牛麗麗，崔艷，閆志華，劉先印，劉愷，盧婷，宋茜

（1.天津市利民調(diào)料有限公司，天津 300308；2.天津農(nóng)學(xué)院 食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津 300384）

醬油，以大豆和小麥為主要原料，經(jīng)米曲霉、酵母等多種微生物混合發(fā)酵而成，是我國最主要的調(diào)味品之一[1]。醬油的發(fā)酵方式主要有低鹽固態(tài)發(fā)酵、高鹽稀態(tài)發(fā)酵兩種[2]。低鹽固態(tài)發(fā)酵是以脫脂大豆（或大豆）及麩皮、麥粉等為原料，經(jīng)過蛋白變性、制曲后，混合6° Bé 的鹽水，在45～55 ℃下發(fā)酵20～30 d。高鹽稀態(tài)發(fā)酵是以大豆或大豆粕為主要原料，經(jīng)過蛋白變性、制曲后，與20° Bé 的鹽水混合成稀醪，在發(fā)酵罐中發(fā)酵4～6 個(gè)月。醬油是日常烹飪的必備品，烹飪時(shí)添加適量醬油，會(huì)使菜肴色澤誘人、香氣撲鼻、味道鮮美[3]。醬油不僅是一種傳統(tǒng)的調(diào)味品，還具有抗氧化等功效[4]。隨著人們生活水平的提高，消費(fèi)者對更高品質(zhì)、更高營養(yǎng)價(jià)值的醬油產(chǎn)品需求日益強(qiáng)烈。

黑豆中含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、微量元素和粗纖維，具有高蛋白、低熱量的特性。其中蛋白質(zhì)含量達(dá)40%以上，黑豆蛋白質(zhì)中的必需氨基酸組成結(jié)構(gòu)水平總體優(yōu)于黃豆[5]。黑豆富含人體所需的氨基酸、維生素和微量元素；其表皮中富含的原花青素（3.61%～5.59%）是一種高效的自由基清除劑，具有保護(hù)心血管系統(tǒng)、降血糖、抗腫瘤等作用[6]。黑豆因其活性物質(zhì)含量高于黃豆，逐漸成為醬油改良的主要原料[7]。

張歡歡等[8]在高鹽稀態(tài)發(fā)酵工藝下，使用黃豆、黑豆兩種蛋白原料進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)現(xiàn)黑豆醬油抗氧化活性高于黃豆醬油，醇、酯及醛酮類主要揮發(fā)性成分較均衡，風(fēng)味協(xié)調(diào)；王猛[9]在黑豆醬油的初步研究中，發(fā)現(xiàn)黑豆醬油的氨基酸態(tài)氮、全氮、可溶性無鹽固形物的含量均高于黃豆醬油；黑豆醬油中的有機(jī)酸含量高于黃豆醬油，特別是乳酸、乙酸、酒石酸。

當(dāng)前醬油發(fā)酵工藝方法較多，不同的發(fā)酵工藝有不同的特點(diǎn)，醬油的風(fēng)味也不同，注重醬油發(fā)酵工藝研究并提出醬油風(fēng)味改善的方法有重要意義[10]。

本文以黑豆為主要蛋白質(zhì)原料，在發(fā)酵過程中設(shè)定不同的溫度控制程序，分析不同釀造方式對黑豆醬油品質(zhì)的影響，為后續(xù)黑豆醬油的發(fā)酵工藝選擇提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 原料

黑豆：市售；炒小麥：涿州市永鑫炒麥廠；米曲霉（滬釀3.042）：石家莊市鼎鑫釀造食品科學(xué)研究所。

1.1.2 試劑

氫氧化鈉：天津市大陸化學(xué)試劑有限公司；甲醛溶液：天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；硝酸銀：天津市南開化工廠；鉻酸鉀:天津市天大化工實(shí)驗(yàn)廠；硫酸：天津化學(xué)試劑三廠；硼酸：天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；鹽酸、亞鐵氰化鉀：天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；硫酸銅：天津市化工三廠有限公司；硝酸鉀、次甲基藍(lán)：天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；葡萄糖、酒石酸鉀鈉：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司。所用試劑均為分析純。

