羅志梅，劉虹延，孫得勝

（遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 1.呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，2.中醫(yī)科，貴州 遵義 563003）

基因治療是借助載體把特定的基因序列導(dǎo)入靶細(xì)胞，通過(guò)對(duì)某種基因進(jìn)行敲減或者過(guò)表達(dá)，發(fā)揮其相應(yīng)的功能，達(dá)到對(duì)相關(guān)疾病進(jìn)行治療的目的。重組腺相關(guān)病毒（recombinant adeno-associated virus,rAAV）因其能夠長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定表達(dá)、對(duì)機(jī)體無(wú)致病性、良好的安全性等優(yōu)點(diǎn)，漸漸被更多的研究人員青睞，已成為當(dāng)前基因治療研究領(lǐng)域中最熱門的載體之一[1]。

腺相關(guān)病毒（adeno-associated virus,AAV）分為多個(gè)不同的血清型，不同分型的AAV對(duì)其相應(yīng)的特定組織有特殊的親嗜作用，如AAV1對(duì)血管組織有特殊的親嗜特性。如果以AAV1作為載體，聯(lián)合氣道內(nèi)給藥方式，有望構(gòu)建肺血管基因干預(yù)模型。因?yàn)樵谶@種情況下，經(jīng)氣道輸入的藥物會(huì)主要分布于肺部血管，復(fù)制肺血管疾病模型的效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于傳統(tǒng)的使用慢病毒載體或全身基因敲除方法及經(jīng)血管注藥等給藥方式。

肺動(dòng)脈高壓的特點(diǎn)是肺動(dòng)脈及右心室收縮壓升高，常常引起右心功能不全，預(yù)后較差，還往往存在肺遠(yuǎn)端小血管的重塑[2-5]。本課題組前期實(shí)驗(yàn)顯示，轉(zhuǎn)錄因子KLF4可能在肺動(dòng)脈高壓的起病中扮演重要角色。肺動(dòng)脈高壓模型組發(fā)生肺血管重塑的肺動(dòng)脈中的KLF4表達(dá)明顯升高，與此同時(shí)，標(biāo)志肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖水平的增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen,PCNA）也明顯增多。體外研究還發(fā)現(xiàn)，KLF4通過(guò)調(diào)節(jié)AKT的磷酸化影響肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖和遷移[6]。而沉默KLF4基因，能夠有效地阻止肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的失控性增殖和遷移，所以進(jìn)一步探討敲減肺血管中的KLF4，并檢測(cè)相應(yīng)指標(biāo)，觀察其能否有效地緩解肺動(dòng)脈高壓勢(shì)在必行。

本研究擬將已驗(yàn)證有效的KLF4小干擾鏈與AAV1病毒載體結(jié)合，構(gòu)建沉默KLF4基因的重組腺相關(guān)病毒載體，進(jìn)一步擴(kuò)增、包裝病毒載體，并在長(zhǎng)時(shí)間（3個(gè)月）香煙煙霧刺激誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型中使用，為后期KLF4基因敲減在大鼠肺動(dòng)脈高壓中的預(yù)防和治療作用，以及相關(guān)分子機(jī)制的深入研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與動(dòng)物

