基因芯片篩選出了一個在NSCLC組織中異常表達(dá)的lncRNA LOC344887，又名NMRAL2P（NmrA like redox sensor 2），長度共1813bp，其在腫瘤中尤其是NSCLC中的表達(dá)和作用尚未闡明。本研究通過分析LOC344887在NSCLC組織中的表達(dá)及其與NSCLC預(yù)后的關(guān)系，并通過構(gòu)建敲低LOC344887的NSCLC細(xì)胞模型，探討LOC344887調(diào)節(jié)NSCLC細(xì)胞生長的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料及設(shè)備 （1）細(xì)胞系：人肺鱗癌細(xì)胞系NCI-H2170購自美國ATCC細(xì)胞保藏中心。（2）主要試劑與設(shè)備：Trizol（15596026CN）和LipofectamineTM 3000轉(zhuǎn)染試劑（L3000015）購自美國Invitrogen公司；PrimeScriptTM RT Master Mix RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（RR036A）與TB Green（RR420A）購自日本寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基（11875093）、FBS（10099-141）均購自美國Gibco公司；引物由上海生工生物工程有限公司合成；小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）及陰性對照siRNA均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；4%多聚甲醛溶液（P0099）、結(jié)晶紫染色液（C0121）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；CCK-8試劑盒（CK04）購自日本Dojindo公司；PI/RNase細(xì)胞周期染色液（550825）購自美國BD Bioscience公司。實時熒光定量PCR（ABI7500）儀購自美國ABI公司；酶標(biāo)儀（SpectraMax i3）購自美國Molecular Devices公司；流式細(xì)胞儀（CytoFLEX S）購自美國Beckman公司。

