陳林林，王玲，鄭鳳鳴，張海鵬，郝熙，辛嘉英，2

（1.哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150028；2.中國科學(xué)院 蘭州化學(xué)物理研究所 羰基合成與選擇氧化國家重點實驗室，甘肅 蘭州 730000）

抗氧化肽由動植物酶促水解、分離和提取獲得，可以抑制生物聚合物的過氧化或在體內(nèi)消除自由基，具有一定的抗氧化能力[1]?？寡趸牡淖饔脵C(jī)制是能夠直接作用于自由基，阻止其發(fā)生反應(yīng)；還可以吸收能夠產(chǎn)生自由基的物質(zhì)，減少體內(nèi)自由基的含量。機(jī)體抵抗氧化的能力越強(qiáng)，患相關(guān)疾病的可能性就越小。對抗氧化肽的深入研究使其在功能性產(chǎn)品、食品添加劑、化妝品、制藥和其他行業(yè)中的應(yīng)用日益廣泛[2-4]。以植物蛋白作為原料制得的抗氧化肽，具有抗氧化、提高免疫力、延緩衰老、抗高血壓等生理功能，如今抗氧化肽已經(jīng)成為國內(nèi)外研究熱點。近年來，活性肽大多采用酶解法制成，通過酶解法從植物蛋白中制備的生物活性肽不僅活性高，而且無毒副作用[5-7]。楊雪等[8]將豌豆蛋白以堿性蛋白酶酶解，通過測定豌豆蛋白酶液對自由基的清除率，制備出具有強(qiáng)抗氧化活性的豌豆活性肽。

紫蘇在我國已有近2 000 年的種植和使用歷史，是一種一年生傳統(tǒng)草本植物，可以食用或入藥。紫蘇餅粕是紫蘇籽脫脂后的副產(chǎn)物，與其他油料脫脂后的餅粕相比，紫蘇餅粕是一種蛋白含量豐富、雜質(zhì)少，含有豐富的必需氨基酸、功效比值、凈蛋白比值、消化率高的優(yōu)質(zhì)植物蛋白資源[9]。胡博路等[10]研究表明，紫蘇葉具有很強(qiáng)的清除超氧陰離子自由基和羥基自由基能力。

本文以紫蘇粕為原料，利用酵母菌對其發(fā)酵提高蛋白質(zhì)含量，對發(fā)酵紫蘇粕中的蛋白進(jìn)行提取并通過單因素與響應(yīng)面試驗優(yōu)化其發(fā)酵條件；利用蛋白酶對發(fā)酵后紫蘇粕進(jìn)行水解，制備紫蘇粕抗氧化肽，并以1，1-二苯基-2-苦基肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、羥基自由基、2，2'-聯(lián)偶氮雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）[2，2'-azino-bis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid），ABTS]陽離子自由基、超氧陰離子自由基的清除率，及鐵離子還原抗氧化能力（ferric reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP） 等為指標(biāo)，來探究酶種類和酶用量對發(fā)酵后紫蘇粕抗氧化肽活性的影響。以期為紫蘇加工副產(chǎn)品的高值利用和抗氧化肽的開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫蘇粕：黑龍江省樺南農(nóng)盛園食品有限公司；酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）131 保存于哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院發(fā)酵與生物催化實驗室；鄰苯三酚（焦性沒食子酸）、抗壞血酸：天津市興復(fù)精細(xì)化工研究所；三羥甲基氨基甲烷（trometamol，Tris）、ABTS、2，4，6-三吡啶基三嗪[2，4，6-tris （2-pyridyl）-s-triazine，TPTZ]：薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司；DPPH：日本東京化成工業(yè)株式會社；麥芽汁培養(yǎng)基、堿性蛋白酶（200 U/mg）、胰蛋白酶（250 U/mg）：上海源葉生物科技有限公司，所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV 5100B 型紫外可見分光光度計、HZP-D 恒溫振蕩箱：上海元析儀器有限公司；DHG-9070A 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、LDZX-50KB 立式高壓蒸汽滅菌箱：上海一恒科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 脫脂紫蘇粕的發(fā)酵

1.3.1.1 紫蘇粕脫脂

稱取一定量的紫蘇粕粉，按1∶3（g/mL）比例加入30～60 ℃沸程的石油醚攪拌浸提30 min，過濾后棄去上層油脂清液，多次重復(fù)，直至最后石油醚為無色。濾渣在80 ℃烘箱中干燥，4 ℃冰箱保存。

