陳家文，黃建東，孫海濤，2

（1 南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院神經(jīng)外科中心，國家臨床重點(diǎn)?？疲X血管病診斷與治療教育部工程研究中心，廣東省普通高校腦功能修復(fù)與再生重點(diǎn)實(shí)驗室，廣東神經(jīng)外科研究所，廣東 廣州 510280； 2 南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院檢驗醫(yī)學(xué)部，臨床生物樣本資源中心，南方醫(yī)科大學(xué)微生物組醫(yī)學(xué)中心，廣東 廣州 510280； 3 香港大學(xué)李嘉誠醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)學(xué)院，生物醫(yī)學(xué)學(xué)院，香港 999077； 4 中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院，深圳合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院，中國科學(xué)院定量工程生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室，廣東省合成基因組學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室，廣東 深圳 518055； 5 香港大學(xué)深圳醫(yī)院臨床腫瘤科，深圳市腫瘤轉(zhuǎn)移與個體化治療重點(diǎn)實(shí)驗室，廣東 深圳518055； 6 粵港RNA醫(yī)學(xué)聯(lián)合實(shí)驗室，中山大學(xué)，廣東 廣州 510120）

細(xì)菌治療腫瘤有著較長的歷史，最早可以追溯到19 世紀(jì)。一名外科醫(yī)生首次用鏈球菌（Streptococcus pyogenes）來治療患有無法手術(shù)切除的肉瘤患者，并且發(fā)現(xiàn)部分腫瘤自發(fā)消退。在接下來的時間里，他用熱滅活的釀膿鏈球菌治療了超過1000 名的腫瘤患者并取得了較好的效果［1?3］。然而，由于結(jié)果的不穩(wěn)定性，加上放射治療和化學(xué)治療的出現(xiàn)，細(xì)菌治療腫瘤慢慢淡出了人們的視野［4］。近年來，隨著合成生物學(xué)的蓬勃發(fā)展，人們重新考慮運(yùn)用細(xì)菌來治療腫瘤，并為提高細(xì)菌療法的效果做了各種努力。用于腫瘤治療的常見細(xì)菌有沙門氏菌［5］、大腸桿菌［6］、雙歧桿菌［7］和鏈球菌［8］等，這些細(xì)菌都有靶向腫瘤和殺死腫瘤細(xì)胞的能力［9?10］。人們通過合成生物學(xué)等技術(shù)對細(xì)菌進(jìn)行改造后大大增強(qiáng)了其在腫瘤治療上的運(yùn)用，改造后的細(xì)菌可以選擇性地定植在腫瘤組織中并抑制腫瘤生長［11?13］。特別是鼠傷寒沙門氏菌研究較多，并被認(rèn)為是具有較大潛力的治療方法，例如，比較常見的工程鼠傷寒沙門氏菌有VNP20009、A1?R、YB1 和SHJ2037 等。然而，單純工程菌不能消除腫瘤。人們用工程細(xì)菌作載體來表達(dá)細(xì)胞因子、細(xì)胞毒性藥物、前藥物轉(zhuǎn)化酶、調(diào)節(jié)因子、小干擾RNAs（siRNAs）和其他抗腫瘤分子來增強(qiáng)抗腫瘤效果［9?10，14?15］。在用于臨床治療前，工程細(xì)菌治療腫瘤還面臨著許多問題［11?13］。本文結(jié)合近年來國內(nèi)外研究報道，闡述人們通過不同的策略來改造細(xì)菌，并且總結(jié)工程菌在腫瘤治療方面的一些進(jìn)展。

