涂倩,簡(jiǎn)玉英,謝大明,曾珍,劉韞滔,王彩霞,胡濱,李誠(chéng)

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院,四川 雅安,625000)

肉桂精油是從肉桂葉和樹(shù)皮中提取的次級(jí)代謝產(chǎn)物,呈黃色黏性狀,含有肉桂醛、香芹酚、香葉醇、芳樟醇及α-水芹烯等一系列活性物質(zhì),具有抑菌、抗氧化、消炎鎮(zhèn)痛、抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖等多種生理功能[1]。肉桂精油作為一種天然防腐劑,對(duì)食源性致病菌和腐敗菌(大腸桿菌、假單胞菌屬、沙門(mén)氏菌等)的生長(zhǎng)表現(xiàn)出良好的抑制作用,此外,精油中的烯萜類(lèi)、醛類(lèi)等活性成分亦賦予其較強(qiáng)的抗氧化活性[2]。然而,肉桂精油穩(wěn)定性和水溶性差、對(duì)環(huán)境敏感以及伴有強(qiáng)烈的氣味,限制了其應(yīng)用范圍[3]。

脂質(zhì)體是由磷脂分子在水溶性中形成具有雙分子層結(jié)構(gòu)的閉合囊泡,可同時(shí)包裹疏水性和親水性物質(zhì),具有生物相容性、兩親性、緩釋等優(yōu)點(diǎn),在食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域有重要應(yīng)用前景[4]。作為一種運(yùn)載體系,脂質(zhì)體不僅可增強(qiáng)被包封物質(zhì)的穩(wěn)定性,還可延長(zhǎng)活性物質(zhì)在體內(nèi)的保留時(shí)間,達(dá)到緩釋作用。將精油制備成脂質(zhì)體這一載體形式,不僅可有效降低環(huán)境因素(如氧氣、光、溫度等)對(duì)肉桂精油的不利影響,還可掩蓋精油的刺激性氣味,提高感官屬性和精油的生物利用度。

近年來(lái),隨著研究的不斷深入,學(xué)者們對(duì)精油脂質(zhì)體的研究逐步展開(kāi)。例如,劉玉蘭[5]采用乙醇注入法制備了肉桂醛脂質(zhì)體,通過(guò)考察保留率、粒徑等理化指標(biāo),證明了脂質(zhì)體的穩(wěn)定性。李偉[6]通過(guò)薄膜超聲分散法將肉桂精油/β-環(huán)糊精包合物包封于脂質(zhì)體內(nèi),再通過(guò)凍融方法制得包埋肉桂精油/β-環(huán)糊精的蛋白脂質(zhì)體,通過(guò)體外釋放證實(shí)了蛋白脂質(zhì)體運(yùn)載體系具有控釋抗菌作用。高壓微射流均質(zhì)技術(shù)制備的脂質(zhì)體具有粒徑小、分散均勻且避免使用有毒試劑的特點(diǎn),但目前關(guān)于采用該技術(shù)優(yōu)化制備肉桂精油脂質(zhì)體的報(bào)道尚未出現(xiàn)。鑒于此,本研究采用薄膜分散-高壓均質(zhì)法制備肉桂精油脂質(zhì)體,以包埋率和平均粒徑為指標(biāo)對(duì)制備工藝進(jìn)行優(yōu)化,并對(duì)其zeta電位、形貌、熱穩(wěn)定性、紅外光譜、體外釋放及抑菌性能等理化性質(zhì)進(jìn)行考察。研究旨在開(kāi)發(fā)一種包埋率較高、穩(wěn)定性好、緩釋效果好的脂質(zhì)體運(yùn)載體系,以擴(kuò)大肉桂精油的應(yīng)用范圍。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肉桂精油(純度85%),上海源葉有限公司;蛋黃卵磷脂(純度90%)、膽固醇(純度95%)、吐溫-80,上海生工生物工程股份有限公司;磷酸鹽緩沖液(PBS,0.01 mol/L,pH 7.2),北京索萊寶科技有限公司;大腸桿菌(ATCC 25922)、金黃色葡萄球菌(ATCC 6538),嘉楚生物工程有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

