楊 巍,李榮權(quán)

(1.農(nóng)安縣萬順鄉(xiāng)綜合服務(wù)中心,吉林 農(nóng)安130231; 2.吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動物科技學(xué)院,吉林 吉林 132101)

中草藥遍地金是金絲桃屬植物,花、葉、莖、根等均可以入藥,又被稱為小化血、小化藥、螞蟻草、小黃花香等[1],主要含有環(huán)丙酮類、脂肪酸類、甾體類化合物等幾十種成分[2]。遍地金在我國被發(fā)現(xiàn)且使用較早,主要用于治療炎癥、腹瀉等疾病,有清熱解毒的功效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn),遍地金具有多種藥理活性,具有抗抑郁[3]、抗腫瘤、抑制中樞神經(jīng)、創(chuàng)傷收斂作用及抗菌消炎與鎮(zhèn)痛效果,是一種副作用小、不良反應(yīng)少的中藥[4]。目前,對遍地金鎮(zhèn)痛抗菌的相關(guān)研究較少,尚未明確其有效的化學(xué)成分。本研究對遍地金花期與果期的鎮(zhèn)痛抑菌效果進(jìn)行比較,為其藥理作用及有效化學(xué)成分研究奠定基礎(chǔ)。

1 試驗(yàn)材料

1.1 藥材與試驗(yàn)動物

花期遍地金于7月采摘,產(chǎn)地云南;果期遍地金于10月采摘,產(chǎn)地云南。試驗(yàn)小白鼠96只,18～20 g,雌性,購自長春市土門嶺誠信動物飼養(yǎng)場。

1.2 菌種及試劑

金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、冰醋酸溶液、生理鹽水(農(nóng)安縣畜牧業(yè)管理局提供),阿司匹林(上海信誼天平藥業(yè)有限公司生產(chǎn)),瓊脂培養(yǎng)基(購自南通凱恒生物科技發(fā)展有限公司)。

1.3 儀器設(shè)備

大小鼠熱板測痛儀(ZL-020,安徽耀坤生物科技有限公司生產(chǎn)),電子天平(EL600,日本島津集團(tuán)生產(chǎn)),高壓滅菌鍋(BKQ,上海申安生產(chǎn)),恒溫培養(yǎng)箱(303-00(A),康恒儀器生產(chǎn)),無菌超凈臺(BBS-DSC,博科集團(tuán)生產(chǎn))。

2 試驗(yàn)方法

2.1 遍地金水提液的制備

取花期遍地金與果期遍地金各200 g,分別用10倍量的水浸泡1 h,放入鍋中煎煮3次,每次50 min,合并3次煎煮液進(jìn)行濃縮,濃縮至100 mL、濃度2 g·mL-1,用純化水進(jìn)行稀釋,配制高、中、低3個濃度,分別為2.0、1.0、0.5 g·mL-1,冰箱冷藏,備用。

2.2 鎮(zhèn)痛試驗(yàn)

2.2.1 分組及給藥

取48只小白鼠,隨機(jī)分為8組,每組6只小白鼠,分別為對照組,陽性對照組(阿司匹林組),花期遍地金低、中、高劑量組,果期遍地金低、中、高劑量組。阿司匹林0.2 mL/10 g(4 mg/mL)?；ㄆ诒榈亟鸬蜐舛冉M、中濃度組、高濃度組,規(guī)格均為0.2 mL/10 g,濃度分別為0.5 g/mL、1.0 g/mL、2.0 g/mL,對照組灌胃等量生理鹽水,果期遍地金高中低濃度組與花期遍地金組同。

2.2.2 扭體法試驗(yàn)

各組小白鼠按分組、體重進(jìn)行藥物灌胃,1次/d,連續(xù)灌胃5 d,最后一次給藥40 min后分別給各組小白鼠腹腔注射0.6%冰醋酸,0.2 mL/只,觀察并記錄15 min內(nèi)各組小鼠扭體次數(shù)均值,用以下公式計(jì)算鎮(zhèn)痛百分率[5]。