1.1.3 設(shè)備

T700 型紫外可見分光光度計(jì)：北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；PHSJ-5 型實(shí)驗(yàn)室pH 計(jì)：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；GH610-3 型分析天平：北京京衡偉業(yè)科技有限公司；HSY-16 型水浴鍋：上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；101-01 型電熱恒溫干燥箱：天津市三水科學(xué)儀器有限公司；JC-9870A 型全自動(dòng)凱氏定氮儀：上海市沛歐分析儀器有限公司；DN3000 型玻璃鋼保溫發(fā)酵罐：連云港中復(fù)連眾復(fù)合材料有限公司；斗式提升機(jī)、泡豆槽及平臺(tái)：上海瑞派機(jī)械有限公司；蒸球：江陰市華信藥化設(shè)備有限公司；三聯(lián)發(fā)酵罐：鎮(zhèn)江生物設(shè)備有限公司；CSOIF 型生物顯微鏡:上海光學(xué)儀器五廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 黑豆醬油發(fā)酵工藝

黑豆醬油發(fā)酵工藝流程為選豆→浸泡→蒸煮→接菌制曲→發(fā)酵→壓榨。

原料配比：黑豆∶炒小麥=7∶3（質(zhì)量比）。每蒸球用量為黑豆700 kg，炒小麥300 kg。黑豆泡發(fā)時(shí)間為10～12 h。

蒸煮工藝：泡好的黑豆進(jìn)入蒸球中蒸煮。蒸煮條件：0.18 MPa、3 min。蒸煮完成的黑豆與炒小麥混合，經(jīng)隧道冷卻后接種米曲霉菌種，接種量為0.035%。

制曲工藝：曲料入曲池后，溫度控制在30～35 ℃。品溫超過35 ℃時(shí)第一次翻曲，10～12 h 后進(jìn)行第二次翻曲，翻曲后溫度控制在20～25 ℃。68～72 h 后出曲。成曲取樣，測定成曲水分和酶活力等指標(biāo)。

混料入罐工藝：鹽水濃度為20° Bé，添加酵母培養(yǎng)液的濃度≥2×107cfu/mL，每罐45 L。

分別采用低溫釀造工藝、常溫釀造工藝和高溫釀造工藝3 組發(fā)酵工藝進(jìn)行后續(xù)發(fā)酵釀造。

1）低溫釀造工藝：鹽水溫度為0～4 ℃，進(jìn)罐后10～20 ℃保持20 d；隨后開啟熱水循環(huán)，緩慢加溫至30 ℃；加入酵母培養(yǎng)液，在30～35 ℃保溫發(fā)酵60 d；開啟冷凍機(jī)組，溫度控制在25～30 ℃，保溫發(fā)酵30 d；醬醪成熟，出罐壓榨。發(fā)酵期約為4 個(gè)月。

2）常溫釀造工藝：鹽水溫度為常溫（約為25 ℃），進(jìn)罐后開啟熱水循環(huán)，升溫至30 ℃；加入酵母培養(yǎng)，保持30～35 ℃發(fā)酵直至結(jié)束。發(fā)酵期約為4 個(gè)月。

3）高溫釀造工藝：鹽水溫度為50～52 ℃，進(jìn)罐后40～45 ℃保溫發(fā)酵20 d；開啟冷凍機(jī)組，緩慢降溫至30 ℃；加入酵母培養(yǎng)液，30～35 ℃發(fā)酵直至結(jié)束。發(fā)酵期約為4 個(gè)月。

定期取樣，檢測醬汁溫度、pH 值、還原糖、氨基酸態(tài)氮、全氮等指標(biāo)。

1.2.2 相關(guān)指標(biāo)測定方法

酶活力參照SB/T 10317—1999《蛋白酶活力測定法》中甲醛法測定；總酸、氨基酸態(tài)氮、可溶性無鹽固形物、全氮、感官品質(zhì)參照GB/T 18186—2000《釀造醬油》測定；還原糖采用SB/T 10213—1994《醬腌菜理化檢驗(yàn)方法》測定；水分參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測定》測定；酵母菌計(jì)數(shù)采用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法；pH 值采用實(shí)驗(yàn)室pH 計(jì)直接讀數(shù)得出；色值采用比色板直接比對。感官評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表1。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有樣品均重復(fù)測定3 次，采用GraphPrism 8 軟件繪圖。品評數(shù)據(jù)利用Origin 9.0 繪制雷達(dá)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 水分和酶活力測定結(jié)果