Nano-ZS馬爾文分析儀,英國(guó)馬爾文儀器有限公司;3001-2207酶標(biāo)儀,美國(guó)賽默飛有限公司;AH-BASIC高壓均質(zhì)機(jī),安拓思納米技術(shù)有限公司;RCD-1A高速均質(zhì)機(jī),常州越新儀器制造有限公司;Nicolet IS 10傅里葉紅外色譜儀,賽默飛世爾科技有限公司;Q200MDSC差示掃描量熱儀,美國(guó)TA公司;59750氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀,美國(guó)Agilent公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 肉桂精油脂質(zhì)體的制備

將一定比例的蛋黃卵磷脂、膽固醇、吐溫-80、肉桂精油溶于25 mL無(wú)水乙醇中,溶解混勻后轉(zhuǎn)移至圓底燒瓶中,置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓蒸發(fā)(45 ℃,40 r/min),除去有機(jī)溶劑,形成脂質(zhì)薄膜,再加入PBS超聲水化得到懸濁液,然后利用高速分散機(jī)在10 000 r/min下剪切2 min,最后在60 MPa高壓均質(zhì)下循環(huán)3～4次得到肉桂精油脂質(zhì)體。

1.3.2 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

分別探究:(1)在膽固醇與肉桂精油、吐溫-80質(zhì)量比為1∶1∶1的條件下,磷脂與膽固醇質(zhì)量比(1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1);(2)在磷脂與膽固醇、吐溫-80質(zhì)量比為4∶1∶1的條件下,肉桂精油質(zhì)量濃度(1、1.5、2、2.5、3、3.5 mg/mL);(3)在磷脂與膽固醇、精油質(zhì)量比為4∶1∶1條件下,吐溫-80質(zhì)量濃度(1、1.5、2、2.5、3、3.5 mg/mL);(4)在磷脂與膽固醇、精油、吐溫-80質(zhì)量比為4∶1∶1∶1的條件下,PBS用量(20、30、40、50、60、70 mL)對(duì)肉桂精油脂質(zhì)體平均粒徑和包埋率的影響。單因素試驗(yàn)優(yōu)化某一參數(shù)時(shí),分別固定磷脂與膽固醇質(zhì)量比4∶1(磷脂質(zhì)量濃度為10 mg/mL,膽固醇質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL),肉桂精油質(zhì)量濃度2.5 mg/mL,吐溫-80質(zhì)量濃度2.5 mg/mL,PBS用量40 mL。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,篩選出磷脂與膽固醇質(zhì)量比(A)、肉桂精油質(zhì)量濃度(B)、吐溫-80質(zhì)量濃度(C)作為考察對(duì)象,包埋率(Y)為因變量,利用Box-Behnken設(shè)計(jì)對(duì)肉桂精油脂質(zhì)體的制備工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,試驗(yàn)因素及編號(hào)見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)因素水平表Table 1 Table of test factor levels

1.3.4 肉桂精油脂質(zhì)體理化性質(zhì)的表征

1.3.4.1 肉桂精油包埋率的測(cè)定

肉桂精油標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備:精密稱(chēng)取肉桂精油100 mg置100 mL容量瓶中,無(wú)水乙醇稀釋定容制得1 mg/mL母液。取母液分別配制100、80、60、40、20、10 μg/mL系列溶液,以無(wú)水乙醇為空白參比,在290 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光度,計(jì)算得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為:y=0.008 4x+0.066 7,R2=0.998 4,該范圍內(nèi)線性較好。