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料 載體pHBAAV-U6-MCS-CMVEGFP（上海漢恒科技公司），大腸桿菌菌株DH5α（上海漢恒科技公司），限制性內(nèi)切酶（上海Thermo公司），T4連接酶（上海Fermentas公司），凝膠回收試劑盒（上海捷瑞生物公司），瓊脂糖/粉（上海生工生物工程股份有限公司），DNA ladder（江蘇康潤(rùn)生物科技公司），KLF4的小干擾序列（武漢聚能生物公司），胎牛血清（上海Gibco公司），胰蛋白酶（上海Thermo公司），質(zhì)粒DNA大量抽提試劑盒（北京Tiangen公司），腺相關(guān)病毒純化試劑盒（上海Biomiga公司），LipofiterTM（上海漢恒生物科技公司），Benonase（上海Sigma公司），真核轉(zhuǎn)染試劑（上海漢恒科技公司），DNase I（上海Fermentas公司），原代大鼠肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（廣州吉尼歐生物公司），AAV-293細(xì)胞（上海漢恒科技公司），PowerLab生物數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)（澳大利亞ADInstruments公司），香煙煙霧暴露動(dòng)物染毒系統(tǒng)（本研究團(tuán)隊(duì)自主研發(fā)，專利號(hào)：ZL201820234399.3）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 36只SPF級(jí)成年雄性SD大鼠，8周齡，體重185～225 g，購(gòu)自湖北實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（鄂）2015-0018]。模型復(fù)制、測(cè)壓等動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作均在華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心進(jìn)行[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（鄂）2021-0057]。本研究由華中科技大學(xué)附屬同濟(jì)醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 確定siRNA序列 根據(jù)本課題組前期研究結(jié)果[6]，設(shè)計(jì)針對(duì)大鼠KLF4基因特異性的siRNA序列，基于siRNA序列（GenBank Acc.NM_053713.1）進(jìn)行KLF4 shRNA的設(shè)計(jì)，并采用ELBASHIR等[7]報(bào)道的方法進(jìn)行篩選，得到沉默效果理想的siRNA序列5'-CACCCACACTTGTGACTAT-3'。本研究選用的陰性對(duì)照序列為5'-TTCTCCGAACGTGTCACGTAA-3'。

1.2.2 通過(guò)酶切技術(shù)構(gòu)建病毒載體 以pHBAAVU6- MCS-CMV-EGFP作為空白載體，通過(guò)酶切技術(shù)構(gòu)建帶有GFP熒光標(biāo)記的KLF4干擾腺病毒載體pHBAAV-r-KLF4 shRNA-GFP。具體方法：根據(jù)之前實(shí)驗(yàn)中篩選的有效靶點(diǎn)合成相關(guān)引物，然后進(jìn)一步退火形成雙鏈片段，用EcoRI、BamHI酶切載體通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)產(chǎn)物，在凝膠切下目標(biāo)載體條以回收凝膠，把siRNA目的序列插入U(xiǎn)6啟動(dòng)子之后來(lái)調(diào)控其表達(dá)，得到連接的產(chǎn)物，將其轉(zhuǎn)化到大腸桿菌dh5a的感受態(tài)細(xì)胞中，并把克隆進(jìn)行測(cè)序及比對(duì)[8]。

1.2.3 載體測(cè)序鑒定 轉(zhuǎn)化后的KLF4-shRNA平板挑菌，37 ℃ 250 r/min搖菌14 h，對(duì)細(xì)菌溶液進(jìn)行測(cè)序，并通過(guò)DNA測(cè)序進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.4 載體包裝、擴(kuò)增及純化 重組質(zhì)粒pHBAAV-r-KLF4 shRNA-GFP、包裝質(zhì)粒pAAV-RC及輔助質(zhì)粒pHelper共轉(zhuǎn)染AAV-293細(xì)胞，得到表達(dá) EGFP 和KLF4-shRNA 的AAV1。對(duì)構(gòu)建的輔助質(zhì)粒及載體進(jìn)一步提取，濃度超過(guò)1 g/L，A260/280在1.7～1.8可用于病毒包裝。將用于包裝的細(xì)胞株AAV-293細(xì)胞以DMEM + 10% FBS，37 ℃，5% CO2，相對(duì)濕度95%的條件培養(yǎng)。重組病毒顆粒的純化參照文獻(xiàn)[9]的方法進(jìn)行。

1.2.5 載體滴度測(cè)定 通過(guò)PCR檢測(cè)確定包裝好的病毒載體的滴度。通過(guò)檢測(cè)病毒基因組中rAAV載體的基因組拷貝數(shù)來(lái)測(cè)定rAAV的病毒顆粒數(shù)，滴度單位用v.g./mL來(lái)表示。參照標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)描繪標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算AAV病毒滴度。