1.3.1.2 菌種的活化

稱取13 g 麥芽汁培養(yǎng)基，加熱溶解在100 mL 無菌水中，裝于錐形瓶中，在121 ℃、1.01 kPa 的條件下滅菌15 min 后取出培養(yǎng)基置于無菌臺，冷卻后在培養(yǎng)基中加入0.5 g 酵母，在恒溫?fù)u床（37 ℃、120 r/min）中培養(yǎng)24 h 后，用無菌水沖洗，將沖洗后的孢子倒入錐形瓶中，采用無菌紗布過濾，制備成孢子懸浮液。最后用血球計數(shù)板計數(shù)后，將孢子懸浮液的濃度調(diào)整為2×106～5×106CFU/mL，置于冰箱中4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.3 固態(tài)發(fā)酵紫蘇粕

在250 mL 錐形瓶中加入一定量的脫脂紫蘇粕，加入適量無菌水混勻，密封后滅菌（121 ℃，20 min），將孢子懸浮液倒入超凈工作臺上的錐形瓶中混勻發(fā)酵。發(fā)酵后滅菌（121 ℃，10 min）、干燥（50 ℃，48 h），得到紫蘇粕抗氧化肽粗提物。研磨后，密封并儲存在4 ℃冰箱。

1.3.2 脫脂紫蘇粕發(fā)酵單因素試驗

1.3.2.1 pH 值對發(fā)酵紫蘇粕蛋白質(zhì)含量的影響

分別準(zhǔn)確稱取25 g 發(fā)酵紫蘇粕置于滅菌后的錐形瓶中，按3.0∶1（mL/g）的液料比加入75 mL 無菌水，酵母菌接菌量為3.2%，調(diào)節(jié)溶液pH 值分別為2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0。將5 組樣品置于恒溫振蕩箱在37 ℃下發(fā)酵24 h?？疾觳煌琾H 值對發(fā)酵液中蛋白質(zhì)含量的影響。

1.3.2.2 接菌量對發(fā)酵紫蘇粕蛋白質(zhì)含量的影響

分別準(zhǔn)確稱取25 g 發(fā)酵紫蘇粕置于滅菌后的錐形瓶中，按3.0∶1（mL/g）的液料比向每組加入75 mL 無菌水，調(diào)節(jié)溶液pH 值為3.0，加入酵母菌液混勻，接菌量為4%、8%、12%、16%、20%（酵母菌菌液加入量與發(fā)酵紫蘇粕質(zhì)量分?jǐn)?shù)），將5 組樣品置于恒溫振蕩箱在37 ℃下發(fā)酵24 h。考察不同接菌量對蛋白質(zhì)含量的影響。

1.3.2.3 液料比對發(fā)酵紫蘇粕蛋白質(zhì)含量的影響

分別準(zhǔn)確稱取25 g 發(fā)酵紫蘇粕置于滅菌后的錐形瓶中，酵母菌接菌量為3.2%，各加入25、50、75、100、125 mL 無菌水，混勻，調(diào)節(jié)溶液pH 值為3.0。將5 組樣品置于恒溫振蕩箱在37 ℃下發(fā)酵24 h。考馬斯亮藍(lán)法測發(fā)酵液中蛋白質(zhì)含量，考察不同液料比對蛋白質(zhì)含量的影響。

1.3.2.4 發(fā)酵時間對發(fā)酵紫蘇粕蛋白質(zhì)含量的影響

分別準(zhǔn)確稱取25 g 發(fā)酵紫蘇粕置于滅菌后的錐形瓶中，按3.0∶1（mL/g）的液料比向每組加入75 mL 無菌水，酵母菌接菌量為3.2%，調(diào)節(jié)溶液pH 值為3.0，將5 組樣品置于恒溫振蕩箱在37 ℃下發(fā)酵6、12、18、24、30、36、42、48 h。考馬斯亮藍(lán)法測發(fā)酵液中蛋白質(zhì)含量，考察不同發(fā)酵時間對蛋白質(zhì)含量的影響。

1.3.3 脫脂紫蘇粕發(fā)酵響應(yīng)面試驗

選取pH 值（A）、液料比（B）、接菌量（C）3 個反應(yīng)條件進(jìn)行單因素優(yōu)化試驗，每組試驗進(jìn)行3 次平行試驗。在此基礎(chǔ)上，確定工藝條件的優(yōu)選試驗范圍，采用Design-Expert 8.0 響應(yīng)面分析法對工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平Table1 Factors and levels of response surface methodology