參考李暢等[7]的方法稍作修改,取1 mL脂質(zhì)體于10 mL的離心管中,加4 mL石油醚,渦旋混勻后離心(6 000 r/min,10 min),收集上清液,重復(fù)操作2次后合并有機(jī)相,無(wú)水乙醇定容至25 mL,在290 nm處測(cè)定吸光度,按上述標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算游離精油含量A1。另取1 mL脂質(zhì)體,用無(wú)水乙醇稀釋定容至25 mL,水浴超聲1 h,測(cè)定吸光度值并計(jì)算肉桂精油總含量A2,按公式(1)得出包封率:

(1)

式中:EE,肉桂精油包埋率,%;A1,游離肉桂精油含量,mg;A2,肉桂精油總含量,mg。

1.3.4.2 透射電鏡(transmission electron microscope,TEM)

參考CHAVES等[8]的方法,將少量肉桂精油脂質(zhì)體滴加于100目銅網(wǎng)上,自然風(fēng)干后用10 g/L磷鎢酸進(jìn)行負(fù)染,晾干后進(jìn)行TEM分析。

1.3.4.3 粒徑、聚合物分散性指數(shù)(polymer dispersity index,PDI)及zeta電位的測(cè)定

參考郝靜梅等[9]的方法,樣品用超純水稀釋100倍后,采用馬爾文分析儀測(cè)定其平均粒徑、PDI及zeta電位。

1.3.4.4 差示掃描量熱分析(differential scanning calorimetry,DSC)

參考顧家毓等[10]的方法,取5 mg經(jīng)干燥的樣品置于坩堝中,以空白坩堝為對(duì)照,N2為載氣,10 ℃/min速度從25 ℃加熱至100 ℃,研究分析脂質(zhì)體的熱至相變情況。

1.3.4.5 傅里葉紅外光譜分析(Fourier transform infrared spectrometer,FTIR)

參考ZHANG等[11]的方法,將樣品與KBr混勻壓片后,在4 000～500 cm-1紅外波段內(nèi)對(duì)肉桂精油、肉桂精油脂質(zhì)體進(jìn)行光譜分析。

1.3.4.6 體外釋放分析

采用透析法[12]進(jìn)行,取2 mL脂質(zhì)體于透析袋(14 ku)中,置于100 mL PBS中并在25 ℃下連續(xù)振蕩(200 r/min),分別在0.5、2、4、6、8、12、24、36、48、60、72 h定時(shí)取樣,同時(shí)補(bǔ)充等量緩沖液,在290 nm處測(cè)定吸光度,計(jì)算肉桂精油累計(jì)釋放量,并對(duì)體外釋放結(jié)果進(jìn)行動(dòng)力學(xué)擬合分析。

1.3.4.7 肉桂精油脂質(zhì)體抑菌性能分析

將大腸桿菌和金黃色葡萄球菌活化后,加7.5 g/L生理鹽水稀釋菌懸液,分別取4 mL肉桂精油脂質(zhì)體和10 g/L吐溫-80稀釋的肉桂精油溶液于不同菌懸液中,體積分?jǐn)?shù)為40%,37 ℃振蕩培養(yǎng),每隔1 d取樣進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Design-Expert 8.0.6.1進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)與分析,Origin 2018進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 蛋黃卵磷脂與膽固醇質(zhì)量比

