趙明洋 胡雪梅 王東森 吳慶建

（1.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，山東 濟(jì)寧，272100；2.濟(jì)寧市第一人民醫(yī)院急診內(nèi)科，山東 濟(jì)寧，272011）

癲癇是由多種病因引起的慢性腦部疾病，特征是腦部神經(jīng)元過度放電所致的突然、反復(fù)和短暫的中樞神經(jīng)功能失常[1]。耐藥性癲癇（drug resistant epilepsy, DRE）是指正確選擇至少2 種可耐受的抗癲癇藥物單用或聯(lián)用，在服用足夠的劑量和療程后，患者在治療前最長發(fā)作間隔的3 倍或1年（取決于兩者之間哪一段更長）的時間內(nèi)仍發(fā)作[2]。造成DRE 的機(jī)制主要有藥物代謝酶假說、藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體假說、受體通道結(jié)構(gòu)改變假說等[3]。一旦發(fā)生DRE，往往會引起嚴(yán)重的后果，癲癇患者的生活也會被癲癇反復(fù)發(fā)作、并發(fā)癥的影響以及抗癲癇藥物的不良反應(yīng)所破壞，長期的癲癇發(fā)作也使癲癇患者面臨很多心理壓力，甚至縮短生存期[4-5]。

一般來說，癲癇的耐藥性是多因素共同作用而產(chǎn)生的，是環(huán)境、遺傳以及疾病和藥物相互作用的結(jié)果[6]。癲癇發(fā)作與興奮性和抑制性的突觸傳遞活動之間的不平衡有關(guān)，抑制性的突觸活動由γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）介導(dǎo)，GABA 是哺乳動物大腦中主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)[7]。GABA 轉(zhuǎn)運(yùn)體3（GABA transporter 3，GAT-3）是大腦中主要的GABA 轉(zhuǎn)運(yùn)體之一，主要表達(dá)在能與GABA 能神經(jīng)元直接接觸的遠(yuǎn)端星形細(xì)胞上，可以將突觸中的GABA 轉(zhuǎn)運(yùn)至突觸前末端或周圍的星形膠質(zhì)細(xì)胞，來終止GABA 能的抑制性突觸傳遞[8]。所以我們可以通過降低GAT-3 的水平來抑制GABA 的再攝取，從而抑制癲癇的發(fā)生[9]。SLC6A11位于3p25.3 的最小重疊區(qū)域，編碼GAT-3，GAT-3 的表達(dá)程度影響著GABA 能神經(jīng)元傳遞的功能[10]。所以我們認(rèn)為SLC6A11 基因的多態(tài)性與DRE 的產(chǎn)生有關(guān)。

在既往對DRE 的研究中，由于樣本量不足、研究人群不同以及在疾病的不同階段應(yīng)用藥物，導(dǎo)致結(jié)果產(chǎn)生分歧。因此，本研究納入了最新研究，進(jìn)行全面的Meta 分析，以評估SLC6A11 基因的多態(tài)性與DRE 的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 檢索策略

采用主題詞加自由詞的檢索方式，在中國知網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)知識服務(wù)平臺和維普資訊中文期刊服務(wù)平臺、Pubmed、Embase、Cochrane、Web of Science 數(shù)據(jù)庫，并輔以文獻(xiàn)追溯及手工檢索等方法檢索公開發(fā)表的SLC6A11 基因多態(tài)性與DRE 之間關(guān)系的研究。納入研究的時間是各數(shù)據(jù)庫建庫開始至2022年10月26日。該搜索策略是在濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院圖書館服務(wù)專家的指導(dǎo)下制訂和實(shí)施的。主要的搜索策略如下。中文檢索詞為：“SLC6A11”“耐藥性癲癇”，英文檢索詞為：“Drug Resistant Epilepsy”“Esistant Epilepsies”“Epilepsies,Medication Resistant”“Resistant Epilepsy”“gaba transporter 3”“GAT-3”以及“SLC6A11”等檢索。詳細(xì)檢索策略見補(bǔ)充文件1（文獻(xiàn)檢索策略）。