1.3.4 紫蘇蛋白的提取

參考Zhao 等[11]的方法略作改動，首先進(jìn)行堿溶處理，準(zhǔn)確稱取20.0 g 發(fā)酵紫蘇粕，按液料比10∶1（mL/g）加入一定量蒸餾水，調(diào)節(jié)反應(yīng)體系的pH 值至9.0，50 ℃恒溫水浴，充分浸泡1 h 后，進(jìn)行離心（3 000 r/min，15 min），保留上清液。將上清液的pH 值調(diào)整至4.4，靜置10 min 后，使蛋白酸沉。將上清液于3 000 r/min 離心15 min，將離心分離得到的沉淀物以1∶2 質(zhì)量比溶解，溶液用濃度1.0 mol/L 的NaOH 溶液調(diào)pH 值為7.0后，冷凍干燥，得到發(fā)酵紫蘇粕分離蛋白。

1.3.5 蛋白質(zhì)含量的測定

參考Cheng 等[12]的方法，準(zhǔn)確稱取考馬斯亮藍(lán)粉末0.10 g，于50 mL 乙醇（95%）中溶解，加入100 mL 磷酸（85%），用蒸餾水定容至1 000 mL，過濾后收集濾液，得到考馬斯亮藍(lán)溶液。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)X，吸光度A595nm為縱坐標(biāo)Y，繪制蛋白質(zhì)濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算發(fā)酵紫蘇粕中的蛋白質(zhì)含量。回歸方程為Y=0.780 7X-0.039，R2=0.991 8，在濃度范圍為0～1.0 mg/mL內(nèi)，蛋白質(zhì)濃度與A595nm之間具有良好的線性關(guān)系，可用于待測樣品中蛋白質(zhì)濃度的計算。

1.3.6 抗氧化肽的制備與條件優(yōu)化

參考Hashimoto 等[13]的方法，取5.0 g 的發(fā)酵紫蘇粕于錐形瓶中，加入100 mL 蒸餾水，超聲處理20 min，調(diào)節(jié)pH 值，分別加入堿性蛋白酶（200 U/mg）和胰蛋白酶（250 U/mg），酶加入量分別為1%（160 U/g）、3%（480 U/g）、5%（800 U/g）、7%（1 120 U/g）和9%（1 440 U/g）。在40 ℃水浴恒溫振蕩器中酶解4 h，滅酶處理15 min，真空抽濾后收集濾液。加入無水乙醇（V濾液∶V無水乙醇=1∶2），靜置沉淀12 h，除去上清液，將沉淀物凍干，備用。

1.3.7 發(fā)酵紫蘇粕抗氧化肽活性的測定

1.3.7.1 DPPH 自由基清除能力的測定

參照Chen 等[14]方法略有改動。用無水乙醇配制濃度為2×10-4mol/L 的DPPH 溶液，將其與紫蘇蛋白酶解液以體積比1∶1 均勻混合，于室溫下避光反應(yīng)30 min后，在波長517 nm 處測量溶液的吸光度A。同時，以無水乙醇為參照物，用去離子水和抗壞血酸替代酶解紫蘇蛋白溶液，按相同的操作方法測定A517nm。并以此作為空白對照和陽性對照。根據(jù)下述公式計算DPPH 自由基清除率（D，%）。

式中：A1為酶解紫蘇蛋白溶液＋DPPH 乙醇溶液的吸光度；A2為酶解紫蘇蛋白溶液＋乙醇溶液的吸光度；A0為乙醇液＋DPPH 乙醇溶液的吸光度。

1.3.7.2 超氧陰離子自由基清除能力的測定

參照Siswoyo 等[15]方法略有改動。配制酶解紫蘇蛋白溶液和Tris-HCl 混合溶液（50 mmol/L，pH8.2），25 ℃下恒溫水浴20 min，取出后立即加入溫度為25 ℃的0.2 mL 7 mmol/L 鄰苯三酚溶液，將混合溶液定容至10 mL。待反應(yīng)啟動后1 min 開始計時，在波長325 nm處，每間隔30 s 測定一次吸光度A，共記錄吸光度6 次。以時間（t）為橫坐標(biāo)，A325nm為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率就是鄰苯三酚自氧化速率。用去離子水和抗壞血酸替代酶解紫蘇蛋白溶液，按相同的操作方法測定A325nm。并以此作為空白對照和陽性對照。根據(jù)下述公式計算超氧陰離子自由基清除率（F，%）。