1 細(xì)菌改造策略和應(yīng)用進(jìn)展

1.1 細(xì)菌的基因工程改造及應(yīng)用

野生細(xì)菌的毒力較強(qiáng)是細(xì)菌治療腫瘤的挑戰(zhàn)之一，如何平衡細(xì)菌過強(qiáng)的毒性和治療效力是研究者急需解決的難題［16］。人們通過改造細(xì)菌的相關(guān)基因來減弱細(xì)菌的毒力，從而提高細(xì)菌的安全性。此外，在減弱細(xì)菌毒力的同時也可以增強(qiáng)其腫瘤靶向性。通過敲除與細(xì)菌代謝相關(guān)的基因可以減弱細(xì)菌的毒力，同時也能增強(qiáng)細(xì)菌在腫瘤組織的定植和減少對正常組織的破壞［10?11］。例如，減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009 中msbB缺失改變了脂質(zhì)A 的結(jié)構(gòu)，從而減少了細(xì)菌誘導(dǎo)的TNF?α 的分泌。其另一個purI基因的突變使細(xì)菌不能合成腺嘌呤［17?18］。在動物模型中，研究證實(shí)減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009 可以抑制多種腫瘤的生長［19?20］。此外，1999 年開展了減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009 一期人類臨床研究，研究表明VNP2009 用于腫瘤患者具有較高的安全性。但是在最大劑量下只在3個患者的腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌定植，且腫瘤組織沒有明顯的消退［18］。該研究說明，VNP2009 的腫瘤靶向性和療效需要進(jìn)一步的提升。專性厭氧鼠傷寒沙門氏菌YB1 是在減毒鼠傷寒沙門氏菌SL7207 菌株的基礎(chǔ)上進(jìn)一步改造而來。設(shè)計缺氧啟動子PepT 和反義需氧啟動子SodA 調(diào)控必需基因asd的表達(dá)。Asd是合成二氨基庚二酸（DAP）的關(guān)鍵酶，而DAP 是革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的重要組成部分。缺乏DAP 會導(dǎo)致細(xì)菌在短時間內(nèi)裂解。常氧下，asd基因不表達(dá)從而導(dǎo)致DAP 缺乏。因此，YB1 只能在厭氧條件（氧氣體積分?jǐn)?shù)＜0.5%）下存活［16，21］。許多研究表明，YB1 優(yōu)先在腫瘤組織定植，并可以抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移［16，21］。在動物模型中，盡管工程細(xì)菌治療多種腫瘤取得了一定的效果，但是利用改造后的細(xì)菌作為載體表達(dá)抗腫瘤分子可以進(jìn)一步提高療效。常見的抗腫瘤分子有細(xì)胞因子、細(xì)胞毒性藥物、前藥物轉(zhuǎn)化酶、調(diào)節(jié)因子、小干擾RNAs（siRNAs）。在多種動物腫瘤模型中，工程細(xì)菌可以有效表達(dá)抗腫瘤分子并顯著抑制各種腫瘤的生長。隨著免疫治療的興起，人們利用工程細(xì)菌作為載體表達(dá)納米抗體來阻斷免疫抑制信號從而增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)［22?24］。研究表明，在多種動物模型中工程菌表達(dá)納米抗體后腫瘤生長受到明顯的抑制，并且有些具有免疫記憶，從而抑制腫瘤的復(fù)發(fā)［22?24］。例如，大腸桿菌表達(dá)L?精氨酸聯(lián)合抗PDL?1治療腫瘤后，腫瘤生長受到明顯抑制，并且體內(nèi)可以產(chǎn)生記憶性T 細(xì)胞，從而抑制腫瘤的復(fù)發(fā)。近年來，工程菌在腫瘤治療上取得了令人期待的結(jié)果，但是還不能完全抑制腫瘤的生長。此外，細(xì)菌的安全性一直是人們擔(dān)心的問題，如何平衡細(xì)菌的安全性和療效是一個難點(diǎn)。