醬油制大曲過程是為了讓米曲霉產(chǎn)生更多種類、更多數(shù)量的酶，主要包括水解蛋白質(zhì)的蛋白酶、肽酶以及分解碳水化合物的酶類，其中米曲霉和蛋白酶活性是影響醬油原料利用率和產(chǎn)品品質(zhì)的關(guān)鍵因素[11]，決定醬油品質(zhì)好壞和發(fā)酵周期長短，曲料中適當(dāng)?shù)乃趾繒?huì)對酶的分泌起到促進(jìn)作用。通常，成曲水分含量在25%～30%，成曲酶活在1～1.3 g 氨基酸態(tài)氮/100 g（干基）。本次試驗(yàn)，分別測定每個(gè)試驗(yàn)組成曲水分和成曲酶活性，以確定3 組發(fā)酵工藝是否在成曲質(zhì)量上保持一致。具體結(jié)果見圖1、圖2。

圖1 不同發(fā)酵工藝成曲水分含量Fig.1 Moisture content of soy sauce koji in different brewing techniques

圖2 不同發(fā)酵工藝成曲酶活力Fig.2 Enzyme activity of soy sauce koji in different brewing techniques

從圖1、圖2 可以看到，3 組的成曲平均水分含量在29%，成曲酶活力平均值為1.25 g 氨基酸態(tài)氮/100 g（干基），成曲質(zhì)量一致，沒有明顯差別。

2.2 不同發(fā)酵工藝中醬油理化指標(biāo)變化

2.2.1 發(fā)酵過程中溫度的變化

醬油發(fā)酵的溫度與醬油品質(zhì)密切相關(guān)。發(fā)酵溫度會(huì)影響發(fā)酵過程中各種酶活力的變化、微生物的生長[12]及美拉德反應(yīng)，從而導(dǎo)致醬油的風(fēng)味、香氣和色澤產(chǎn)生差異[13]。低溫發(fā)酵工藝可以模擬自然發(fā)酵過程，更適合酵母菌、乳酸菌等有益微生物的繁殖、發(fā)酵，醬醪中酒精含量高，能夠生成醇厚的香氣；常溫發(fā)酵工藝可以排除投料季節(jié)不同而造成的溫度差異，將發(fā)酵溫度始終控制在30 ℃左右，在保證酶發(fā)揮作用的基礎(chǔ)上，生產(chǎn)出品質(zhì)均一的產(chǎn)品；高溫釀造工藝初期采用高溫，適合米曲霉蛋白酶發(fā)揮作用，使蛋白質(zhì)快速分解消化，能夠在短時(shí)間提升醬油的氨基酸態(tài)氮和全氮指標(biāo)，在短時(shí)間獲得濃厚呈味成分。本次試驗(yàn)每5 d 取樣一次，檢測3 組醬汁發(fā)酵過程中發(fā)酵溫度的變化，結(jié)果見圖3。

圖3 不同發(fā)酵工藝醬汁的溫度變化Fig.3 Temperature changes in different brewing techniques

從圖3 可以看出，低溫釀造組發(fā)酵溫度在1～20 d，發(fā)酵溫度≤20 ℃；21～30 d，發(fā)酵溫度控制在15～30 ℃；31～90 d，發(fā)酵溫度控制在30～35 ℃；91～120 d，發(fā)酵溫度控制在25～28 ℃；常溫釀造組在1～20 d，發(fā)酵溫度控制在20～30 ℃；21～120 d，發(fā)酵溫度控制在30～35 ℃；高溫釀造組在1～20 d，發(fā)酵溫度控制在40～50 ℃；21～30 d，發(fā)酵溫度控制在30～40 ℃；31～120 d，發(fā)酵溫度控制在30～35 ℃。因此，3 組的溫度變化過程基本符合試驗(yàn)設(shè)定要求。