1.2.6 動(dòng)物模型復(fù)制及治療干預(yù) 采用隨機(jī)數(shù)字表法將36只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組（6只）和香煙煙霧刺激組（30只）。置于本課題組自行研制的香煙煙霧染毒箱系統(tǒng)內(nèi)，參考本課題組之前的方法進(jìn)行香煙煙霧刺激[10]，香煙煙霧刺激復(fù)制模型3個(gè)月后，將香煙煙霧刺激組27只大鼠（前段實(shí)驗(yàn)中接受煙霧刺激的大鼠死亡3只）隨機(jī)分為生理鹽水模型組、對(duì)照病毒模型組（AAV1-control vector）、治療干預(yù)組（AAV1-KLF4-shRNA）組，每組9只。治療干預(yù)組和對(duì)照病毒模型組分別經(jīng)氣道給藥125 μL/只、100 μL/只。繼續(xù)按前述香煙煙霧刺激方法復(fù)制模型1個(gè)月。健康對(duì)照組大鼠不做任何處理。

1.2.7 右心導(dǎo)管法檢測(cè)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo) 大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉。進(jìn)入麻醉狀態(tài)后，把大鼠固定在手術(shù)臺(tái)上，小心暴露氣管后，進(jìn)行氣管內(nèi)插管，把氣管內(nèi)導(dǎo)管與小動(dòng)物呼吸機(jī)連接。潮氣量為2 mL/100 g，呼吸頻率設(shè)為70次/min，呼吸比為1∶1。采用右心導(dǎo)管法檢測(cè)血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)，具體方法：切開(kāi)大鼠的頸部皮膚，分離大鼠頸靜脈，結(jié)扎靜脈遠(yuǎn)端，在靜脈的近心端剪一楔形口，隨之順勢(shì)將內(nèi)置有導(dǎo)絲的測(cè)量管插入（導(dǎo)管末端連接探測(cè)儀），并輕輕地向前推進(jìn)，后經(jīng)鎖骨下靜脈進(jìn)入右心房，然后緩慢進(jìn)入右心室，此時(shí)可見(jiàn)導(dǎo)管內(nèi)有血液回流，立即退出導(dǎo)絲，觀察波形并調(diào)整導(dǎo)管方向，待波形呈典型右心室壓力波形并穩(wěn)定后記錄，最后以PowerLab軟件分析右心室收縮壓和平均右心室壓。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用Graph Pad Prism 8.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 序列

與對(duì)照病毒載體siRNA相對(duì)應(yīng)的shRNA序列見(jiàn)表1；KLF4-shRNA序列見(jiàn)表2。

表1 與對(duì)照病毒載體siRNA相對(duì)應(yīng)的shRNA序列

表2 與對(duì)照病毒載體siRNA相對(duì)應(yīng)的KLF4-shRNA序列

2.2 KLF4-shRNA測(cè)序結(jié)果

KLF4-shRNA測(cè)序結(jié)果（下劃線為目的序列）。

CGGTGAGATTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTT GTGGAAGGACGAAACACCGGTCCGCAGAATTCGCAC CCACACTTGTGACTATTTCAAGAGAATAGTCACAAGT GTGGGTGTTTTTTGATCCATTAGGCGGCCGCGTGGAT AACCGTATTACCGCCATGCATTAGTTATTAATAGTAA TCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGG AGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCC TGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTC AATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGG GACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGG TAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATA TGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTA AATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTT ATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTA GTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGT ACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGG GATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAG TTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAA TGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGC GGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGA GCTGGTTTAGTGAACCGTCAGATCCGCTAGCGCCACC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTG GTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAAC GGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGC GATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCT GCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCC TCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAG CCGCTACCCCGACCA