1.2 細(xì)菌合成基因線路深度優(yōu)化及應(yīng)用進(jìn)展

雖然人們通過改造野生細(xì)菌的相關(guān)基因降低了細(xì)菌的毒力，并且證明減毒后的細(xì)菌可以選擇性地定植在腫瘤組織同時抑制腫瘤的生長，但由于細(xì)菌在體內(nèi)的遺傳不穩(wěn)定，可能會產(chǎn)生無效或有害的表型。此外，潛在的抗生素耐藥性或逆轉(zhuǎn)細(xì)菌減毒表型的突變可能對患者健康形成威脅［11，25］。因此，開發(fā)更廣泛更安全的細(xì)菌治療方案是腫瘤治療的一個重要發(fā)展方向。隨著合成生物學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展，為進(jìn)一步優(yōu)化細(xì)菌提供了理論基礎(chǔ)和技術(shù)支撐。在傳統(tǒng)的細(xì)菌改造基礎(chǔ)上，許多重要基因線路被設(shè)計出來，常見的基因線路包括自殺開關(guān)、群體感應(yīng)、遺傳振蕩器和門控系統(tǒng)等［16，26］。這些基因線路大大提高了細(xì)菌在腫瘤治療中的安全性，將會進(jìn)一步推動細(xì)菌治療腫瘤進(jìn)入臨床試驗［16，27］。自殺開關(guān)是在限定條件下可以誘導(dǎo)致死基因表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)菌死亡的人工系統(tǒng)［16，28］。將自殺開關(guān)引入細(xì)菌中，可以保證細(xì)菌在腫瘤特異性區(qū)域增殖，而在其他區(qū)域可以表達(dá)自殺基因殺死細(xì)菌，從而有效保證細(xì)菌不逃逸［16，29］。目前，開發(fā)的幾種自殺開關(guān)已被用于基礎(chǔ)研究、生物技術(shù)、代謝工程和臨床診斷及細(xì)菌治療［16，30］。在腫瘤治療上，許多研究證實(shí)在引入了不同的自殺開關(guān)后，細(xì)菌在正常組織的定植明顯減少并且表現(xiàn)出較好的腫瘤抑制效果。群體感應(yīng)和遺傳振蕩器的利用可以有效控制基因在特定宿主器官的表達(dá)。用改造后的細(xì)菌作為載體使其表達(dá)抗腫瘤分子，有可能劑量過高損傷正常組織［16，31］。因此，通過加入群體感應(yīng)和遺傳振蕩器可以精準(zhǔn)控制抗腫瘤分子的表達(dá)。研究表明，加入群體感應(yīng)后的細(xì)菌可以最大程度地維持體內(nèi)較低的細(xì)菌定植數(shù)量，從而減少對周圍組織的損傷及毒副作用，但是可以顯著抑制腫瘤的生長［32］。邏輯門控系統(tǒng)的構(gòu)建可以整合兩個或兩個以上輸入信號并產(chǎn)生功能性的特異信號輸出。含邏輯門控系統(tǒng)的重構(gòu)細(xì)菌可以通過使用連接特異性響應(yīng)腫瘤相關(guān)信號的啟動子，實(shí)現(xiàn)治療基因的特異性輸出表達(dá)，可以作為診斷、預(yù)防和治療的高度選擇性工具［33］。比如，Liu 等［34］構(gòu)建了邏輯與門（logical AND gate）基因線路，兩個啟動子hUPⅡ和hTERT 都在膀胱癌細(xì)胞中有高表達(dá)活性，但只有同時被激活時才能產(chǎn)生細(xì)胞表型的輸出。因此，該系統(tǒng)能夠更特異性地鑒別膀胱癌細(xì)胞。

2 工程菌治療腫瘤的機(jī)制探討

2.1 對腫瘤的直接作用

近年來，人們發(fā)現(xiàn)工程鼠傷寒沙門氏菌在腫瘤組織聚集后可以直接殺死腫瘤細(xì)胞［35］。凋亡和自噬是兩種不同的細(xì)胞過程，它們參與了細(xì)胞的生理和病理過程［36?37］。有研究表明，工程鼠傷寒沙門氏菌可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡和自噬來發(fā)揮抗腫瘤作用［圖1（a）］。凋亡蛋白酶3 和Bax 蛋白是細(xì)胞凋亡效應(yīng)蛋白。鼠傷寒沙門氏菌VNP20009可以增加凋亡蛋白酶3 的活性和Bax 蛋白的表達(dá)，從而誘導(dǎo)胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞發(fā)生凋亡［19］。除了凋亡，工程鼠傷寒沙門氏菌也可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬--一種調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)中長壽蛋白質(zhì)和不需要的細(xì)胞器降解的細(xì)胞過程［36，38］。Lee 等［38］的研究表明，在小鼠黑色素瘤模型中，工程鼠傷寒沙門氏菌可以通過下調(diào)AKT/mTOR 信號通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬，并且具有時間和劑量依賴性。然而，也有研究認(rèn)為工程鼠傷寒沙門氏菌誘導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞自噬是一種保護(hù)機(jī)制，可以保護(hù)腫瘤細(xì)胞免受傷害。Liu 等［20］研究表明，阻斷自噬途徑之后，鼠傷寒沙門氏菌A1?R和VNP20009可以通過增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞凋亡來殺死腫瘤細(xì)胞。因此，自噬抑制劑和工程鼠傷寒沙門氏菌聯(lián)合運(yùn)用可能取得較好的治療效果。除了工程鼠傷寒沙門氏菌外，其他細(xì)菌也可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。Bax和BCl?xL是凋亡的重要蛋白，并在腫瘤的進(jìn)展和侵襲中具有關(guān)鍵作用。此外，PI3K/AKT 信號通路可以影響多種細(xì)胞過程，包括抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞生長和增殖。因此，通過抑制PI3K/AKT 信號通路可能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡。體外研究發(fā)現(xiàn)，尼氏大腸桿菌可以通過上調(diào)PTEN和Bax蛋白和下調(diào)AKT1和Bcl?xL 蛋白誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而抑制結(jié)腸腺癌生長［39］。另外，酪酸梭狀芽孢桿菌通過基質(zhì)金屬蛋白酶8（MMP?8）觸發(fā)中性粒細(xì)胞釋放TNF相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［40］。