式中：A0為去離子水和抗壞血酸的鄰苯三酚氧化速率計算吸光度曲線的斜率；As為酶解紫蘇蛋白溶液的鄰苯三酚氧化速率計算吸光度曲線的斜率。

1.3.7.3 ABTS＋自由基清除能力的測定

參考Lin 等[16]的方法略有改動。按照體積比1∶1 將過硫酸鉀溶液（2.45 mmol/L）與ABTS 溶液（7 mmol/L）均勻混合，室溫下避光反應(yīng)15 h。用磷酸緩沖液（0.01 mol/L，pH7.4） 將ABTS 溶液稀釋，直至734 nm處吸光度為0.70，制得ABTS 反應(yīng)液。取1 mL 酶解紫蘇蛋白溶液和5 mL ABTS 反應(yīng)液，振蕩搖勻，于室溫下靜置10 min 后在734 nm 處測其吸光度A，用去離子水和抗壞血酸替代酶解紫蘇蛋白溶液，按相同的操作方法測定A734nm。并以此作為空白對照和陽性對照。根據(jù)下述公式計算ABTS+自由基清除率（A，%）。

式中：A734nm為去離子水和抗壞血酸在734 nm 處測其吸光度；A 為酶解紫蘇蛋白溶液在734 nm 處測其吸光度。

1.3.7.4 羥基自由基清除能力的測定

將酶解紫蘇粕蛋白溶液、FeSO4溶液（9 mmol/L）和水楊酸乙醇溶液（9 mmol/L）以體積比1∶1∶1 混合，然后加入相同體積的H2O2溶液（8.8 mmol/L）。37 ℃恒溫水浴30 min 后離心（5 000 r/min，10 min）。在波長520 nm處，測量上清液的吸光度A[17-18]。用去離子水和抗壞血酸代替酶解紫蘇蛋白溶液，按相同的操作方法測定A520nm。并以此作為空白對照和陽性對照。根據(jù)下述公式計算羥基自由基清除率（N，%）。

式中：A520nm為去離子水和抗壞血酸在520 nm 處測其吸光度；A 為酶解紫蘇蛋白溶液在520 nm 處測其吸光度。

1.3.7.5 FRAP 總抗氧化能力的測定

參考Hetharia 等[19]的方法，略有改動。準(zhǔn)確稱取0.51 g 乙酸鈉，加2 mL 冰醋酸，定容至25 mL；準(zhǔn)確稱取0.078 1 g TPTZ 粉末，加83 μL 濃鹽酸，并用蒸餾水定容至25 mL；精確稱取0.162 g FeCl3，用30 mL 蒸餾水溶解并搖勻。將上述步驟中制備的溶液以10∶1∶1 的體積比混合，制成FRAP 工作液。準(zhǔn)確量取1 mL 酶解紫蘇粕蛋白溶液至比色管中，加入制備的工作液6 mL，搖勻，37 ℃恒溫水浴加熱10 min 后，在波長為593 nm，測量溶液的吸光度，吸光度越大，表示總還原能力就越強(qiáng)。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵條件對紫蘇粕蛋白質(zhì)含量影響的單因素試驗

2.1.1 pH 值對發(fā)酵紫蘇粕蛋白質(zhì)含量的影響

pH 值對發(fā)酵紫蘇粕蛋白質(zhì)含量的影響如圖1 所示。

圖1 pH 值對發(fā)酵紫蘇粕蛋白質(zhì)含量的影響Fig.1 Effect of pH value on protein content of fermented perilla meal

由圖1 可知，pH 值從3.0 變化到3.5 時，發(fā)酵紫蘇粕蛋白質(zhì)含量增加，達(dá)到0.293 mg/g。當(dāng)pH 值繼續(xù)增加至4.0 時發(fā)酵紫蘇粕蛋白質(zhì)含量又急劇下降，pH 值對發(fā)酵紫蘇粕蛋白質(zhì)含量產(chǎn)生影響的原因可能是pH值的改變影響酵母菌的活性[20]，當(dāng)pH 值為3.5 時，發(fā)酵紫蘇粕蛋白質(zhì)含量最高，因此選擇pH 值為3.5 進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.1.2 接菌量對發(fā)酵紫蘇粕蛋白質(zhì)含量的影響