對(duì)插入片段與測(cè)序結(jié)果比對(duì)，結(jié)果證實(shí)所選送測(cè)序的重組載體堿基序列完全正確，位于測(cè)序圖中62～120位（59個(gè)堿基）（見(jiàn)圖1）。

圖1 KLF4-shRNA測(cè)序結(jié)果

2.3 拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)對(duì)AAV標(biāo)準(zhǔn)品的Ct的影響

根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以每組AAV標(biāo)準(zhǔn)品的Ct（average）為縱坐標(biāo)Y，取其對(duì)應(yīng)的拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)X，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線的函數(shù)公式及R方值。R2=0.9909。見(jiàn)圖2。

圖2 根據(jù)實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 病毒載體滴度計(jì)算公式

通過(guò)比對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算病毒基因組拷貝數(shù)，將待測(cè)AAV樣品Ct均值代入公式中測(cè)定結(jié)果：

HBAAV2/1-r-KLF4 shRNA1-GFP滴度=107.48×40 000=1.2×1012v.g./mL

對(duì)照病毒HBAAV2/1-GFP滴度=107.58×40 000=1.5×1012v.g./mL

2.5 各組大鼠右心室收縮壓和平均右心室壓的比較

給予香煙刺激的3組大鼠明顯倦怠、少動(dòng)。將熏煙的大鼠再次分組后的1個(gè)月期間，生理鹽水模型組和對(duì)照病毒模型組分別死亡2只大鼠，治療干預(yù)組有1只死亡。健康對(duì)照組、生理鹽水模型組、對(duì)照病毒模型組、治療干預(yù)組的右心室收縮壓和平均右心室壓比較，經(jīng)方差分析，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。進(jìn)一步兩兩比較結(jié)果：生理鹽水模型組和對(duì)照病毒模型組大鼠的右心室收縮壓和平均右心室壓較健康對(duì)照組升高（P<0.05）；治療干預(yù)組的右心室收縮壓和平均右心室壓較生理鹽水模型組和對(duì)照病毒模型組降低（P<0.05）。見(jiàn)表3。

表3 4組大鼠右心室收縮壓和平均右心室壓的比較（mmHg，±s）

表3 4組大鼠右心室收縮壓和平均右心室壓的比較（mmHg，±s）

注：①與健康對(duì)照組比較，P <0.05；②與治療干預(yù)組比較，P <0.05。

平均右心室壓14.6±4.7 24.4±4.5①②23.7±5.8①②13.5±2.8 9.381 0.000組別健康對(duì)照組生理鹽水模型組對(duì)照病毒模型組治療干預(yù)組F 值P 值n6 7 7 8右心室收縮壓20.0±2.7 40.1±8.5①②44.9±10.7①②25.9±5.2 17.570 0.029

3 討論

作為一種常見(jiàn)的肺血管疾病，肺動(dòng)脈高壓目前尚無(wú)效果好、副作用小的理想藥物，口服藥或者靜脈用藥因藥物需要進(jìn)入血液循環(huán)，常常伴隨其他臟器的副作用，引起不良反應(yīng)。而呼吸科常用的霧化吸入等局部氣道給藥方式，雖然只主要作用于肺臟局部，但常常藥物只是沉積于氣管和肺泡組織，不容易有效作用于肺部血管。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，1型腺相關(guān)病毒（AAV1）對(duì)血管有特殊的親嗜性，以AAV1為載體攜帶特定基因，經(jīng)氣道注藥，可以靶向作用于肺血管[11-12]。