圖1 工程菌治療腫瘤的機(jī)制Fig. 1 The mechanisms of genetically engineered bacteria an anti?tumor agent

2.2 激活宿主的免疫系統(tǒng)

腫瘤治療的難點(diǎn)之一是腫瘤組織中的免疫抑制微環(huán)境。骨髓來源的抑制細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的浸潤可以導(dǎo)致免疫抑制微環(huán)境，從而促進(jìn)腫瘤的生長［10，13］。除了誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡或者自噬外，細(xì)菌可以通過調(diào)節(jié)宿主的先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，從而提高宿主的抗腫瘤免疫反應(yīng)［10?11，13，35］［圖1（b）和（c）］。Toll 受體（TLR）是膜結(jié)合型受體，在先天性和后天性免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，特別是在抗病原體感染的炎癥反應(yīng)中［41］。聚集在腫瘤部位的工程鼠傷寒沙門氏菌主要被細(xì)胞膜上的Toll 受體（TLR）識別。Toll 受體（TLR）主要識別革蘭氏陰性桿菌的各種模式識別受體，包括TLR4 受體識別LPS、TLR5 受體識別鞭毛蛋白、TLR 受體識別非甲基化的CpGDNA。細(xì)菌的各種模式識別受體被Toll受體識別后可以激活宿主的抗腫瘤免疫系統(tǒng)［11］。有研究表明，IL?1β具有明顯的抗腫瘤活性，鼠傷寒沙門氏菌ΔppGpp的LPS 與巨噬細(xì)胞上TLR4 識別后可以直接促進(jìn)IL?1β 的分泌。另外，腫瘤細(xì)胞死亡后釋放的ATP可以激活巨噬細(xì)胞的炎性小體，促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌IL?1β［42?43］。此外，LPS 也可以和腫瘤細(xì)胞膜上的CD14、TLR4 結(jié)合增加腫瘤壞死因子TNF?α 的分泌，從而破壞腫瘤血管［41］。鞭毛蛋白（細(xì)菌鞭毛的結(jié)構(gòu)蛋白）亞基，可以被TLR5 受體特異性識別［44］。在腫瘤疫苗模型中，鞭毛蛋白與TLR5結(jié)合后可以增強(qiáng)腫瘤特異性CD8+T細(xì)胞的免疫反應(yīng)［45］。鞭毛蛋白也可以通過激活TLR5 受體直接抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖和生長［45］。YB1 是一種專性厭氧傷寒沙門氏菌，其可以在腫瘤缺氧區(qū)域聚集和抑制腫瘤生長［21，46］。此外，YB1 也可以抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。在感染早期YB1可以促進(jìn)NK細(xì)胞分泌INF?γ，反過來分泌的INF?γ 可以使NK 細(xì)胞聚集和活化，從而殺死轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞。該研究表明，NK 細(xì)胞的自反饋環(huán)在抑制轉(zhuǎn)移瘤方面發(fā)揮了重要作用［46?47］。許多研究表明，李斯特菌和大腸桿菌也可以通過調(diào)節(jié)宿主的抗腫瘤反應(yīng)來抑制腫瘤的生長。Chandra 等［47?48］研究發(fā)現(xiàn)，李斯特菌（attenuatedListeria monocytogenes）可以感染骨髓衍生的免疫抑制細(xì)胞，而后將細(xì)菌運(yùn)送到腫瘤微環(huán)境中。同時，它可以使MDSC 轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂忻庖叽碳け硇投置贗L?12，繼而提高CD8+T 細(xì)胞和NK 細(xì)胞的抗腫瘤反應(yīng)，從而抑制乳腺癌的生長和轉(zhuǎn)移。

雖然工程菌本身可以通過許多機(jī)制來抑制腫瘤的生長，但是其療效還需要進(jìn)一步的提升。與傳統(tǒng)抗腫瘤治療方法相比，工程菌在腫瘤治療上有許多優(yōu)勢，比如腫瘤靶向性和滲透入腫瘤組織深部的能力。隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，人們可以采用許多新的策略進(jìn)一步改造工程菌來提升其抗腫瘤的能力。