鎮(zhèn)痛百分率=(對照組扭體次數(shù)均值-實(shí)驗(yàn)組扭體次數(shù)均值)/對照組扭體次數(shù)均值×100%

2.2.3 熱板法試驗(yàn)

為了確保試驗(yàn)的準(zhǔn)確性,每只小白鼠測定2次,測定時間間隔為7 min,取2次痛閾值的平均值。痛閾值平均值為10～30 s的小白鼠為試驗(yàn)所需動物,選取合格的小鼠48只,分組方法同2.2.1。將各組小鼠分別放在溫度為(55±0.5) ℃的熱板上,計(jì)算小鼠足底接觸熱板時間至其舔足的時間,該時間段為小鼠的痛閾值,記錄數(shù)據(jù)。連續(xù)7 d在相同時間段給小鼠灌胃,在最后一次給藥后分別在60、90、150 min對其痛閥值進(jìn)行測定,對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行記錄,計(jì)算痛閥提高百分率,對組間差異進(jìn)行比較。

痛閥提高百分率=(每只小鼠用藥后不同時點(diǎn)的痛閥-該只小鼠用藥前痛閥均值)/該只小鼠用藥前痛閥均值×100%

2.3 體外抑菌試驗(yàn)

2.3.1 最小抑菌濃度(MIC)測定

取8支滅菌試管,依次編號,向各個試管中分別加1 mL液體培養(yǎng)基。在無菌操作下用移液管吸取1 mL花期水提液原液(2 g/mL),將其加入到第1支試管中,混合均勻后吸取1 mL混合溶液加入到第2支無菌試管中,按照此倍比依次稀釋至第7支試管,再混勻,從第7支試管中取出1 mL混合液體棄掉,此時試管中藥液濃度依次為原藥液濃度的1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128,第8支試管為對照組管,不加任何藥液。使用滅菌的移液管移取菌液0.05 mL,依次加到8支試管中混合均勻,8支試管置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后進(jìn)行觀察[6]。未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌生長的試管的藥液濃度即為該供試菌的最小抑菌濃度。果期MIC測定同花期。

2.3.2 紙片法抑菌試驗(yàn)

分別將直徑為6 mm的滅菌紙片浸泡在花期遍地金2 g/mL、1 g/mL、0.5 g/mL,果期遍地金2 g/mL、1 g/mL、0.5 g/mL,無菌水(空白對照組)中,充分浸泡20 min即可用于試驗(yàn)。

用無菌吊環(huán)吊取大腸桿菌,放入無菌水中制成大腸桿菌液,用移液器分別吸取1 mL大腸桿菌液,放入培養(yǎng)皿中,再用涂布器涂均勻,將同一濃度的花期、果期遍地金藥敏片放入同一個平板內(nèi),再加入一個空白紙片作對照,每個濃度3個平板,紙片放置后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,測量抑菌圈直徑。抑菌圈直徑小于10 mm為耐藥,10～15 mm為中度敏感,大于15 mm為高度敏感。

金黃色葡萄球菌的抑菌試驗(yàn)操作同上。

3 結(jié)果與分析

3.1 鎮(zhèn)痛試驗(yàn)

3.1.1 冰醋酸扭體試驗(yàn)

由表1可知,對照組的扭體次數(shù)>果期遍地金的扭體次數(shù)>花期遍地金的扭體次數(shù)>陽性對照組的扭體次數(shù),花期、果期遍地近隨著濃度的增加,扭體數(shù)均值逐漸減少,鎮(zhèn)痛百分率逐漸增大,說明鎮(zhèn)痛效果與花期、果期遍地金濃度呈正比。相同濃度低濃度與中濃度鎮(zhèn)痛效果無顯著差異(P>0.05),而高濃度的果期與花期則差異極顯著(P<0.01)。各藥物組與陽性對照比較,差異極顯著(P<0.01)。

表1 花期與果期遍地金對冰醋酸致小鼠扭體反應(yīng)的影響

3.1.2 熱板試驗(yàn)