1.2 納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

文獻(xiàn)納入標(biāo)準(zhǔn)：①國內(nèi)外已發(fā)表的SLC6A11 多態(tài)性與DRE 的研究。②研究類型為病例對照試驗(yàn)。病例組為難治性癲癇患者，對照組為藥物敏感性癲癇患者[2]。③數(shù)據(jù)完整，具備完整的基因型和等位基因頻數(shù)數(shù)據(jù)，直接提供或有足夠的數(shù)據(jù)可計算比值比（Odds Ratio，OR）和95%置信區(qū)間（Confidence Interval，CI）。④病例組和對照組均符合哈迪-溫伯格（Hardy-Weinberg，HWE）平衡定律。

文獻(xiàn)排除標(biāo)準(zhǔn)：①文章質(zhì)量差，信息少或經(jīng)各種途徑仍然無法獲取主要數(shù)據(jù)的文獻(xiàn)。②有數(shù)據(jù)重復(fù)或重復(fù)發(fā)表的文獻(xiàn)。③綜述、摘要、個案、會議文件等以及Meta 分析類文獻(xiàn)。④研究對象為動物模型。

1.3 數(shù)據(jù)提取

基于上述文獻(xiàn)納入與排除標(biāo)準(zhǔn)，由兩名研究人員單獨(dú)對納入的文獻(xiàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)提取并核對，提取的內(nèi)容包括：第一作者、文獻(xiàn)發(fā)表年份、研究人群的地區(qū)國家、樣本量、癲癇患者中耐藥組和敏感組患者基因型和等位基因分布頻率。若基因型的分布是以[n（%）]表示，則將其轉(zhuǎn)化為例數(shù)錄入數(shù)據(jù)庫。若未給出等位基因分布頻率，則通過基因型分布計算得出可使用數(shù)據(jù)，詳細(xì)見表1。

表1 4 篇文章中9 項(xiàng)研究探討SLC6A11 多態(tài)性rs2272394、rs2272395 和rs2272400 與DRE 的關(guān)系

1.4 數(shù)據(jù)分析

我們研究了rs2383206、rs2383207 和rs10757278 的Hardy-Weinberg 平衡；通過R 程序，我們使用χ2檢驗(yàn)研究了SLC6A11 多態(tài)性與DRE 的關(guān)系[11]。采用Q 檢驗(yàn)對各研究結(jié)果進(jìn)行異質(zhì)性檢驗(yàn)，根據(jù)所得I2進(jìn)行判斷。如果I2＞50%，則認(rèn)為存在顯著異質(zhì)性，采用隨機(jī)效應(yīng)模型進(jìn)行數(shù)據(jù)計算；如果I2＜50%，則認(rèn)為異質(zhì)性較低，采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行數(shù)據(jù)計算[12]。采用漏斗圖和Egger’s 檢驗(yàn)評估納入文獻(xiàn)是否存在發(fā)表偏倚。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。如果異質(zhì)性檢驗(yàn)存在差異且有統(tǒng)計學(xué)意義，則對納入的研究進(jìn)行逐一排除后重新計算OR 值，并與之前結(jié)果相比較，確定異質(zhì)性來源。

1.5 基因模型

本研究應(yīng)用以下5 種基因模型進(jìn)行分析，等位基因模型（C/T），共顯性基因模型（CC+TT/CT），顯性基因模型（CC+CT/TT）,隱性基因模型（CC/CT+TT）以及加性基因模型（CC/TT）。分別計算相應(yīng)的OR 值及95%CI。

2 結(jié)果

2.1 檢索結(jié)果及文獻(xiàn)納入情況

根據(jù)檢索策略共檢索到33 篇相關(guān)文獻(xiàn)，通過閱讀文獻(xiàn)標(biāo)題、摘要和全文，最終共有4 篇符合納入標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)[7,13-15]，檢索及篩選流程見圖1。

圖1 SLC6A11 基因多態(tài)性的流程圖

2.2 連鎖不平衡

經(jīng)過SNIPA 驗(yàn)證，rs2272394、rs2272395、rs2272400 位于同一條染色體，彼此距離為0 kb，顯示三者具有連鎖不平衡，所以我們可將三者認(rèn)為是同一個基因多態(tài)性進(jìn)行整合分析（https://snipa.helmholtz-muenchen.de/snipa3/）。