3 工程菌治療腫瘤新策略：遞送抗腫瘤分子

雖然工程菌在腫瘤治療上具有較好的療效，但是單純工程菌不能完全抑制腫瘤的生長。為了提高腫瘤治療的療效，工程菌可以作為載體來表達(dá)各種抗腫瘤分子，比如細(xì)胞因子、細(xì)胞毒性劑、免疫調(diào)節(jié)劑、腫瘤相關(guān)抗原或抗體、前藥物酶、siRNA和其他分子。工程菌表達(dá)抗腫瘤分子具有許多優(yōu)點(diǎn)：一方面，細(xì)菌可以靶向到腫瘤組織且可以滲透到腫瘤組織內(nèi)部，并且工程菌本身具有抗腫瘤和激活免疫系統(tǒng)的能力；另一方面，細(xì)菌可以在腫瘤組織中增殖而持續(xù)表達(dá)抗腫瘤分子，從而使其保持在較高水平［10?11，35，49］。

3.1 細(xì)胞因子

細(xì)胞因子可以通過促進(jìn)免疫細(xì)胞的激活、增殖和遷移來殺死腫瘤細(xì)胞［10］。白細(xì)胞介素?2（IL?2）是由活化的CD4+T 細(xì)胞產(chǎn)生，其不僅可以促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖，還可以增強(qiáng)細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞（CTL）和天然殺傷（NK）細(xì)胞的細(xì)胞毒性功能［50］。研究表明不同工程菌表達(dá)IL?2 后，可以顯著抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移［51?55］。Brent 等［51?52］研究表明，工程鼠傷寒沙門氏菌表達(dá)IL?2 可以誘導(dǎo)局部和全身的NK 細(xì)胞增殖，從而抑制骨肉瘤的轉(zhuǎn)移。在小鼠黑色素瘤模型中，工程鼠傷寒沙門氏菌表達(dá)IL?2 可以抑制黑色素瘤的生長，且可以減少黑色素瘤組織中的血管生成和顯著增加腫瘤組織壞死［54］。CCL21，被稱為6C 激活因子或次級淋巴組織趨化因子，是小分泌蛋白趨化因子家族的一個成員，其控制著淋巴細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、T 細(xì)胞和NK 細(xì)胞的遷移，其激活后可以增強(qiáng)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)［56］。研究發(fā)現(xiàn)，工程鼠傷寒沙門氏菌表達(dá)CCL21 可以增加炎癥細(xì)胞的浸潤，從而抑制黑色素瘤的生長和轉(zhuǎn)移并且具有較好的安全性［56］。IL?18 最初被描述為一種IFN?γ 誘導(dǎo)因子，不僅能夠促進(jìn)T 細(xì)胞和NK 細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，而且還能誘導(dǎo)T 細(xì)胞和NK 細(xì)胞增殖和細(xì)胞溶解活性。靜脈注射工程鼠傷寒沙門氏菌表達(dá)IL?18 后，結(jié)腸癌生長和轉(zhuǎn)移明顯受到抑制。與腫瘤組織中T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞和粒細(xì)胞的大量浸潤以及腫瘤組織中幾種細(xì)胞因子的增加有關(guān)［57］。此外，IL?12 是一種多功能的細(xì)胞因子，在各種小鼠腫瘤模型中具有強(qiáng)大的抗腫瘤活性。有研究表明，產(chǎn)芽孢梭狀芽孢桿菌（Clostridium sporogenes）在腫瘤組織缺氧區(qū)域聚集表達(dá)IL?12，可以明顯抑制乳腺癌的生長［53］。