熱板法試驗(yàn)結(jié)果如表2所示,在給藥后60 min、90 min、120 min,低濃度花期與果期遍地金組及對照組痛閾值比較差異不顯著(P>0.05),中濃度時花期極顯著(P<0.01),果期不顯著(P>0.05),高濃度時兩者都顯著,從中可以看出,花期遍地金的鎮(zhèn)痛效果比果期好。通過計(jì)算可知,中、高濃度時,果期遍地金與花期遍地金的效果差異顯著。由痛閾值提高率可知,從給藥后60 min到給藥后120 min,花期與果期遍地金痛閾值提高率都在不斷增加,給藥90 min后也未達(dá)到藥效最高點(diǎn)。由試驗(yàn)結(jié)果可知,花期遍地金鎮(zhèn)痛效果稍強(qiáng)。

表2 熱板法鎮(zhèn)痛試驗(yàn)結(jié)果

3.2 體外抑菌試驗(yàn)

3.2.1 MIC值測定結(jié)果與分析

由表3可知,花期與果期遍地金對大腸桿菌的MIC值分別是25、12.5,對金葡菌的MIC值為12.5、5.25,說明果期遍地金的抑菌效果好于花期,初步判定果期遍地金比花期遍地金敏感。

表3 花期和果期遍地金MIC值

3.2.2 紙片法測定結(jié)果與分析

由表4可知,與空白組比較,1 g/mL、2 g/mL花期與果期遍地金對大腸桿菌(金黃色葡萄球菌)抑菌圈直徑差異顯著性(P<0.01)。同等濃度遍地金對金黃色葡萄球菌的抑制效果更好,2 g/mL果期遍地金對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的平均抑菌圈直徑都大于10 mm,花期直徑都小于10 mm,由此可知,果期遍地金組的抑菌效果更具研究價值。

表4 花期和果期遍地金抑菌圈直徑

4 討論

目前對于遍地金的研究主要集中在抗抑郁、抗腫瘤的作用及機(jī)理上,對于鎮(zhèn)痛、抗炎的研究相對較少,本研究得出不同濃度花期、果期的提取液對大腸桿菌及金葡菌均有不同的抑菌效果,這與Bala-periasamy B 等的研究結(jié)果一致[7],對革蘭氏陽性菌的抗菌活性高于革蘭氏陰性菌,更高濃度是否會有更大的抑菌作用仍需不斷探討。對于遍地金的鎮(zhèn)痛作用未見有報道,提取方法等是否會影響作用的強(qiáng)弱有待于進(jìn)一步研究。遍地金的化學(xué)成分隨著研究的不斷深入,多種新的化合物將不斷被發(fā)現(xiàn),遍地金的藥用功能將會有更大的研發(fā)空間,飼料添加劑的開發(fā)將具有廣闊的前景。

5 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對花期與果期遍地金的鎮(zhèn)痛及抑菌作用進(jìn)行比較。扭體法實(shí)驗(yàn)結(jié)果(抑制率花期低、中、高為5.69%、16.88%、35.56%,果期低、中、高為10.45%、11.24%、19.63%)與熱板實(shí)驗(yàn)結(jié)果均顯示花期遍地金的鎮(zhèn)痛效果比果期更好,其中高濃度兩個時期遍地金給藥后痛閾值差異極顯著。用二倍稀釋法分別測定了花期與果期遍地金的MIC值(大腸桿菌為25 μg·mL-1、12.50 μg·mL-1,金黃色葡萄球菌為12.5 μg·mL-1、6.25 μg·mL-1),了解其對兩種菌的不同敏感程度。體外抑菌實(shí)驗(yàn)表明,花期遍地金對金黃色葡萄球菌及大腸桿菌敏感度都不強(qiáng),抑菌效果不強(qiáng),高濃度時抑菌圈相對較大,對金黃色葡萄球菌及大腸桿菌的平均抑菌圈直徑分別為8.13 mm、7.98 mm。果期遍地金抑菌效果相對更好一點(diǎn)(屬于中度敏感),高濃度的平均抑菌圈直徑值分別為11.95 mm、10.83 mm?；ㄆ诒榈亟鹪阪?zhèn)痛方面利用價值更高,如果用遍地金來抑菌可選擇果期遍地金。此結(jié)果可為遍地金的合理利用及其鎮(zhèn)痛、抑菌作用研究提供參考。