陳培，陳小菊，杜竺蔓，汪操會(huì)

（1.成都大學(xué)附屬醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，四川 成都 610081；2.成都市金牛區(qū)營門口社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心 全科醫(yī)學(xué)科，四川 成都 610031）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease,COPD）是一種以持續(xù)存在的氣流受限為特征的常見、多發(fā)呼吸道疾病，因其氣流受限不完全可逆，病情常呈現(xiàn)逐年緩慢進(jìn)展合并急性加重的臨床特點(diǎn)[1]。急性加重性炎癥的反復(fù)發(fā)作及氧化應(yīng)激導(dǎo)致的呼吸道組織細(xì)胞損傷是COPD患者死亡的主要原因[2]。目前臨床仍缺乏有效治療COPD的手段[3]，因此探索新的COPD治療策略具有重要意義。長期暴露于香煙環(huán)境是誘發(fā)COPD的關(guān)鍵危險(xiǎn)因素之一[4]。以往研究表明，連續(xù)暴露于香煙環(huán)境6個(gè)月以上可復(fù)制穩(wěn)定的COPD動(dòng)物模型[5]。近年來，應(yīng)用香煙煙霧聯(lián)合脂多糖導(dǎo)致COPD炎癥和黏液分泌過多的COPD動(dòng)物模型得到了廣泛應(yīng)用。研究指出香煙煙霧聯(lián)合脂多糖可以誘導(dǎo)促炎癥細(xì)胞因子的釋放，如腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）和干擾素-γ（Interferon-γ,INF-γ）等炎癥因子，從而更有效地模擬COPD病程發(fā)展及特征性呼吸道病理學(xué)改變[6-7]。

NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NODlike receptor family pyrin domain containing 3,NLRP3）的炎癥體研究最廣泛，其能感知一系列致病、環(huán)境和宿主衍生的因素[8]。既往研究指出NLRP3參與COPD的發(fā)生、發(fā)展[9-12]。NLRP3激活后結(jié)合并激活凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase-recruitment domain,ASC），促進(jìn)半胱氨酸蛋白酶-1（cysteinyl aspartate specific proteinase 1,Caspase-1）形成炎癥體復(fù)合物，啟動(dòng)Caspase-1的自催化裂解并促進(jìn)白細(xì)胞介素-1β（Interleukin-1β,IL-1β）和白細(xì)胞介素-18（Interleukin-18,IL-18）的分泌，最終引起呼吸道組織細(xì)胞破壞，引發(fā)COPD[13-14]。因此，針對NLRP3這一潛在治療靶點(diǎn)改善或逆轉(zhuǎn)COPD的發(fā)生、發(fā)展具有很高的研究價(jià)值。本研究通過復(fù)制COPD大鼠模型，探討NLRP3抑制劑MCC950對COPD的潛在治療效果。

1 材料與方法

1.1 主要材料和儀器

NLRP3抑制劑MCC950（上海陶術(shù)生物科技有限公司），脂多糖（北京金克隆生物技術(shù)），NLRP3抗體（深圳欣博盛生物科技），裂解的半胱氨酸蛋白酶-1（cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 1,Cleaved caspase-1）抗體（武漢菲恩生物科技有限公司），ASC抗體、β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）抗體（美國Santa Cruz公司），Goat Anti-Rabbit IgG（H+L）HRP（普健生物武漢科技有限公司），Mouse ELISA試劑盒（杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司），蘇木精-伊紅（hematoxylin-eosin,HE）染色試劑盒（上海歌凡生物科技有限公司），RIPA（Radio Immunoprecipitation Assay）裂解液（上?？道噬锟萍加邢薰荆?，磷酸鹽緩沖液（phosphate-buffered saline,PBS）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），戊巴比妥鈉（北京索萊寶科技有限公司）。石蠟切片機(jī)、低溫高速離心機(jī)（美國Thermo Fisher Scientific公司），熒光顯微鏡（上海光密儀器有限公司），凝膠成像系統(tǒng)（上海嘉鵬科技有限公司），酶標(biāo)儀（美國BioTek公司），蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)全套設(shè)備（德國Protec公司）。