1.2 實驗方法 （1）生物信息學(xué)分析：檢索ENCORI數(shù)據(jù)庫中LOC344887相關(guān)數(shù)據(jù)，共納入526例肺腺癌樣本及對應(yīng)的59例正常樣本，501例肺鱗癌樣本及對應(yīng)的49例正常樣本，分別比較LOC344887在NSCLC樣本與正常樣本中表達(dá)水平的差異。收集公開的癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫中NSCLC相關(guān)的基因芯片數(shù)據(jù)，根據(jù)LOC344887表達(dá)水平的中位數(shù)進(jìn)行分組，高于中位數(shù)者為LOC344887高表達(dá)組，低于中位數(shù)者為LOC344887低表達(dá)組，采用Kaplan-Meier繪制生存率曲線，分析LOC344887表達(dá)水平與NSCLC患者總生存率的關(guān)系。（2）細(xì)胞培養(yǎng)：人肺鱗癌細(xì)胞系NCI-H2170培養(yǎng)于添加10% FBS、1%青鏈霉素的RPMI1640完全培養(yǎng)基中，并置于37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。（3）siRNA轉(zhuǎn)染：按照2×105個細(xì)胞/孔的濃度接種NCI-H2170細(xì)胞至6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑操作說明分別轉(zhuǎn)染靶向敲低LOC344887的siRNA（si-LOC344887）及對照組siRNA（si-Control）至細(xì)胞中。si-LOC344887序列如下，正義鏈：5’-GCAGUACGGGAAGGAGAUUTT-3’，反義鏈：5’-AAUCUCCUUCCCGUACUGCTT-3’。（4）實時熒光定量PCR：使用Trizol試劑提取LOC344887敲低組及對照組的細(xì)胞總RNA，根據(jù)RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后采用TB Green進(jìn)行實時熒光定量PCR檢測LOC344887的mRNA水平，以β-actin為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)化LOC344887的表達(dá)。相關(guān)引物序列如下，LOC344887上游引物：5’-CGTGAAAGCCTCTGATGGAGA-3’；LOC344887下游引物：5’-AGACGGCTGCTCCAATATCA-3’；β-actin上游引物：5’-AGTTGCGTTACACCCTTTCTTG-3’；β-actin下游引物：5’-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3’。實時熒光定量PCR反應(yīng)程序如下：95℃預(yù)變性30 s；95℃5 s，60℃ 30 s；共40個循環(huán)；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min。實驗結(jié)束采用2-ΔΔCt法計算mRNA相對表達(dá)量。（5）克隆形成實驗：收集LOC344887敲低組及對照組的細(xì)胞各500個接種于6孔板中，于培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)10 d后，棄去培養(yǎng)液，加入2 mL PBS清洗細(xì)胞兩次，之后加入1 mL 4%多聚甲醛溶液室溫固定細(xì)胞15 min，再加入結(jié)晶紫溶液室溫染色細(xì)胞15 min，最后棄去結(jié)晶紫染色液，并用清水洗去多余的染色液，待孔中無液體殘留時拍照記錄數(shù)據(jù)。（6）CCK8法繪制細(xì)胞生長曲線：按照1×103個/孔的濃度分別接種LOC344887敲低組及對照組細(xì)胞于96孔板中，每組設(shè)5個復(fù)孔，并分別于接種后第1、2、3、4天根據(jù)試劑盒說明加入CCK8工作液（工作液配制方法：用RPMI1640完全培養(yǎng)液將CCK8儲存液稀釋10倍），于培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育2 h后采用酶標(biāo)儀讀取細(xì)胞培養(yǎng)板中的吸光度值，記錄數(shù)據(jù)并繪制細(xì)胞生長曲線。（7）細(xì)胞周期檢測：收集LOC344887敲低組及對照組的細(xì)胞各1×105個，加入5 mL PBS清洗細(xì)胞2次，之后用預(yù)冷的70%乙醇溶液在-20℃冰箱固定細(xì)胞過夜。次日設(shè)轉(zhuǎn)速1,500 rpm離心5 min收集細(xì)胞沉淀，再加入5 mL PBS清洗細(xì)胞2次，之后按照PI/RNase染色液操作說明各組分別加入500μL染色液對細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，室溫避光孵育30 min后采用流式細(xì)胞儀測定DNA含量，最后運用Modfit軟件擬合數(shù)據(jù)圖像并分析細(xì)胞周期分布。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Prism 8.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（）表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用非配對的t檢驗。NSCLC組織與癌旁組織比較采用配對t檢驗。采用Kaplan-Meier繪制生存率曲線，生存曲線比較采用Log-rank檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC組織中LOC344887的表達(dá)水平 分析ENCORI數(shù)據(jù)庫中相關(guān)資料發(fā)現(xiàn)LOC344887在NSCLC樣本中的表達(dá)存在整體上調(diào)趨勢，尤其是在肺鱗癌樣本中的表達(dá)相較正常樣本顯著上調(diào)了155.7倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），見圖1。以上結(jié)果提示LOC344887可能與肺鱗癌發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性更高，于是本研究后續(xù)著重研究LOC344887對肺鱗癌細(xì)胞的影響。

圖1 NSCLC樣本與非配對的正常樣本中LOC344887的表達(dá)水平比較（A.肺腺癌樣本與正常樣本中LOC344887的表達(dá)水平比較；B. 肺鱗癌樣本與正常樣本中LOC344887的表達(dá)水平比較。與正常樣本比較，***P＜0.01）

2.2 LOC344887敲低組和對照組細(xì)胞LOC344887表達(dá)水平比較 通過轉(zhuǎn)染siRNA的方法敲低肺鱗癌細(xì)胞NCI-H2170中LOC344887的表達(dá)，結(jié)果顯示，較對照組，LOC344887敲低組的LOC344887表達(dá)下調(diào)了約3.2倍，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見圖2。

圖2 LOC344887敲低組和對照組細(xì)胞LOC344887表達(dá)水平比較（與對照組比較，**P＜0.01）

2.3 敲低LOC344887對NCI-H2170增殖能力的影響 通過克隆形成實驗和細(xì)胞生長曲線實驗檢測LOC344887對NCI-H2170細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示敲低LOC344887后，NCI-H2170細(xì)胞克隆繁殖能力明顯減弱，生長速率降低（P＜0.05），見圖3。

圖3 敲低LOC344887對NCI-H2170增殖能力的影響（A.克隆形成實驗；B.細(xì)胞生長曲線。與對照組比較，***P＜0.001）

2.4 敲低LOC344887對NCI-H2170細(xì)胞周期的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期實驗結(jié)果顯示，敲低LOC344887后，NCI-H2170細(xì)胞處于S期及G2/M期的細(xì)胞比例明顯降低（P＜0.05），處于G1期細(xì)胞比例明顯上升，細(xì)胞阻滯于G1期，見圖4。