3.2 細(xì)胞毒性劑和調(diào)節(jié)劑

除了細(xì)胞因子，工程鼠傷寒沙門氏菌也可以表達(dá)細(xì)胞毒性劑和調(diào)節(jié)劑來直接殺死腫瘤細(xì)胞或抑制腫瘤血管的生成。TNF 相關(guān)的細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）可以激活凋亡信號通路誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［19］。工程鼠傷寒沙門氏菌表達(dá)TRAIL 可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而抑制黑色素瘤和乳腺癌的生長，而對正常組織沒有明顯的毒性［58?59］。另外，內(nèi)皮素是膠原蛋白的C端片段，具有抗血管生成活性。在小鼠腫瘤模型中，工程鼠傷寒沙門氏菌表達(dá)內(nèi)皮素后，腫瘤血管生成明顯減少并可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［60?61］。另一項研究表明內(nèi)皮素可以減少腫瘤內(nèi)微血管的密度，減少VEGF生成和腫瘤內(nèi)CD8+T 細(xì)胞的浸潤，從而抑制腫瘤的生長［62］。細(xì)胞溶酶A（ClyA，一種34 kDa 的重整后溶血蛋白）可引起哺乳動物細(xì)胞膜的孔隙形成，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［6，62］。此外，F(xiàn)asL 是一種屬于腫瘤壞死因子蛋白家族的膜蛋白，與受體（Fas）結(jié)合后可以在Fas 敏感細(xì)胞中啟動凋亡信號。在小鼠腫瘤模型中，工程鼠傷寒沙門氏菌表達(dá)FasL 后與其受體（Fas）結(jié)合可以明顯抑制原位瘤和轉(zhuǎn)移瘤的生長，且對正常組織沒有明顯的毒性［63］。

3.3 抗腫瘤蛋白

許多蛋白可以影響腫瘤的生長，細(xì)菌表達(dá)這些蛋白可以明顯抑制腫瘤的生長。天青蛋白（azurin?like protein， Laz）是一種抗腫瘤蛋白，它是由腦膜炎奈瑟氏菌（Neisseria meningitidis）產(chǎn)生的。在腦部腫瘤中，Laz 可以與腫瘤抑制蛋白P53 相互作用，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［64］。Mansour 等［64］研究表明，鼠傷寒沙門氏菌VNP?20009 表達(dá)LAZ 蛋白可以誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞發(fā)生凋亡。膠質(zhì)瘤組織中MMP?2和MMP?9的水平升高可以促進(jìn)腫瘤的侵襲、血管生成和轉(zhuǎn)移。金屬蛋白酶的組織抑制劑（TIMP）是MMP 的一個同源抑制劑家族，通過抑制MMP 來控制細(xì)胞外基質(zhì)的降解［65］。在小鼠膠質(zhì)瘤模型中，鼠傷寒沙門氏菌SHJ2037 表達(dá)TIMP?2 后抑制MMP?2 的表達(dá)從而抑制膠質(zhì)瘤的生長［65］。此外，Tum?5 是一種抗血管生成蛋白。它可以降低mTOR 激酶的磷酸化和真核生物起始4E 阻止內(nèi)皮細(xì)胞蛋白的合成，從而抑制新生血管的形成。有研究表明，大腸桿菌（Escherichia coliNissle 1917）表達(dá)Tum?5 可以通過抑制腫瘤組織內(nèi)新生血管來發(fā)揮抗腫瘤作用，從而抑制黑色素瘤的生長［66］。p53是一種腫瘤抑制蛋白，它與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。在此基礎(chǔ)上，He Lian 等［67］用大腸桿菌（Escherichia coliNissle 1917）表達(dá)p53 和Tum?5 融合蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞癌的生長明顯受到抑制且沒有明顯的副作用。

3.4 酶蛋白類

在給予原藥時，細(xì)菌表達(dá)的酶蛋白可將無毒性的原藥轉(zhuǎn)化為有活性的毒性藥物，從而降低全身毒性。胞苷脫氨酶主要存在于腸桿菌科和假單胞菌科，其具有脫氨基的功能［68］。工程鼠傷寒沙門氏菌表達(dá)胞苷脫氨酶，使無毒的5?氟胞嘧啶（5?FC）轉(zhuǎn)變?yōu)??氟尿嘧啶（5?FU），其可以明顯抑制腫瘤的生長而不損傷其他正常組織［69?70］。工程鼠傷寒沙門氏菌在腫瘤部位聚集后表達(dá)羧基肽酶G2 后可以抑制黑色素瘤的生長［71］。表達(dá)嘌呤核苷磷酸化酶（ePNP）工程鼠傷寒沙門氏菌可以將6?甲基嘌呤?2'?脫氧核苷（MePdR）轉(zhuǎn)化為6?甲基嘌呤，從而抑制小鼠體內(nèi)黑色素瘤的生長［72］。梭狀芽孢桿菌（Clostridium sporogenes）表達(dá)大腸桿菌來源的硝基還原酶（NTR），其提高了新型DNA交聯(lián)劑PR?104 的抗腫瘤活性，從而抑制宮頸癌的生長［73］。

