李富金，汪建華，高 鳳，趙 遠，陳 輝

（1.齊魯動物保健品有限公司，山東 濟南 250100；2.山東和康源生物育種股份有限公司，山東 濟南）

鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer，RA）是一種能夠引起雞、鴨、鵝等家禽、水禽及鳥類患流行性傳染性漿膜炎的細菌，給養(yǎng)禽業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失。漿膜炎以纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、腦膜炎及纖維素性輸卵管炎為特征[1-2]。臨床上關于鴨疫里默氏桿菌感染鴨、鵝的報道比較多，感染雞的報道較少[3-8]，近幾年筆者在臨床發(fā)生傳染病鼻炎、關節(jié)炎的病雞中多次分離到該菌。2022年4月，河北滄州某肉種雞場15周肉種雞出現(xiàn)瘸腿、癱瘓病雞，發(fā)病率10%，日淘汰率近0.15%，懷疑因呼腸孤病毒引起的病毒性關節(jié)炎，對病雞進行實驗室病原檢測，結(jié)果在檢測到呼腸孤病毒的同時也分離到一株細菌，經(jīng)鑒別為鴨疫里默氏桿菌，因該菌在雞上分離案例增多，現(xiàn)將鑒定結(jié)果匯報如下，供養(yǎng)殖從業(yè)者參考。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 病料 來源河北滄州某肉種雞場，無菌采集15周齡瘸腿癱瘓肉種雞的肝、腦和關節(jié)。

1.1.2 實驗動物 1日齡櫻桃谷雛鴨，購自德州某孵化場。

1.1.3 實驗試劑 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基、馬丁肉湯培養(yǎng)基均購自青島海博生物技術有限公司，血清營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基由齊魯動物保健品有限公司自制，病毒DNA/RNA純化試劑盒購自杭州博日科技有限公司，2×Taq Master Mix、DNA Marker DL2000、GelRed核酸染料均購自諾唯贊生物科技有限公司，細菌微量生化鑒定管購自杭州微生物試劑有限公司。

1.1.4 實驗器材 核酸提取儀、PCR儀、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)、生物安全柜、電子天平、CO2培養(yǎng)箱、顯微鏡等均由齊魯動物保健有限公司研究院疫苗研究所自備。

1.1.5 藥敏片 強力霉素、氟苯尼考、安普霉素、新霉素、阿莫西林、恩諾沙星、土霉素、粘桿菌素、頭孢噻呋鈉、頭孢喹肟、泰地羅新、卡那霉素、林可大觀霉素、加米霉素均由齊魯動物保健有限公司研究院化藥研究所惠贈。

1.1.6 PCR引物 根據(jù)GenBank發(fā)布的鴨疫里默氏桿菌（ATCC11845）標準菌株的全基因序列，設計16S rRNA特異性引物，由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列信息：（F: 5′-CA GCTTAACTGTAGAACTGC-3′；R: 5′-TCGAGAT TTGCATCACTTCG-3′）。

1.1.7 陽性血清 鴨疫里默氏桿菌1、2、4、5、6、7、10型陽性血清，由齊魯動物保健有限公司研究院疫苗研究所自備。

1.2 方法

1.2.1 細菌分離培養(yǎng)及純化 無菌取病雞肝、腦和關節(jié)，分別接種營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、血清營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱培養(yǎng)基各2份，分別放普通培養(yǎng)箱及含5% CO2培養(yǎng)箱，37 ℃ 培養(yǎng)24～48 h，挑取血清瓊脂培養(yǎng)基上長勢良好的單個菌落進行純培養(yǎng)。

1.2.2 染色鏡檢 挑取純培養(yǎng)的菌株，按照常規(guī)方法涂片、固定，并用革蘭染色液及瑞氏染液染色，鏡檢。

1.2.3 生化試驗 在常規(guī)微量發(fā)酵管內(nèi)滴加5%～10%牛血清，然后接種分離純化菌株，37 ℃ 培養(yǎng)3 d。

1.2.4 PCR檢測及測序 取純培養(yǎng)的菌株菌液，利用核酸提取儀提取分離株DNA，以提取的DNA為反應模板，按照2×Taq Master Mix說明書，進行PCR反應。反應程序：95 ℃ 預變性3 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 60 s，共30個循環(huán)，72 ℃ 延伸5 min，4 ℃ 保溫。將反應產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠成像儀觀察電泳結(jié)果。選擇條帶清晰無雜帶、目的條帶位置正確的PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司進行測序。

1.2.5 藥敏試驗 挑取純培養(yǎng)的菌株均勻涂布在血清瓊脂培養(yǎng)基平板上，將頭孢噻呋鈉、恩諾沙星等14種藥物的藥敏片緊貼于平皿表面，置于含5% CO2培養(yǎng)箱，37 ℃ 培養(yǎng)24 h，用游標卡尺測量每片藥敏片周圍抑菌圈直徑，判斷分離菌對各藥敏片的敏感性。

1.2.6 動物回歸試驗 將分離菌株接種于含血清馬丁肉湯培養(yǎng)基，37 ℃ 振蕩培養(yǎng)24 h?；罹嫈?shù)后，攻毒10只7日齡健康非免疫雛鴨，每只靜脈注射5×107CFU活菌。接種后連續(xù)觀察10 d，記錄雛鴨臨床表現(xiàn)，對病死鴨進行病理剖檢觀察，未死亡鴨處死后剖檢觀察，并無菌采集腦、肝臟分離細菌。

1.2.7 血清型鑒定 采用玻片凝集試驗方法，按照文獻方法進行，混合后反復震蕩載玻片，注意觀察，出現(xiàn)清晰的乳白色絮狀凝集塊者，判定為陽性，不出現(xiàn)凝集塊則判定為陰性，陽性的重復為3次以防止假陽性[9-12]。