膽固醇是類(lèi)脂質(zhì)的主要成分,常作為脂質(zhì)體的穩(wěn)定劑[13],在適宜的濃度下,親水性羥基基團(tuán)與磷脂分子極性基團(tuán)形成氫鍵,利用氫鍵間相互作用來(lái)調(diào)解脂膜的剛性和致密性,能極大地穩(wěn)定脂質(zhì)體結(jié)構(gòu),進(jìn)而穩(wěn)定脂質(zhì)體的負(fù)載能力。圖1-a結(jié)果顯示,隨著磷脂與膽固醇質(zhì)量比的增大,包埋率顯著增加后降低,平均粒徑先減小后增加,當(dāng)質(zhì)量比為4∶1時(shí),包埋率達(dá)最大(76.23%),平均粒徑最小(91.18 nm)。脂質(zhì)體的濃度與其負(fù)載能力均會(huì)影響精油的包埋率,當(dāng)磷脂與膽固醇質(zhì)量比增加時(shí),形成的脂質(zhì)體分子增多且平均粒徑逐漸減小,結(jié)構(gòu)逐漸趨于穩(wěn)定,導(dǎo)致包埋率顯著增大。當(dāng)質(zhì)量比大于4∶1后,包埋率反而呈下降趨勢(shì),且平均粒徑逐漸增大,這是由于磷脂濃度過(guò)高影響了脂質(zhì)體膜的形成,降低了脂質(zhì)體電荷之間的靜電排斥作用,聚集現(xiàn)象出現(xiàn)導(dǎo)致粒徑增大[14],此時(shí)的脂質(zhì)體濃度高但體系不穩(wěn)定,精油泄露,負(fù)載能力顯著減弱,致使包埋率降低。本試驗(yàn)研究結(jié)果與前人研究結(jié)果相似[15]。綜合考慮確定磷脂與膽固醇的最佳質(zhì)量比為4∶1,此時(shí)包埋率最大、粒徑最小、負(fù)載能力較好。

a-磷脂與膽固醇質(zhì)量比;b-肉桂精油質(zhì)量濃度;c-吐溫-80質(zhì)量濃度;d-PBS用量圖1 磷脂與膽固醇質(zhì)量比、肉桂精油質(zhì)量濃度、吐溫-80質(zhì)量濃度和PBS用量對(duì)肉桂精油脂質(zhì)體包埋率、平均粒徑的影響Fig.1 Effects of mass ratio of phospholipid to cholesterol, mass concentration of cinnamon essential oil, mass concentration of tween 80 and PBS dosage on the embedding efficiency and average particle size of cinnamon essential oil liposomes

2.1.2 肉桂精油質(zhì)量濃度

圖1-b結(jié)果表明,肉桂精油質(zhì)量濃度從1 mg/mL增加到2.5 mg/mL,包埋率從62.48%增加到最大(81.26%),當(dāng)精油質(zhì)量濃度超過(guò)2.5 mg/mL時(shí),包埋率逐漸降低,證明肉桂精油濃度過(guò)低或過(guò)高均不利于精油脂質(zhì)體的形成,同時(shí)磷脂形成的脂質(zhì)體具有一定的空間承載能力[16]。當(dāng)肉桂精油濃度較低時(shí),包埋率偏低,這可能是精油在低濃度下與脂質(zhì)體體系接觸機(jī)率較少所致;隨著肉桂精油添加量增多,接觸機(jī)率增加,包埋率隨之增加;當(dāng)添加量超過(guò)脂質(zhì)體的負(fù)載能力時(shí),再添加更多肉桂精油,亦不能被包埋于脂質(zhì)體,最終導(dǎo)致包埋率降低。而平均粒徑隨肉桂精油濃度的增加先降低后逐漸增大,當(dāng)肉桂精油為2 mg/mL時(shí),粒徑最小為87.17 nm,出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因是精油添加量超出了脂質(zhì)體空間負(fù)荷,干擾磷脂間相互作用力,導(dǎo)致磷脂雙分子層結(jié)構(gòu)的柔韌性和致密性減弱,致使雙分子層膨脹,粒徑增大[17]。綜合分析,選擇肉桂精油質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL較為理想,此時(shí)包埋率最大,粒徑相對(duì)較小。