3.5 siRNA

siRNA（RNAI）是由長19～30 個核苷酸組成的雙鏈RNA。它可以介導(dǎo)序列特異性基因的沉默，從而為腫瘤治療提供一種新的策略。然而，siRNAs 帶負(fù)電荷，具有膜不滲透性、在系統(tǒng)循環(huán)中高度不穩(wěn)定等缺點(diǎn)。所以如何有效地傳遞小干擾RNAs（siRNAs）靶向到腫瘤組織是一個巨大的挑戰(zhàn)［10，74?75］。在體外和體內(nèi)證實(shí)，工程菌傳遞siRNA可以特異性下調(diào)相關(guān)因子的表達(dá)［76?77］。程序性細(xì)胞死亡蛋白1（PD?1）是一種重要的免疫檢查點(diǎn)分子，其可以通過抑制效應(yīng)T細(xì)胞的功能和誘導(dǎo)T 細(xì)胞耗竭，使腫瘤細(xì)胞逃脫宿主的免疫殺傷［78］。工程鼠傷寒沙門氏菌表達(dá)靶向抑制PD?1 的siRNA與吡莫嗪聯(lián)合運(yùn)用可以顯著抑制小鼠體內(nèi)黑色素瘤的生長。該研究表明，其可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和增加腫瘤組織中CD4+T 細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞的數(shù)量［79］。缺氧誘導(dǎo)因子?1（HIF?1α）是一種關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，可以激活幾乎所有參與糖酵解的酶的表達(dá)。有研究證實(shí)，在惡性腫瘤中，缺氧誘導(dǎo)因子?1（HIF?1α）表達(dá)上調(diào)可以促進(jìn)腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移［80］。在體內(nèi)外卵巢癌細(xì)胞中下調(diào)HIF?1α 后，卵巢癌細(xì)胞對化療顯著敏感［77］。同樣地，在前列腺癌中腫瘤細(xì)胞由有氧糖酵解轉(zhuǎn)變?yōu)榫€粒體氧化磷酸化，從而顯著增強(qiáng)前列腺癌細(xì)胞對順鉑的敏感性［76］。Bcl?2 是一種抗凋亡蛋白，可顯著延長細(xì)胞對凋亡經(jīng)典刺激的生存。值得注意的是，Bcl?2蛋白常常在腫瘤細(xì)胞中過度表達(dá)，其有利于腫瘤細(xì)胞生存和治療抵抗［81?83］。工程鼠傷寒沙門氏菌表達(dá)siRNA靶向抑制Bcl?2后，Bcl?2蛋白水平明顯下降且小鼠黑色素瘤生長明顯變慢［83］。另外，STAT3在多種人類腫瘤中持續(xù)激活，在促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖和生存方面起著重要作用。靶向抑制STAT3表達(dá)后也表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤療效［84］。內(nèi)多酰胺2，3?二氧酶1（IDO）是一種色氨酸分解代謝酶，其可以抑制適應(yīng)性免疫反應(yīng)，包括激活調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg）、抑制效應(yīng)性T 細(xì)胞的活性，甚至可以誘導(dǎo)免疫細(xì)胞凋亡［85］。抑制IDO 的表達(dá)后，可以使腫瘤組織中多形核中性粒細(xì)胞浸潤增加，從而增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)［86］。