2.3 納入文獻(xiàn)研究特征

我們選取了SLC6A11 基因rs2272394、rs2272395 以及rs2272400 三種多態(tài)性，經(jīng)過SNIPA 驗(yàn)證，三個核苷酸距離相近，我們進(jìn)行研究時可將三者進(jìn)行整合分析，在納入的4篇文獻(xiàn)中共有9 項(xiàng)研究被納入Meta 分析，其中有3 項(xiàng)研究的單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）為rs2272400，2 項(xiàng)研究的SNP 為rs2272395，4 項(xiàng)研究的SNP 為rs2272394。在納入的9 項(xiàng)研究中，耐藥組病例共有1 172 例，藥物敏感組病例共有1 340 例，其中4 項(xiàng)研究中的研究人群為中國人，3 項(xiàng)研究中的研究人群為韓國人，1 項(xiàng)研究中的研究人群為印度人，1 項(xiàng)研究中的研究人群為馬來西亞人，基本信息見表1 和表2。

表2 SLC6A11 基因多態(tài)性rs2272394、rs2272395 和rs2272400 不同遺傳方式與DRE 易感性的相關(guān)性分析

2.4 Meta 分析結(jié)果

2.4.1 SLC6A11 等位基因Meta 分析

2.4.1.1 異質(zhì)性分析

我們將9 項(xiàng)研究進(jìn)行分析，結(jié)果顯示等位基因模型的I2=30%，所以采用固定效應(yīng)模型計算，結(jié)果顯示該等位基因模型與DRE 的發(fā)生無關(guān)（P＞0.05），表明該等位基因與DRE 無確切關(guān)系（OR=0.89，95%CI=0.79～1.01，P=0.18），見圖2A。

圖2 等位基因的森林圖

2.4.1.2 發(fā)表偏倚

在我們的研究中，采用的是Egger’s 分析方法，得出該9項(xiàng)研究不存在發(fā)表偏倚（P=0.82），本研究所形成的漏斗圖分布較為均勻，顯示本研究不存在明顯的發(fā)表偏倚，見圖3A。

圖3 等位基因的漏斗圖

2.4.1.3 敏感性分析

本文采用逐篇剔除的方法進(jìn)行敏感性分析，并未發(fā)現(xiàn)有對研究結(jié)果產(chǎn)生明顯影響的文章。

2.4.2 剔除邊緣性研究后的Meta 分析

對納入文章進(jìn)行全面分析，漏斗圖分布較為均勻?qū)ΨQ，但有一篇文獻(xiàn)在漏斗圖中的位置臨近邊緣，雖未在數(shù)據(jù)上顯示存在異質(zhì)性，但基于對過往試驗(yàn)的經(jīng)驗(yàn)總結(jié)，將其剔除后再次進(jìn)行分析。

在剔除邊緣性研究后的研究中，森林圖顯示異質(zhì)性（I2=1%）較前明顯減小，我們采用固定效應(yīng)模型進(jìn)行分析，結(jié)果顯示剔除邊緣性研究后的該等位基因與DRE 仍無確切關(guān)系（OR=0.93，95%CI=0.82～1.06，P=0.42），具體結(jié)果見圖2B。剔除邊緣性研究后OR 值與總體數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，且漏斗圖分布對稱且均勻，見圖3B，說明不存在發(fā)表偏倚，結(jié)果較為穩(wěn)定。

2.4.3 SLC6A11 基因模型Meta 分析

由于本研究對SLC6A11 基因分析中并未得到陽性的結(jié)果，為進(jìn)一步全方位了解該基因與DRE 之間的關(guān)系，我們選取4 種主要的基因模型再次進(jìn)行Meta 分析。

2.4.3.1 異質(zhì)性分析

我們通過對基因模型進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，隱性基因模型不是明顯的DRE 致病基因模型（OR=0.79）；顯性基因模型與DRE 不存在顯著聯(lián)系（OR=0.99）；加性基因模型不會引起DRE 的明顯發(fā)生（OR=0.86）；超顯性模型與DRE 之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（OR=0.83），見表3、圖4。