1.2 動(dòng)物模型復(fù)制和分組

雄性SD大鼠（6～8周齡）60只購自南京集萃藥康公司（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK蘇2021-0013；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK蘇2021-00162023-06-05），飼養(yǎng)在（23±1） ℃、12/12 h晝夜交替環(huán)境中，正常給予飼料和純凈水。小鼠隨機(jī)分為對照組、COPD組和MCC950組，每組20只。COPD組和MCC950組大鼠參考文獻(xiàn)[10]的方法使用脂多糖和香煙煙霧聯(lián)合誘導(dǎo)30 d復(fù)制COPD大鼠模型，對照組不做任何處理。模型復(fù)制前24 h MCC950組大鼠腹腔注射60 mg/kg MCC950，對照組與COPD組大鼠注射等量PBS。第31天使用戊巴比妥鈉（200 mg/kg）安樂死所有大鼠，并收集實(shí)驗(yàn)標(biāo)本。本實(shí)驗(yàn)得到醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.3 HE染色分析大鼠肺組織病理變化

通過戊巴比妥鈉安樂死大鼠后，立即使用PBS灌注肺部，4 ℃條件下4%多聚甲醛中固定過夜，次日酒精梯度脫水，石蠟包埋肺組織，切片（厚度5 μm）。蘇木精和伊紅依次染色。炎癥程度評估標(biāo)準(zhǔn)采用0～4分的5點(diǎn)法進(jìn)行評估：0分，無炎癥表現(xiàn)；1分，輕度炎癥；2分，中度炎癥；3分，重度炎癥；4分，非常重度炎癥。使用Image J圖像分析軟件測量各組大鼠細(xì)支氣管壁厚度，并計(jì)算管壁面積和管壁面積/腔周長。

1.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測定大鼠氣管重塑相關(guān)因子水平

大鼠安樂死后，用軟管通過氣管插管后，用5 μL預(yù)冷PBS進(jìn)行灌洗，重復(fù)3次，收集其支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測定BALF中的基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2,MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9,MMP-9）、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-1（tissue inhibitor of metalloproteinases-1,TIMP-1）、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑-2（tissue inhibitor of metalloproteinases-2,TIMP-2）、TNF-α、白細(xì)胞介素-6（Interleukin 6,IL-6）水平，操作過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.5 Western blotting檢測NLRP3、Cleaved caspase-1和ASC蛋白表達(dá)

大鼠肺組織經(jīng)PBS清洗后，用RIPA緩沖液勻漿，并在100 ℃下煮沸10 min。總蛋白在4%～12%的SDS-PAGE上分離并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。室溫下用TBST（50 nmol Tris-HCl，150 mmol NaCl，0.05% Tween 20，pH 7.5）中的5%脫脂牛奶阻斷1 h后，4 ℃條件下用一級(jí)特異性抗體（NLRP3、Cleaved caspase-1、ASC和GAPDH）孵育過夜，隨后在室溫下用二級(jí)HRP結(jié)合的抗體孵育4 h。使用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒對蛋白顯影。GAPDH為內(nèi)參蛋白，使用Quantity One軟件分析各組蛋白灰度值。

1.6 大鼠嗜酸性粒細(xì)胞及趨化因子水平檢測

模型復(fù)制第30天時(shí)，使用戊巴比妥鈉（30 mg/kg）麻醉大鼠，抽取各組大鼠靜脈血2 mL，采用美國貝克曼庫爾特公司dXh 800型全自動(dòng)血液分析儀測定嗜酸性粒細(xì)胞水平；采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測定血清嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺組織病理結(jié)構(gòu)變化

HE染色結(jié)果顯示，對照組大鼠的肺組織形態(tài)正常，而COPD組表現(xiàn)出嚴(yán)重的病理損傷和炎癥細(xì)胞大量聚集。與COPD組比較，MCC950組大鼠的肺組織損傷得到改善，炎癥細(xì)胞數(shù)量減少。見圖1。

圖1 各組大鼠肺組織病理變化 （HE染色×400）

對照組、COPD組和MCC950組炎癥程度評分分別為（0.52±0.01）、（3.76±0.05）、（1.34±0.02）分，3組比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=14.673，P=0.000）；與對照組比較，COPD組炎癥程度評分增加（P<0.05）；與COPD組比較，MCC950組炎癥程度評分降低（P<0.05）。

2.2 各組大鼠細(xì)支氣管壁厚度、管壁面積、管壁面積/腔周長比較

對照組、COPD組和MCC950組大鼠細(xì)支氣管壁厚度、管壁面積和管壁面積/腔周長比較，經(jīng)方差分析，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與對照組比較，COPD組大鼠細(xì)支氣管壁厚度、管壁面積和管壁面積/腔周長均升高（P<0.05）；與COPD組比較，MCC950組大鼠細(xì)支氣管壁厚度、管壁面積和管壁面積/腔周長均降低（P<0.05）。見表1。