本研究構(gòu)建了一種帶有GFP熒光標(biāo)記的靶向沉默KLF4基因的重組腺相關(guān)病毒rAAV1-KLF4-shRNA，將其轉(zhuǎn)染到大鼠肺動(dòng)脈中，結(jié)合本課題組既往研究證實(shí)在KLF4基因敲除的大鼠肺動(dòng)脈高壓明顯改善[6]，本研究中轉(zhuǎn)染KLF4干擾腺病毒載體的動(dòng)物模型血流動(dòng)力學(xué)明顯改善，進(jìn)一步證明了轉(zhuǎn)染KLF4干擾腺病毒載體對(duì)改善香煙煙霧誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈高壓有效果，從側(cè)面進(jìn)一步說(shuō)明病毒載體構(gòu)建成功。因?yàn)锳AV1對(duì)血管組織具有特殊的親和力，而且本研究采用了經(jīng)氣管給藥的操作，所以rAAV1-KLF4-shRNA在肺血管中能夠穩(wěn)定地發(fā)揮作用。

本研究把空載體經(jīng)EcoRI和BamHI酶切，接著將siRNA目的序列插入到U6啟動(dòng)子，調(diào)控其表達(dá)，此病毒載體含有CMV啟動(dòng)子調(diào)控的增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）基因表達(dá)；而GFP的表達(dá)受CMV啟動(dòng)子調(diào)節(jié)，通過(guò)觀測(cè)GFP的表達(dá)，可以判斷相關(guān)病毒載體在體內(nèi)的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。測(cè)序檢測(cè)的結(jié)果表明，本研究獲得的載體序列是正確的。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中，在每個(gè)PCR循環(huán)后使用熒光化學(xué)物測(cè)量產(chǎn)物量的實(shí)驗(yàn)檢測(cè)手段。PCR擴(kuò)增的過(guò)程中，摻入熒光染料，然后經(jīng)染料發(fā)出的信號(hào)實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR的過(guò)程。由于在擴(kuò)增的指數(shù)階段，模板Ct值和該模板的初始拷貝數(shù)之間呈線性關(guān)系，所以成為定量的依據(jù)。本研究通過(guò)SYBRGreen I法來(lái)檢測(cè)AAV基因組的含量，并最終計(jì)算出所制備的AAV的具體滴度。

本研究中利用了AAV1對(duì)血管組織有特殊的親嗜特性這一特點(diǎn)，聯(lián)合氣道內(nèi)給藥的用藥方式，進(jìn)行治療干預(yù)。首先，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，生理鹽水模型組和對(duì)照病毒模型組大鼠的右心室收縮壓和平均右心室壓均比健康對(duì)照組升高，按肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型的研究慣例[5，13]，可認(rèn)為肺動(dòng)脈高壓模型復(fù)制成功。同時(shí)，治療干預(yù)組的右心室收縮壓和平均右心室壓較生理鹽水模型組和對(duì)照病毒模型組降低，提示AAV1-KLF4-shRNA治療干預(yù)有效，表明這種靶向敲減KLF4基因的重組腺相關(guān)病毒載體可以在肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物模型的治療中發(fā)揮作用。

AAV因著具有免疫原性低、表達(dá)時(shí)間長(zhǎng)、有組織選擇性、親和特性等優(yōu)點(diǎn)，近些年越來(lái)越多地被用作基因治療的載體，已經(jīng)成為當(dāng)前最有前景的基因治療工具之一[14-23]。AAV整合到宿主的基因組中的概率很低[24]，與腺病毒、慢病毒等廣泛應(yīng)用于基因治療的其他常用病毒載體相比，AAV幾乎不會(huì)引起炎癥反應(yīng)，對(duì)人體無(wú)致病性[17，25]。迄今為止，尚未發(fā)現(xiàn)AAV與人類的疾病有關(guān)?；谏鲜鰞?yōu)點(diǎn)，AAV在近幾年也逐漸被用于臨床患者的基因治療[26]，包括首例以AAV1為病毒載體的基因治療[27]。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建了靶向敲減KLF4基因的重組腺相關(guān)病毒載體，并證實(shí)其在相關(guān)疾病動(dòng)物模型中應(yīng)用有效，為后期順利開(kāi)展有關(guān)AAV1-KLF4-shRNA在肺動(dòng)脈高壓中的預(yù)防和治療作用及相關(guān)分子機(jī)制的深入研究提供了基礎(chǔ)條件。