表3 SLC6A11 多態(tài)性rs2272394、rs2272395 和rs2272400五種遺傳模式與耐藥癲癇的相關(guān)性分析

圖4 四種基因模型的森林圖分析

2.4.3.2 發(fā)表偏倚

我們對四種基因模型采用Egger’s 檢驗(yàn)進(jìn)行發(fā)表偏倚檢測，隱性基因模型不存在發(fā)表偏倚（P=0.77）；顯性基因模型不存在發(fā)表偏倚（P=0.20）；加性基因模型不存在發(fā)表偏倚（P=0.59）；超顯性基因模型不存在發(fā)表偏倚（P=0.20）。各基因模型的漏斗圖分布較為均勻?qū)ΨQ，大部分點(diǎn)都位于95%區(qū)間內(nèi)，見圖5，顯示本研究的發(fā)表偏倚較小。

圖5 四種基因模型的漏斗圖

3 討論

癲癇在全球范圍內(nèi)影響超過6 500 萬人，是最常見的慢性神經(jīng)系統(tǒng)疾病[16]。藥物治療是目前應(yīng)用較為廣泛的治療手段[17]。目前，抗癲癇藥物主要針對的是電壓門控陽離子通道或者影響GABA 介導(dǎo)的神經(jīng)抑制，苯二氮?類藥物可增強(qiáng)GABA 的活性作為抗癲癇藥物使用[18-19]。GABA 轉(zhuǎn)運(yùn)體可將突觸中的GABA 轉(zhuǎn)運(yùn)至突觸前末端或周圍的星形膠質(zhì)細(xì)胞，通過神經(jīng)末梢吸收的GABA 可被包裹在神經(jīng)末梢中重新利用，而被GAT-3 回收進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞中的GABA 可能會通過代謝而丟失[20]。SLC6A11 基因的多態(tài)性可影響GAT-3 的表達(dá)，進(jìn)而影響抗癲癇藥物的治療效果，基于上述研究機(jī)制，本文通過Meta 分析進(jìn)一步探究SLC6A11 的基因多態(tài)性與DRE的相關(guān)性。

2011年一項(xiàng)來自韓國的研究指出，SLC6A11 基因的rs2272400 會使患者抗癲癇藥物耐藥性產(chǎn)生的風(fēng)險增加[13]。然而2014年中國學(xué)者研究中國人群中的SLC6A11 基因與癲癇耐藥性的相關(guān)性，未能得到陽性結(jié)果[14]。HIDAYATI[15]、丁晶等[7]的幾項(xiàng)研究均未取得陽性結(jié)果，為了明確SLC6A11與DRE 的關(guān)系，我們進(jìn)行了Meta 分析，通過擴(kuò)大樣本量的方法來得到更加科學(xué)的結(jié)果。在研究中，尚無明確證據(jù)證明SLC6A11 多態(tài)性與抗癲癇藥物產(chǎn)生耐藥性之間的關(guān)系，且進(jìn)一步研究了各基因模型與癲癇耐藥性之間的關(guān)系，但仍然沒有證實(shí)SLC6A11 會增加抗癲癇藥物耐藥性產(chǎn)生的風(fēng)險。雖然本研究嚴(yán)格按照文獻(xiàn)納入標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行文章的篩選，但仍然存在不足。一方面，本研究納入文章數(shù)量過少，馬來西亞、印度人群的研究僅納入一篇文章，樣本數(shù)量不足，可能導(dǎo)致統(tǒng)計學(xué)差異，對研究的結(jié)果造成影響。另一方面，必須考慮可能存在的人群分層對研究結(jié)果的影響，在研究人群中，涉及亞洲各地區(qū)，包括韓國、中國、馬來西亞以及印度，但缺乏西方國家人群的研究，所以我們尚無法做出肯定性的結(jié)論，認(rèn)為SLC6A11 基因多態(tài)性rs2272394、rs2272395、rs2272400 與癲癇耐藥性的產(chǎn)生無關(guān)。雖然本研究最終并沒有證實(shí)SLC6A11會增加DRE 發(fā)生的風(fēng)險，但也給我們帶來了一些啟示和思考。SLC6A11 基因在不同人種之間是否存在差異性，在西方人群中是否體現(xiàn)與DRE 之間的相關(guān)性仍需后續(xù)的研究。

4 結(jié)論

本研究在納入的9 項(xiàng)研究中暫未發(fā)現(xiàn)SLC6A11 基因會明顯增加DRE 的發(fā)生風(fēng)險。