接菌量對發(fā)酵紫蘇粕蛋白質(zhì)含量的影響如圖2所示。

圖2 接菌量對發(fā)酵紫蘇粕蛋白質(zhì)含量的影響Fig.2 Effect of inoculation amount on protein content of fermented perilla meal

由圖2 可以看出，一定范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)含量隨著接菌量的增加而提高，當(dāng)接菌量為8%時，所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)含量達(dá)到最高值（0.375 mg/g），隨著接菌量的繼續(xù)增加，蛋白質(zhì)含量開始下降，且接菌量對蛋白含量產(chǎn)生影響的原因可能是反應(yīng)體系中微生物過多，大量聚集在紫蘇粕表面，降低了代謝速度，影響發(fā)酵效果，因此選擇接菌量為8%進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.1.3 液料比對發(fā)酵紫蘇粕蛋白質(zhì)含量的影響

液料比對發(fā)酵紫蘇粕蛋白質(zhì)含量的影響如圖3 所示。

圖3 液料比對發(fā)酵紫蘇粕蛋白質(zhì)含量的影響Fig.3 Effect of liquid to material ratio on protein content of fermented perilla meal

從圖3 可以看出，隨著液料比的增加，蛋白質(zhì)含量明顯增加。液料比為3.0∶1（mL/g）時，達(dá)到最大值。隨著液料比值的進(jìn)一步增加，蛋白質(zhì)含量開始下降，當(dāng)液料比超過4.0∶1（mL/g）時，蛋白質(zhì)含量迅速下降。這可能是因為反應(yīng)系統(tǒng)中的水分含量過高，反應(yīng)溶液被過度稀釋，各種營養(yǎng)素的濃度降低，導(dǎo)致微生物代謝減慢，從而影響蛋白質(zhì)的含量[21]。因此選擇液料比3.0∶1（mL/g）進(jìn)行后續(xù)試驗。

2.1.4 發(fā)酵時間對發(fā)酵紫蘇粕蛋白質(zhì)含量的影響

發(fā)酵時間對發(fā)酵紫蘇粕蛋白質(zhì)含量的影響如圖4所示。

圖4 發(fā)酵時間對發(fā)酵紫蘇粕蛋白質(zhì)含量的影響Fig.4 Effect of fermentation time on protein content of fermented perilla meal

由圖4 可以看出，當(dāng)發(fā)酵時間在6～24 h 范圍內(nèi)時，紫蘇粕蛋白質(zhì)含量呈上升狀態(tài)可能是因為酵母菌可以將其含有復(fù)雜的蛋白質(zhì)分解成更簡單、更容易消化的形式，從而增加了紫蘇粕蛋白質(zhì)含量，24～48 h 趨于平緩，這可能是因為營養(yǎng)來源被耗盡，紫蘇粕蛋白質(zhì)含量緩慢增長。選取24 h 為發(fā)酵時間，與鄭溫翔等[22]研究結(jié)果一致。

2.2 脫脂紫蘇粕發(fā)酵最佳工藝條件的確定

2.2.1 試驗設(shè)計方案及結(jié)果

通過中心組合設(shè)計法設(shè)計響應(yīng)面試驗，優(yōu)化紫蘇發(fā)酵工藝，響應(yīng)面設(shè)計及結(jié)果如表2 所示。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Response surface test design and results

2.2.2 模型的建立及顯著性分析

利用Design-Expert 8.0 軟件對表2 數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到發(fā)酵紫蘇粕蛋白質(zhì)含量（Y）、pH 值（A）、液料比（B）、接菌量（C）的二次多項回歸模型方程：Y=0.64＋8.125×10-3A＋0.073B＋0.076C-0.047AB-0.037AC-0.059BC-0.080A2-0.056 33-0.11C2。

方差分析結(jié)果如表3 所示。

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis results

從表3 可以看出，整體模型水平極顯著（P＜0.01），失擬項不顯著（P＞0.05），R2=0.977 3，R2adj=0.948 1，表明該方程具有較高的擬合度。根據(jù)方差分析結(jié)果顯示A不顯著，B、C、AB、AC、BC 均顯著（P＜0.05），表明各因素間具有明顯的交互作用。方差分析結(jié)果顯示，3 種因素對結(jié)果的影響大小關(guān)系為接菌量（C）＞液料比（B）＞pH 值（A）。