2.1.3 吐溫-80質(zhì)量濃度

由圖1-c可知,隨著吐溫-80質(zhì)量濃度增加平均粒徑呈持續(xù)下降趨勢(shì),包埋率先增大后減小,當(dāng)吐溫-80質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL時(shí),包埋率達(dá)最大(79.74%),而當(dāng)濃度繼續(xù)增加,包埋率減小。吐溫-80是一種呈親水性長(zhǎng)鏈結(jié)構(gòu)的化合物,通過(guò)物理吸附在脂質(zhì)體膜表面形成一定厚度親水層,具有空間位阻效應(yīng),使得脂質(zhì)體系統(tǒng)牢固[18];然而過(guò)量的吐溫-80的加入導(dǎo)致乳化過(guò)度,脂質(zhì)體囊泡被溶解,平均粒徑降低,同時(shí)造成脂質(zhì)體內(nèi)空間受限,不能對(duì)肉桂精油進(jìn)行有效包埋[19]。綜合考慮,選擇吐溫-80質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.1.4 PBS緩沖液用量

由圖1-d可知,平均粒徑先降低隨后趨于平穩(wěn)且變化幅度較小,隨著緩沖液用量的增加,脂質(zhì)體體系濃度下降,粒子間更加均勻分布,使得平均粒徑減少直到趨于平穩(wěn)[20]。肉桂精油脂質(zhì)體包埋率隨緩沖液用量增加逐漸升高,但緩沖液用量超過(guò)40 mL,包埋率略有下降。但過(guò)少的PBS,不利于脂質(zhì)的水化過(guò)程,易產(chǎn)生聚集絮凝,從而導(dǎo)致包埋率較低。同時(shí)調(diào)查發(fā)現(xiàn),本試驗(yàn)研究契合宋恭帥等[21]的研究結(jié)果。綜上,PBS的增加引起包埋率和平均粒徑的變化并不明顯,確定PBS最佳用量為40 mL。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化分析

利用Design-Expert軟件對(duì)包埋率與各因素間的關(guān)系進(jìn)行回歸分析,響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。通過(guò)回歸擬合得到多元回歸方程為:

表2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Response surface optimization test results

Y=81.68+1.08A+3.53B+5.80C-2.57AB+0.55AC-4.58BC-9.82A2-8.24B2-6.21C2

根據(jù)表3的方程分析,模型具有極顯著性(P<0.000 1);失擬項(xiàng)不顯著(P>0.05);R2=0.993 2,可以解釋99.32%的總變化,說(shuō)明該模型擬合情況好,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表3 響應(yīng)面方差分析Table 3 Response surface analysis of variance

此外,線性系數(shù)A及相互作用系數(shù)AB對(duì)Y有顯著影響(P<0.05),線性(B、C)、相互作用系數(shù)(BC)和二次項(xiàng)系數(shù)(A2、B2、C2)對(duì)結(jié)果達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。根據(jù)分析結(jié)果,影響包埋率的因素主次為:吐溫80質(zhì)量濃度>肉桂精油質(zhì)量濃度>磷脂與膽固醇質(zhì)量比。如表3所示,兩兩因素之間的相互作用大小依次為:BC>AB>AC。

根據(jù)模型試驗(yàn)結(jié)果,預(yù)測(cè)肉桂精油脂質(zhì)體制備的最佳工藝條件為:磷脂與膽固醇質(zhì)量比為4.09∶1(磷脂質(zhì)量濃度為10.23 mg/mL,膽固醇質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL)、肉桂精油質(zhì)量濃度為2.46 mg/mL、吐溫80質(zhì)量濃度為2.99 mg/mL,此時(shí)理論包埋率為83.01%。為驗(yàn)證該模型的可靠性,通過(guò)3次重復(fù)試驗(yàn),得出的包埋率平均值為81.95%,相對(duì)誤差為1.28%,說(shuō)明理論值與實(shí)際值較為符合。

2.3 肉桂精油脂質(zhì)體的理化性質(zhì)

2.3.1 微觀結(jié)構(gòu)