3.6 其 他

此外，近年來，PD?1 單克隆抗體和其他免疫檢查點(diǎn)抑制劑的臨床試驗表現(xiàn)出明顯的療效。然而，有一大群腫瘤患者不能對這些免疫治療產(chǎn)生反應(yīng)并且有多重毒性反應(yīng)［87?88］。因此，如何使PD?1單克隆抗體和其他免疫檢查點(diǎn)抑制劑靶向到腫瘤組織是一個亟需解決的問題。工程菌因其獨(dú)特的優(yōu)勢成為了一個理想的工具。2020 年，來自哥倫比亞大學(xué)的團(tuán)隊以尼氏大腸桿菌作為一個天然平臺，設(shè)計了一個系統(tǒng)使尼氏大腸桿菌可以穩(wěn)定表達(dá)并釋放PD?1 和CTLA?4 納米抗體。研究結(jié)果表明，與單純運(yùn)用單克隆抗體相比，注射表達(dá)PD?1和CTLA?4 的尼氏大腸桿菌后可以顯著抑制腫瘤生長。此外，該研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)活化的T細(xì)胞和記憶T 細(xì)胞數(shù)量明顯增加［22］。該團(tuán)隊以尼氏大腸桿菌作為一個天然平臺，使其可以穩(wěn)定表達(dá)和釋放CD47 納米抗體。CD47 是一種抗吞噬受體，在許多腫瘤中高度表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，阻斷CD47 后在腫瘤微環(huán)境中浸潤性T 細(xì)胞的激活顯著增加，從而抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移［89］。STING 激活后可以增加IFN?1 的分泌，從而增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)。Lora 等［23］工程化尼氏大腸桿菌靶向STING 后激活吞噬性APCs 細(xì)胞，研究發(fā)現(xiàn)抗腫瘤免疫反應(yīng)得到顯著增強(qiáng)。在腫瘤中，L?精氨酸是抗腫瘤T細(xì)胞反應(yīng)的重要因素，人為補(bǔ)充L?精氨酸可以增加腫瘤組織內(nèi)L?精氨酸的水平。但人為補(bǔ)充所需劑量太大，操作上不太現(xiàn)實(shí)。為了使L?精氨酸在腫瘤組織中維持較高水平，有研究者瘤內(nèi)注射能將氨氣合成L?精氨酸的工程尼氏大腸桿菌，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中L?精氨酸維持在較高水平。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)注射工程尼氏大腸桿菌后，腫瘤組織內(nèi)浸潤的T 細(xì)胞明顯增多并且具有長期抗腫瘤免疫效應(yīng)［24］。

4 總結(jié)和展望

近幾十年來，工程菌治療腫瘤取得了巨大進(jìn)展。工程菌在腫瘤治療方面具有許多優(yōu)點(diǎn)。腫瘤靶向性可以使細(xì)菌在腫瘤部位聚集，而在正常組織中聚集較少，并且隨著時間的推移可以被免疫系統(tǒng)清除，從而減輕系統(tǒng)毒性。與化療和放療相比，細(xì)菌具有運(yùn)動性。因此，細(xì)菌可以滲透入腫瘤組織深部，從而殺死深部的腫瘤細(xì)胞。與單一細(xì)菌治療相比，細(xì)菌作為載體遞送各種抗腫瘤劑可以協(xié)同提高抗腫瘤的療效。一方面，細(xì)菌可以靶向聚集在腫瘤組織直接殺死腫瘤細(xì)胞，或者抑制腫瘤血管的生成和激活免疫系統(tǒng)的能力；另一方面，細(xì)菌可以在腫瘤組織中增殖，從而持續(xù)表達(dá)抗腫瘤劑［9?11，35］。最新的一些研究也表明，工程菌和免疫治療（包括PD?1 抑制劑和CTLA?4 檢查點(diǎn)抑制劑）聯(lián)合運(yùn)用也取得了令人期待的結(jié)果。

盡管基因改造的細(xì)菌在腫瘤治療方面有許多優(yōu)點(diǎn)，但是一些臨床研究并未取得令人滿意的結(jié)果，基因改造的細(xì)菌在運(yùn)用于臨床前還有許多問題需要解決。首先，安全性是細(xì)菌治療腫瘤的先決條件。如果毒性沒有充分減弱，經(jīng)系統(tǒng)注射的細(xì)菌可能會在血液中增殖，釋放細(xì)菌毒素，甚至?xí)饑?yán)重的感染性休克。通過對細(xì)菌的相關(guān)基因進(jìn)行改造，可以使細(xì)菌的毒力得到不同程度的降低，從而增強(qiáng)其安全性。然而，毒性過度減低，也會使細(xì)菌治療腫瘤的療效大大減低。其次，在減弱細(xì)菌毒力的同時，還要增強(qiáng)細(xì)菌靶向到腫瘤組織的能力，以減少對其他正常組織的影響。如何平衡細(xì)菌毒力和抗腫瘤能力是一個難點(diǎn)，需要設(shè)計更精巧的基因線路來對細(xì)菌進(jìn)行改造。最后，細(xì)菌的遺傳不穩(wěn)定性也是一個潛在的問題，因為突變可能會產(chǎn)生無效或有害的表型。隨著合成生物學(xué)的發(fā)展，這些問題都將解決。在不久的將來，細(xì)菌治療將會是一種具有巨大潛力的腫瘤治療的方法。遞送抗腫瘤分子基因工程菌總結(jié)于表1。

表1 遞送抗腫瘤分子基因工程菌Table 1 Anti?tumor therapeutic agents delivered by engineered attenuated bacterium