2.2.3 因素交互作用的影響

pH 值與接菌量、液料比與接菌量和pH 值與液料比的交互作用如圖5～圖7 所示。

圖5 pH 值與接菌量的交互作用Fig.5 Interaction between pH value and inoculation amount

根據(jù)回歸方程，為了檢驗各因素之間的相關(guān)性，對結(jié)果進(jìn)行了響應(yīng)面分析，如圖5、6 和7 所示。圖中響應(yīng)面和等高線形狀的變化更直接地反映了pH 值、液料比和接菌量對蛋白質(zhì)含量的影響。在響應(yīng)面圖中，曲面越陡，凸起越大，表明所分析的兩個因素之間的相互作用與對響應(yīng)值的影響呈正相關(guān)。在等高線圖中，等高線形狀越接近橢圓，表明所分析的因素之間就有越顯著的相互作用。

從圖5 可以看出，保持pH 值不變，隨著接菌量的增加，蛋白質(zhì)含量先增加后降低。從等高線的形狀可以看出，pH 值和接菌量之間的相互作用對響應(yīng)值有顯著影響。從圖6 可以看出，當(dāng)液料比保持不變，接菌量增加時，蛋白質(zhì)含量先增加后降低。從等高線的形狀可以看出，液料比和接菌量之間的相互作用對響應(yīng)值有顯著影響。從圖7 可以看出，當(dāng)pH 值保持不變，液料比增大時，蛋白質(zhì)含量先增加后降低。從等高線形狀可以看出，pH 值和液料比之間的相互作用對響應(yīng)值有顯著影響。

圖6 液料比與接菌量的交互作用Fig.6 Interaction between liquid - solid ratio and inoculation amount

圖7 pH 值與液料比的交互作用Fig.7 Interaction between pH and liquid-solid ratio

2.2.4 最優(yōu)工藝參數(shù)

采用Design-Expert 8.0 軟件進(jìn)行分析并求解二次多元回歸模型，得到的最佳發(fā)酵工藝條件為pH3.37、液料比5.0∶1（mL/g）、接菌量為8.48%，蛋白質(zhì)理論含量0.683 mg/g。通過對實際可操作性的考慮，將優(yōu)化條件調(diào)整為pH3.4、液料比5.0∶1（mL/g）、接菌量8.5%。在此條件下進(jìn)行3 次重復(fù)試驗，得到蛋白質(zhì)含量的平均值為0.679 mg/g，與理論值相比，其相對誤差約為0.59%＜5%，說明響應(yīng)面法對發(fā)酵條件的優(yōu)化可靠。

2.3 不同酶解條件對發(fā)酵紫蘇粕制備抗氧化肽活性的影響

2.3.1 酶種類與酶用量對DPPH 自由基清除能力的影響

在其他條件相同的情況下，改變酶的種類與酶的用量，考察其對DPPH 自由基清除能力的影響，結(jié)果如圖8 所示。

圖8 不同酶解條件對DPPH 自由基清除能力的影響Fig.8 Effect of different enzymatic hydrolysis conditions on scavenging ability of DPPH

酶用量為1%～9%時，堿性蛋白酶組、抗壞血酸組和胰蛋白酶組對DPPH 自由基的清除率均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，堿性蛋白酶組和胰蛋白酶組對DPPH自由基清除效果優(yōu)于抗壞血酸組。酶用量在5%時達(dá)到最高值，清除率分別為65.63%、63.13%、56.26%。這是由于蛋白酶與蛋白質(zhì)分子中肽鍵的接觸概率會隨著酶用量的增加而增加，但當(dāng)酶量超過一定值時，酶與蛋白的接觸趨于飽和狀態(tài)，因此，清除率會隨著酶用量的增加而降低[23]。

2.3.2 酶種類與酶用量對超氧陰離子自由基清除能力的影響

在其他條件相同的情況下，改變酶的種類與酶用量，考察其對超氧陰離子自由基清除能力的影響，結(jié)果如圖9 所示。

圖9 不同酶解條件對超氧陰離子自由基清除能力的影響Fig.9 Effect of different enzymatic hydrolysis conditions on scavenging ability of superoxide anion radical