如圖2所示,肉眼下肉桂精油脂質(zhì)體呈均勻的淡黃色乳液,電鏡下肉桂精油脂質(zhì)體呈亮色的單層囊泡,囊泡周邊均出現(xiàn)一層陰影,分布均勻,這與郭嘉斌等[22]制備的香葉木素脂質(zhì)體形態(tài)結(jié)構(gòu)相似。同時(shí)觀察到存在小囊泡向大囊泡融合的趨勢(shì),可能是脂質(zhì)體囊泡存在熟化行為[23],這使得體系更加穩(wěn)定。

a-外觀;b-微觀形態(tài)圖2 肉桂精油脂質(zhì)體的外觀及微觀形態(tài)Fig.2 Appearance and microscopic morphology of cinnamon essential oil liposomes

2.3.2 粒徑與zeta電位分析

粒徑和zeta電位是衡量脂質(zhì)體膠體穩(wěn)定性的重要指標(biāo)。如圖3所示,肉桂精油脂質(zhì)體粒徑和zeta電位圖均為正態(tài)分布,其平均粒徑為94.21 nm,屬于納米顆粒,與TEM所顯示的尺寸基本一致。但動(dòng)態(tài)光散射(dynamic light scattering,DLS)獲得的脂質(zhì)體粒徑值不是絕對(duì)的,而是表觀粒徑,這是因?yàn)榱脚c布朗運(yùn)動(dòng)有關(guān)[24]。PDI為0.133<0.3,體系分散均勻。張婷等[25]制得蛋清肽脂質(zhì)體平均粒徑為(95.0±0.8) nm,PDI為0.210±0.009,與本結(jié)果相似。通常情況下納米顆粒的zeta電位絕對(duì)值大于30 mV時(shí),被認(rèn)為是穩(wěn)定的,而本研究結(jié)果顯示脂質(zhì)體乳液的zeta電位為-40.4 mV,說(shuō)明脂質(zhì)體表面帶負(fù)電荷,粒子間相互排斥,沒(méi)有絮凝的傾向,較穩(wěn)定。

a-粒徑;b-zeta電位圖3 肉桂精油脂質(zhì)體的粒徑和zeta電位Fig.3 Particle size and zeta potential of cinnamon essential oil liposomes

2.3.3 DSC分析

DSC分析可檢測(cè)脂質(zhì)體的相變溫度和穩(wěn)定性。當(dāng)溫度升高時(shí),脂質(zhì)體膜出現(xiàn)層狀凝膠相、波動(dòng)凝膠相和液晶相等狀態(tài),其中從層狀凝膠態(tài)到波動(dòng)凝膠態(tài)過(guò)程稱(chēng)為預(yù)相變,波動(dòng)凝膠態(tài)到液晶態(tài)過(guò)程稱(chēng)為主相變。由圖4可知,空白脂質(zhì)體在35.48和71.64 ℃處出現(xiàn)了凝膠態(tài)向液晶態(tài)的致熱相變,其中35.48 ℃為預(yù)相變。與空白脂質(zhì)體相比,肉桂精油脂質(zhì)體的相變溫度(32.85、67.51 ℃)分別降低了2.62、4.13 ℃,表明肉桂精油脂質(zhì)體的熱穩(wěn)定性降低,這是由于肉桂精油與脂質(zhì)體的膜材蛋黃卵磷脂的非極性頭部之間發(fā)生了疏水相互作用,降低了雙分子層的致密性和剛性,使得相變溫度降低[26],也可能是肉桂精油中的晶體結(jié)構(gòu)和大小發(fā)生變化形成精油-磷脂復(fù)合物所致[27]。