2 結(jié)果

2.1 細菌分離培養(yǎng)

分離菌在普通培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基上不能生長，在含5% CO2條件下，在血清瓊脂培養(yǎng)基上生長良好，如圖1所示呈針尖大小、圓形、表面光滑、小露珠狀半透明小菌落。

圖1 分離菌在血清瓊脂培養(yǎng)平板的菌落形態(tài)

2.2 染色鏡檢

染色后在顯微鏡下觀察為革蘭陰性短小桿菌，大小為0.3～0.5 μm，如圖2所示菌體多單個存在，少數(shù)成對，偶爾呈鏈狀排列，無芽孢，有莢膜，短桿狀菌。

圖2 分離菌革蘭染色菌體形態(tài)

2.3 生化鑒定結(jié)果

分離的菌株不能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、乳糖、甘露酵和山梨醇，靛基質(zhì)、VP試驗、硝酸鹽還原試驗、硫化氫產(chǎn)生、甲基紅試驗均為陰性，觸酶、氧化酶試驗為陽性，以上結(jié)果符合鴨疫里默氏桿菌的生化培養(yǎng)特性。

2.4 PCR鑒定及測序結(jié)果

（1）如圖3所示，以分離的菌株DNA作為模板進行PCR擴增，結(jié)果顯示，擴增產(chǎn)物片段（2號）與目的條帶（1666 bp）大小相符。（2）對上述PCR擴增產(chǎn)物進行測序，登陸NCBI網(wǎng)站與已公布序列進行BLAST分析發(fā)現(xiàn)，該核苷酸序列與已知Riemerella anatipestifer 16S rRNA的部分序列同源性達到99.78%，確定分離到的菌株為鴨疫里默氏桿菌，命名為QLHB01。

圖3 分離菌株16S rRNA基因擴增結(jié)果1. 陰性對照孔；2. 樣品孔；M. Marker DL2000。

2.5 藥敏試驗結(jié)果

結(jié)果表明分離菌對頭孢噻呋鈉、頭孢喹肟敏感，對強力霉素、氟苯尼考、安普霉素、新霉素、阿莫西林、恩諾沙星中介，而對土霉素、粘桿菌素、泰地羅新、卡那霉素、維可觀（林可大觀霉素）、加米霉素則不敏感。詳細結(jié)果見下表1。

表1 分離菌株藥敏試驗結(jié)果

2.6 動物回歸試驗結(jié)果

雛鴨接種分離菌株12 h后，精神沉郁，食欲、飲欲下降，眼鼻分泌物增多，部分鴨出現(xiàn)典型的神經(jīng)癥狀，表現(xiàn)為共濟失調(diào)、頭頸震顫等（圖4、圖5）。攻毒后雛鴨3 d開始出現(xiàn)死亡，剖檢后可見心臟和肝臟表面覆有纖維素性滲出物（圖6、圖7），氣囊上有干酪樣物，腦膜血管樹枝狀充血。10 d后將未死亡鴨處死剖檢，見心臟和肝臟表面的纖維素性滲出物增多，氣囊混濁，腦膜出血。從腦組織中均分離到鴨疫里默氏桿菌，培養(yǎng)特性及鏡檢形態(tài)與分離菌株相同。

圖4 對照鴨無異常

圖5 攻毒鴨精神沉郁共濟失調(diào)

圖6 攻毒鴨死亡

圖7 攻毒鴨剖檢有典型漿膜炎病變

2.7 血清型鑒定

經(jīng)玻片凝集試驗，分離菌株可以與10型陽性血清產(chǎn)生凝集反應，與1、2、4、5、6、7型陽性血清不反應，被鑒定為10型。

3 討論與結(jié)論

（1）本案例是從懷疑病毒性關節(jié)炎發(fā)病肉種雞關節(jié)中分離到細菌，通過菌落觀察、染色鏡檢、生化試驗、分子生物學檢測、藥敏試驗、血清型鑒定及動物回歸試驗的結(jié)果，判定分離菌為鴨疫里默氏桿菌，應該是呼腸孤病毒與鴨疫里默氏桿菌共感染。

（2）通過藥敏試驗發(fā)現(xiàn)分離菌對頭孢噻呋鈉及頭孢喹肟較敏感，強力霉素、氟苯尼考、安普霉素、新霉素、阿莫西林、恩諾沙星也可以臨床應用，鑒于主要病變在關節(jié)，養(yǎng)殖場選擇用頭孢噻呋鈉（10 mg/kg體重）對出現(xiàn)癥狀的雞進行注射，大群用強力霉素（15 mg/kg體重）配合氟苯尼考（15 mg/kg體重）飲水預防，追蹤用藥后的效果，部分雞癥狀有緩解、恢復，但仍有部分癱瘓雞進行了淘汰。本案例不是單純細菌感染，藥敏試驗對選擇敏感性藥物來控制細菌感染是有幫助的，也能減少部分經(jīng)濟損失。

（3）血凝試驗及動物回歸試驗結(jié)果顯示，分離菌為10型鴨疫里默氏桿菌，且對雛鴨致病性較強。因與以前分離雞源鴨疫里默氏桿菌發(fā)病日齡、感染器官及血清型（1型、2型）均不相同，且案例不多，因此未做SPF雞的回歸試驗。

（4）鴨疫里默氏桿菌目前主要感染水禽，特別是15～35日齡的水禽，發(fā)病急，死亡快，死亡率高，給養(yǎng)殖場帶來巨大經(jīng)濟損失，水禽養(yǎng)殖場非常重視該病的防控。在家禽上的案例不多，但有增多趨勢，特別是水禽養(yǎng)殖密集區(qū)，感染雞的幾率增加，希望養(yǎng)殖場多關注該病的發(fā)展及流行情況。