2.2.2 醬汁pH 值變化

在醬油發(fā)酵過程中，醬汁的pH 值變化體現(xiàn)了有機(jī)酸的變化規(guī)律。在發(fā)酵初期，耐鹽乳酸菌利用炒小麥中的碳源代謝成乳酸等有機(jī)酸。適量的有機(jī)酸對醬油風(fēng)味具有很大影響，有機(jī)酸本身的酸味形成醬油爽口的特殊口感，同時(shí)還可以與醇類物質(zhì)發(fā)生酯化。但酸含量過高或分布不平衡會(huì)使醬油的口感刺激且不協(xié)調(diào)[14]。如果通風(fēng)制曲過程中感染雜菌，由于鹽水不能很快滲透到菌絲旺盛的曲料中，雜菌就會(huì)迅速繁殖、產(chǎn)酸，使醬醪pH 值異常下降。醬汁pH 值過低會(huì)對各種酶反應(yīng)、谷氨酸鈉的生成、氮的利用等產(chǎn)生不良影響。3 組樣品中的pH 值變化見圖4。

圖4 不同發(fā)酵工藝醬汁pH 值變化Fig.4 pH changes in different brewing techniques

從圖4 可以看出，在醬油發(fā)酵前期，pH 值的降低幅度為高溫釀造組＞常溫釀造組＞低溫釀造組。這是因?yàn)榘l(fā)酵前期醬醪中主要微生物是耐鹽乳酸菌。發(fā)酵溫度越高，醬醪中乳酸菌代謝越活躍，進(jìn)而產(chǎn)生大量乳酸，從而引起醬汁pH 值降低[15]。發(fā)酵中后期，3 組醬汁的pH 值減少幅度變緩這是因?yàn)獒u醪加入酵母菌后，酵母菌和乳酸菌發(fā)生激烈競爭，乳酸菌發(fā)酵受到抑制，酵母菌發(fā)酵產(chǎn)生乙醇，醬汁的總酸和pH 值趨于穩(wěn)定[16]。

2.2.3 醬汁還原糖變化

醬汁中的還原糖不僅是微生物的代謝底物，也是美拉德反應(yīng)的底物，直接影響醬油的風(fēng)味和色澤。還原糖能夠通過美拉德反應(yīng)、焦糖化反應(yīng)影響醬油色澤，淀粉質(zhì)原料經(jīng)淀粉酶分解生成的葡萄糖、果糖、阿拉伯糖也是醬油甜味的主要成分。同時(shí)還原糖指標(biāo)的變化還能反映出酵母菌的代謝活力。3 組樣品中還原糖含量的變化結(jié)果見圖5。

從圖5 可以看出，3 組曲線均呈先升高后降低，最終趨于平穩(wěn)的趨勢，這是因?yàn)榘l(fā)酵初期的原料中淀粉被大量分解，使還原糖快速累積[17]；隨著酵母菌液的加入，酵母菌開始大量增殖、代謝，還原糖被不斷消耗；后期各種微生物活動(dòng)均減弱，還原糖含量變化不大。通過3 組對比發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵前期，還原糖含量增長幅度：高溫釀造組＞常溫釀造組＞低溫釀造組。這是因?yàn)闇囟仍礁?，淀粉酶活力越高，能夠消化產(chǎn)生更多的還原糖；發(fā)酵中期，在酵母菌的分解下，3 組還原糖含量均降低至相當(dāng)水平；發(fā)酵后期，低溫發(fā)酵組還原糖含量有小幅度降低，推測是由于美拉德反應(yīng)消耗了少量還原糖。

2.2.4 醬汁中氨基酸態(tài)氮變化

氨基酸態(tài)氮在很大程度上決定了醬油的鮮味[18]，也是醬油分級的重要指標(biāo)。大豆中的蛋白質(zhì)被堿性蛋白酶和中性蛋白酶分解成肽，谷氨酰胺酶可將原料中的谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為谷氨酸，提高醬油的鮮味[19]，構(gòu)成了醬油的特殊口味。醬汁中氨基酸態(tài)氮的含量結(jié)果見圖6。