圖4 敲低LOC344887對NCI-H2170細(xì)胞周期的影響（A.流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布峰形圖；B.對A圖中各細(xì)胞周期分布的統(tǒng)計。與對照組比較，*P＜0.05）

2.5 不同LOC344887表達(dá)水平的NSCLC患者總生存期的比較 通過分析TCGA數(shù)據(jù)庫相關(guān)數(shù)據(jù)繪制的NSCLC患者生存曲線發(fā)現(xiàn)，LOC344887表達(dá)水平與NSCLC患者的總生存期顯著相關(guān)，LOC344887表達(dá)越高，患者總生存率越差，提示LOC344887可作為肺鱗癌的潛在治療靶標(biāo)和預(yù)后標(biāo)志物，見圖5。

圖5 不同LOC344887表達(dá)水平的NSCLC患者總生存期的比較

3 討論

近年，大量研究表明lncRNA的異常表達(dá)參與調(diào)控多種癌癥增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移等過程［5］，lncRNA已逐漸成為了癌癥靶向診斷、治療領(lǐng)域的重要研究對象。在NSCLC中也有相關(guān)研究，如lncRNA HOXC-AS3在NSCLC組織及細(xì)胞中高表達(dá)，其下調(diào)可抑制NSCLC細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移［6］，而lncRNA PCAT1則可通過抑制cGAS/STING信號介導(dǎo)T細(xì)胞活化，從而促進(jìn)NSCLC發(fā)生和免疫抑制［7］。因此，探究NSCLC中l(wèi)ncRNA的臨床意義、生物學(xué)功能及作用機(jī)制，有助于推動NSCLC的診斷和靶向治療。

前期WU等［8］首次發(fā)現(xiàn)LOC344887在NSCLC組織中高表達(dá)，但該研究并未分析其在不同類型NSCLC組織中的狀態(tài)及相關(guān)性，也尚未進(jìn)一步研究其功能及作用機(jī)制。本研究首先通過數(shù)據(jù)庫挖掘發(fā)現(xiàn)LOC344887在NSCLC樣本中高表達(dá)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)其在肺鱗癌樣本中的異常表達(dá)較肺腺癌樣本中的更明顯，推測LOC344887可能與肺鱗癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)性更高。本研究還發(fā)現(xiàn)LOC344887在NSCLC組織中表達(dá)越高，患者預(yù)后越差，提示LOC344887可作為肺鱗癌的潛在治療靶標(biāo)和預(yù)后標(biāo)志物。

目前有關(guān)LOC344887在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中作用機(jī)制的研究報道較少。本研究顯示敲低肺鱗癌細(xì)胞中LOC344887的表達(dá)降低了細(xì)胞增殖速率，并阻滯細(xì)胞于G1期，提示LOC344887與肺鱗癌細(xì)胞的生長密切相關(guān)，綜合以上信息作者也初步推測LOC344887表達(dá)水平具有組織差異性，在不同腫瘤中呈現(xiàn)不同狀態(tài)，作用機(jī)制也不同。

另外，有研究提示LOC344887可能受核因子-E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2）調(diào)控，介導(dǎo)抗癌藥物對結(jié)腸癌、食管癌細(xì)胞的抗腫瘤作用［9］，調(diào)控肺纖維化發(fā)生［10］。還有研究表明LOC344887可能通過調(diào)控下游靶基因的甲基化介導(dǎo)胃癌進(jìn)展［11］，說明LOC344887在DNA表觀遺傳調(diào)控方面也發(fā)揮著重要作用。這為我們后續(xù)挖掘LOC344878在NSCLC中的分子機(jī)制提供了方向，之后課題組將深入探究LOC344887在不同類型NSCLC中的作用機(jī)制，為NSCLC的發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制研究提供新見解。

綜上所述，本研究證實了LOC344887影響LUSC細(xì)胞NCI-2170的生長，LOC344887在NSCLC組織中高表達(dá)且與預(yù)后相關(guān)。LOC344887可能為肺鱗癌的潛在治療靶點和預(yù)后標(biāo)志物。