酶用量為1%～3%時，胰蛋白酶組的清除率急速上升，堿性蛋白酶組上升較為平緩。在酶用量5%～9%范圍內(nèi)，各組樣品的清除率都呈下降趨勢，酶用量為5%時清除能力均達(dá)到最高，堿性蛋白酶組的清除率為50.14%，而胰蛋白酶組略低，清除率為48.48%。胡學(xué)智等[24]研究表明，在同樣的條件下，堿性蛋白酶酶解液與胰蛋白酶酶解液對超氧陰離子的清除力度表現(xiàn)出較大差異，是由不同酶對底物蛋白質(zhì)的特異性選擇導(dǎo)致的。

2.3.3 酶種類與酶用量對ABTS＋自由基清除能力的影響

在其他條件相同的情況下，改變酶的種類與酶的用量，考察其對ABTS＋自由基清除能力的影響，結(jié)果如圖10 所示。

圖10 不同酶解條件對ABTS+自由基清除能力的影響Fig.10 Effects of different enzymatic hydrolysis conditions on scavenging ability of ABTS+ free radicals

酶用量為1%～9%時，3 組樣品均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。堿性蛋白酶組和胰蛋白酶組的ABTS＋自由基清除率都在酶用量為5%時達(dá)到最大，分別為47.35%、43.58%。與堿性蛋白酶組和胰蛋白酶組相比，抗壞血酸組對ABTS＋自由基的清除能力更強(qiáng)。張文敏等[25]研究說明，在酶用量及其他反應(yīng)條件相同的條件下，胰蛋白酶酶解液對ABTS＋自由基的清除能力低于堿性蛋白酶，與試驗結(jié)果一致。

2.3.4 酶種類與酶用量對羥基自由基清除能力的影響在其他條件相同的情況下，改變酶的種類與酶的用量，考察其對羥基自由基清除能力的影響，結(jié)果如圖11 所示。

圖11 不同酶解條件對羥基自由基清除能力的影響Fig.11 Effect of different enzymatic hydrolysis conditions on scavenging ability of hydroxyl radical

酶用量為1%～5%時，堿性蛋白酶組和抗壞血酸組對羥基自由基的清除率呈現(xiàn)上升趨勢，胰蛋白酶組呈先上升后下降的趨勢。當(dāng)酶用量超過5%時，堿性蛋白酶組和胰蛋白酶組抗氧化能力均呈現(xiàn)下降趨勢，而抗壞血酸的抗氧化能力呈緩慢上升的狀態(tài)。當(dāng)酶加入量為5%時，堿性蛋白酶對羥基自由基的清除率最高，達(dá)45.63%，清除效果最好。張文敏等[25]的研究結(jié)果表明，在同等酶用量的條件下，堿性蛋白酶酶解液對羥基自由基的清除能力優(yōu)于胰蛋白酶酶解液，與本試驗結(jié)論相吻合。

2.3.5 酶種類與酶用量對FRAP 總抗氧化能力的影響

在其他條件相同的情況下，改變酶的種類與酶的用量，考察其對FRAP 總抗氧化能力的影響，結(jié)果如圖12 所示。

圖12 不同酶解條件對FRAP 總抗氧化能力的影響Fig.12 Effects of different enzymatic hydrolysis conditions on total antioxidant capacity of FRAP

酶用量為1%～9%時，3 組樣品均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，這與Zhang 等[26]研究結(jié)果一致。在酶用量1%～5%范圍內(nèi)，堿性蛋白酶組與胰蛋白酶組的抗氧化能力均低于抗壞血酸組。當(dāng)酶用量高于5%，堿性蛋白酶組對FRAP 總抗氧化能力反而高于抗壞血酸組。

3 結(jié)論

通過單因素和響應(yīng)曲面法對紫蘇粕發(fā)酵工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳發(fā)酵工藝為pH3.4、液料比5.0∶1（mL/g）、及接菌量8.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)），在此條件下蛋白質(zhì)實際含量0.679 mg/g。試驗中3 個因素間的相關(guān)程度較高。因素影響的大小順序為接菌量＞液料比＞pH 值。以最優(yōu)條件下發(fā)酵后的紫蘇粕通過酶解制備抗氧化肽，當(dāng)堿性蛋白酶的用量在5%（800 U/g）時，發(fā)酵紫蘇粕酶解液的抗氧化活性呈現(xiàn)最佳，酶解液對DPPH 自由基、超氧陰離子自由基、ABTS＋自由基、羥基自由基的清除率分別可達(dá)65.63%、50.14%、47.35%、45.63%。為紫蘇加工副產(chǎn)物利用和抗氧化肽的開發(fā)提供理論參考。