表1 各組大鼠細(xì)支氣管壁厚度、管壁面積和管壁面積/腔周長比較 （n=20，±s）

表1 各組大鼠細(xì)支氣管壁厚度、管壁面積和管壁面積/腔周長比較 （n=20，±s）

注：①與對照組比較，P <0.05；②與COPD組比較，P <0.05。

組別對照組COPD組MCC950組F 值P 值管壁面積/腔周長/（μm/mm2）3.22±0.03 5.02±0.09①4.33±0.01①②17.582 0.000細(xì)支氣管壁厚度/μm 3.92±0.02 4.33±0.03①4.14±0.03①②11.181 0.000管壁面積/mm2 3.23±0.07 5.12±0.06①3.63±0.01①②21.161 0.000

2.3 各組大鼠MMP-2、MMP-9、TNF-α、TIMP-1、TIMP-2和IL-6水平比較

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)結(jié)果顯示，對照組、COPD組和MCC950組的MMP-2、MMP-9、TNF-α、TIMP-1、TIMP-2和IL-6水平比較，經(jīng)方差分析，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與對照組相比，COPD組大鼠血清MMP-2、MMP-9、TNF-α和IL-6水平均增加，TIMP-1和TIMP-2水平均降低（P<0.05）；與COPD組相比，MCC950組大鼠血清MMP-2、MMP-9、TNF-α和IL-6水平均降低，TIMP-1和TIMP-2水平均增加（P<0.05）。見表2。

表2 各組大鼠的氣管重塑相關(guān)因子水平比較 （n=20，±s）

表2 各組大鼠的氣管重塑相關(guān)因子水平比較 （n=20，±s）

注：①與對照組比較，P <0.05；②與COPD組比較，P <0.05。

組別對照組COPD組MCC950組F 值P 值IL-6 51.36±7.01 152.17±6.05①73.41±2..01①②16.982 0.000 MMP-2 50.12±3.03 101.26±6.05①55.16±1.02①②17.846 0.000 MMP-9 120.12±5.01 243.16±6.05①179.62±8.01①②18.861 0.000 TNF-α 49.62±1.01 132.27±2.05①73.41±2.01①②26.052 0.000 TIMP-1 98.92±8.03 39.76±9.05①72.46±2.02①②13.213 0.000 TIMP-2 125.32±10.01 46.26±9.05①70.32±6.01①②15.571 0.000

2.4 各組大鼠NLRP3、Cleaved caspase-1和ASC蛋白相對表達(dá)量比較

對照組、COPD組、MCC950組大鼠的NLRP3、Cleaved caspase-1和ASC蛋白相對表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；與對照組比較，COPD組NLRP3、Cleaved caspase-1和ASC蛋白相對表達(dá)量均升高（P<0.05），與COPD組比較，MCC950組NLRP3、Cleaved caspase-1和ASC蛋白相對表達(dá)量均降低（P<0.05）。見圖2和表3。

表3 各組的NLRP3、Cleaved caspase-1和ASC蛋白相對表達(dá)量的比較 （n=20，±s）

表3 各組的NLRP3、Cleaved caspase-1和ASC蛋白相對表達(dá)量的比較 （n=20，±s）

注：①與對照組比較，P <0.05；②與COPD組比較，P <0.05。

組別對照組COPD組MCC950組F 值P 值A(chǔ)SC 0.32±0.01 0.77±0.05①0.41±0.01①②16.002 0.000 NLRP3 0.22±0.03 0.96±0.05①0.44±0.02①②12.002 0.000 Cleaved caspase-1 0.12±0.01 0.59±0.05①0.32±0.01①②16.301 0.000

圖2 各組大鼠NLRP3相關(guān)蛋白表達(dá)

2.5 各組大鼠嗜酸性粒細(xì)胞及趨化因子水平比較

對照組、COPD組和MCC950組大鼠靜脈血嗜酸性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子水平比較，經(jīng)方差分析，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。與對照組比較，COPD組大鼠靜脈血嗜酸性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子水平均增加（P<0.05）；與COPD組比較，MCC950組大鼠靜脈血嗜酸性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子水平均降低（P<0.05）。見表4。