從圖6 可以看出，醬汁中的氨基酸態(tài)氮含量均出現(xiàn)前期急速升高，后期較穩(wěn)定的規(guī)律。在發(fā)酵前期，3組氨基酸態(tài)氮含量增長幅度為高溫釀造組＞常溫釀造組＞低溫釀造組，這是因?yàn)樵诟邷刈饔孟拢敲附獾陌被岷碗娜艹龆?，造成初期氨基酸態(tài)氮含量急速升高。發(fā)酵中期，低溫釀造組保持較快增長。這是因?yàn)榈蜏赜欣诿富盍Φ谋４妫鞍酌傅淖饔脮r(shí)間延長[20]，在發(fā)酵中期依然能夠分解蛋白原料。發(fā)酵后期，氨基酸態(tài)氮只有小幅度波動(dòng)。

2.2.5 醬汁中全氮的變化

全氮包括蛋白質(zhì)、胨、肽類、氨基酸等可溶性含氮物質(zhì)。全氮含量是高鹽稀態(tài)醬油重要的分級指標(biāo)，也是醬油發(fā)酵成熟與否、發(fā)酵品質(zhì)高低的重要衡量指標(biāo)。醬汁中全氮的含量結(jié)果見圖7。

圖7 不同發(fā)酵工藝全氮變化Fig.7 Total nitrogen content changes in different brewing techniques

從圖7 可以看出，3 組全氮指標(biāo)均出現(xiàn)前期升高，中后期小范圍波動(dòng)的規(guī)律。發(fā)酵前期，高溫釀造組全氮峰值最高，中后期變化不大，出現(xiàn)了小幅度波動(dòng)。低溫釀造組全氮指標(biāo)在前、中期持續(xù)升高，常溫釀造組處于中間值。

2.3 原油的理化指標(biāo)

3 組醬醪經(jīng)壓榨、超高溫消毒法滅菌（ultra high temperature treated，UHT）、終沉淀后，獲得原油，取樣測定理化指標(biāo)，結(jié)果見表2。

表2 原油理化指標(biāo)對比Table 2 Comparison of physicochemical indicators of crude oil

從表2 可以看出，低溫釀造組氨基酸態(tài)氮、全氮含量最高，其次是常溫釀造組，高溫釀造組品質(zhì)最低。證明低溫釀造工藝下，蛋白質(zhì)的消化率最高，蛋白酶的作用發(fā)揮更充分；高溫釀造組醬油的可溶性無鹽固形物含量最高，這是因?yàn)榘l(fā)酵初期的高溫使得曲料中的物質(zhì)溶出更充分；低溫釀造組醬油色值最淺，其次是常溫釀造組，高溫釀造組醬油顏色最深，這與美拉德反應(yīng)的強(qiáng)弱直接相關(guān)。

2.4 原油的感官分析

將壓榨、UHT 滅菌、沉淀后的原油，進(jìn)行品評試驗(yàn)。品評結(jié)果見圖8。

圖8 感官評價(jià)結(jié)果Fig.8 Results of sensory evaluation

從圖8 可以看出，低溫釀造組在色澤、香氣、滋味、體態(tài)4 個(gè)維度均獲得最高分，常溫釀造組處于中間位置，高溫釀造組原油得分最低。

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過品評，低溫釀造組原油品質(zhì)高，酯香、醇香濃郁，適合蘸食等高品質(zhì)產(chǎn)品，但同時(shí)耗能較大，實(shí)際生產(chǎn)中為了取得充分后熟風(fēng)味，需要延長發(fā)酵時(shí)間；常溫釀造組能耗小，原油各項(xiàng)指標(biāo)較均衡，適用于常規(guī)類產(chǎn)品；高溫釀造組可溶性無鹽固形物含量高，原油顏色較深，適合老抽、紅燒類產(chǎn)品。同時(shí)由于高溫發(fā)酵條件下，各項(xiàng)理化指標(biāo)均在前期就達(dá)到峰值，因此可適當(dāng)縮短發(fā)酵周期。今后可以針對醬油產(chǎn)品的特性要求和周轉(zhuǎn)情況，選取適合的發(fā)酵工藝。