表4 各組大鼠嗜酸性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子水平比較 （n=20，±s）

表4 各組大鼠嗜酸性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子水平比較 （n=20，±s）

注：①與對照組比較，P <0.05；②與COPD組比較，P <0.05。

組別對照組COPD組MCC950組F 值P 值嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子/（g/L）0.13±0.01 0.32±0.02①0.22±0.01①②13.313 0.000嗜酸性粒細(xì)胞/%2.56±0.02 4.93±0.03①2.63±0.03①②19.109 0.000

3 討論

COPD是一種常見的慢性肺疾病，常造成不完全可逆氣流受限，嚴(yán)重影響患者預(yù)后。探尋參與COPD發(fā)病的關(guān)鍵因子是治療COPD的臨床熱點(diǎn)，既往研究證實(shí)香煙是發(fā)生COPD的重要誘因之一，而NLRP3參與了COPD病程的進(jìn)展[4-14]，因此本研究采用香煙煙霧聯(lián)合LPS復(fù)制COPD大鼠模型。MCC950作為NLRP3抑制劑治療相關(guān)疾病已在多項(xiàng)研究中得到證實(shí)，MCC950與NLRP3特征性結(jié)合后通過影響后者翻譯后修飾過程，從而影響后者的活化，繼而阻斷NLRP3介導(dǎo)的炎癥通路[15-16]。目前，MCC950已在治療動(dòng)脈粥樣硬化[17]、缺血再灌注損傷[18]及多種炎癥疾病的動(dòng)物模型中得到了積極的效果[19]，但對COPD動(dòng)物模型的治療效果尚且缺乏相關(guān)研究，因此本研究探索了MCC950在COPD動(dòng)物模型中的治療效果。

本研究組織病理學(xué)分析結(jié)果證實(shí)COPD組大鼠支氣管黏液分泌，炎癥細(xì)胞和大鼠的細(xì)支氣管壁厚度、管壁面積、管壁面積和腔周長增加，而MCC950處理后COPD呼吸道相關(guān)炎癥表現(xiàn)及組織損傷得到顯著緩解。MMP-2/TIMP-2、MMP-9/TIMP-1是COPD潛在生物學(xué)標(biāo)志物，COPD患者其血清水平升高[20-23]。TNF-α、IL-6作為炎癥反應(yīng)關(guān)鍵效應(yīng)分子，也參與COPD的病程進(jìn)展，在COPD急性加重期發(fā)揮重要作用[24-25]。本研究結(jié)果提示COPD組大鼠血清氣管重塑相關(guān)因子MMP-2、MMP-9、TNF-α、IL-6水平升高，TIMP-1、TIMP-2水平降低，而MCC950處理后，以上指標(biāo)得到逆轉(zhuǎn)。既往研究證實(shí)COPD患者中，高濃度的痰液和血液嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)與特定的臨床表型有關(guān)[26]。在穩(wěn)定期和加重期COPD患者中，約40%患者觀察到嗜酸性氣管炎癥，約28%加重期患者發(fā)現(xiàn)痰嗜酸性氣管炎癥[27]。因此，嗜酸性粒細(xì)胞炎癥被認(rèn)為是COPD患者的特征。在一項(xiàng)隨機(jī)、平行組研究中[28]，血液嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)≥ 2%，即細(xì)胞接近于≥ 150個(gè)/μL，與COPD加重有關(guān)；在初級(jí)保健機(jī)構(gòu)中約50% COPD患者的細(xì)胞計(jì)數(shù)持續(xù)≥150個(gè)/μL。本研究發(fā)現(xiàn)，與COPD組比較，MCC950組大鼠靜脈血嗜酸性粒細(xì)胞水平降低。這一結(jié)果再次佐證抑制NLRP3可有效緩解COPD大鼠肺組織損傷。

本研究首次證實(shí)，MCC950通過下調(diào)NLRP3炎癥小體可有效緩解COPD大鼠模型氣管重塑、肺組織損傷并改善相關(guān)細(xì)胞因子及嗜酸性粒細(xì)胞血清學(xué)水平，提示MCC950可作為未來治療COPD的潛在藥物，為其后續(xù)作為COPD藥物的研發(fā)提供了理論依據(jù)。本研究作為探索性研究尚存在一些不足，既往研究表明COPD還存在多種炎癥細(xì)胞因子參與，如IL-8、LTB4、PGE2、sTREM-1、suPAR、sICAM-1等[29-30]。但本研究尚未關(guān)注以上細(xì)胞因子在COPD大鼠模型及MCC950處理下的改變，后續(xù)研究可進(jìn)一步關(guān)注和探索。