圖4 差示掃描量熱分析圖Fig.4 Differential scanning calorimetry analysis

2.3.4 FTIR分析

圖5 紅外光譜分析圖Fig.5 Infrared spectrum analysis

2.3.5 體外釋放分析

以PBS作為釋放介質(zhì),模擬作為抑菌劑應(yīng)用場(chǎng)景下的釋放,探究肉桂精油脂質(zhì)體的釋放性能,結(jié)果如圖6所示。肉桂精油脂質(zhì)體在2、24、48、72 h時(shí)的累積釋放度分別為5.13%,50.56%,79.23%,81.24%,說(shuō)明該脂質(zhì)體可以有效控制和減緩精油釋放。然后采用零級(jí)方程、一級(jí)方程和Higuchi方程對(duì)體外釋放數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合,三者得到的擬合結(jié)果分別為Mt=1.207 5t+10.555 5(R2=0.896 9),Mt=92.462 6(1-e-0.034 6t)(R2=0.991 1),Mt=11.989 2t1/2-10.938 0(R2=0.972 8),結(jié)果顯示肉桂精油脂質(zhì)體的體外釋放規(guī)律最符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程。

圖6 肉桂精油脂質(zhì)體的累積釋放曲線Fig.6 Cumulative release curve of cinnamon essential oil liposomes

2.3.6 肉桂精油脂質(zhì)體抑菌性能分析

圖7-a和圖7-b分別是肉桂精油和肉桂精油脂質(zhì)體對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的殺菌作用結(jié)果。大腸桿菌和金黃色葡萄球菌菌懸液的初始濃度值為7.6×107lg CFU/mL。在第0天2種菌懸液濃度與初始濃度相比略有上升,這是由于兩種菌處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期所致。圖7-a顯示肉桂精油對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌具有良好的抑菌效果。2 d后由于精油揮發(fā),細(xì)菌數(shù)分別達(dá)到7.08×107和6.87×107lg CFU/mL,并持續(xù)增長(zhǎng)。而由圖7-b可知,加入肉桂精油脂質(zhì)體后,培養(yǎng)1 d后2種菌的菌落總數(shù)均顯著減少(P<0.05),并且菌落數(shù)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈顯著持續(xù)下降的趨勢(shì),表明肉桂精油從肉桂精油脂質(zhì)體中緩慢釋放出來(lái),對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出長(zhǎng)效抑菌作用。此外,由于革蘭氏陽(yáng)性菌具有特殊的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu),觀察到肉桂精油脂質(zhì)體對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌活性高于大腸桿菌。革蘭氏陰性菌(大腸桿菌)的細(xì)胞壁呈現(xiàn)多層結(jié)構(gòu),其中包括肽聚糖、脂蛋白、磷脂和脂多糖;而革蘭氏陽(yáng)性菌(金黃色葡萄球菌)的細(xì)胞壁僅被肽聚糖層包圍[30],因此肉桂精油脂質(zhì)體釋放的精油很容易穿過(guò)革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁并與其內(nèi)容物相互作用。

a-肉桂精油;b-肉桂精油脂質(zhì)體圖7 肉桂精油和肉桂精油脂質(zhì)體的抑菌性能Fig.7 Bacteriostatic effect of cinnamon essential oil and cinnamon essential oil liposomes

3 結(jié)論

本文以包埋率、平均粒徑為指標(biāo),采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化了肉桂精油脂質(zhì)體的制備工藝。得到最佳工藝參數(shù)為:磷脂與膽固醇質(zhì)量比4.09∶1(磷脂質(zhì)量濃度為10.23 mg/mL,膽固醇質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL),肉桂精油質(zhì)量濃度2.46 mg/mL,吐溫-80質(zhì)量濃度2.99 mg/mL,PBS用量為40 mL(0.01 mol/L,pH 7.2)。在此條件下得到包埋率為81.95%,粒徑為94.21 nm,PDI為0.133,zeta電位為-40.4 mV的肉桂精油脂質(zhì)體。透射電鏡結(jié)果表明其微觀結(jié)構(gòu)呈囊泡狀,分布均勻。通過(guò)熱力學(xué)性質(zhì)和紅外光譜分析證實(shí)肉桂精油成功包封在脂質(zhì)體內(nèi)。此外,體外釋放和抑菌性能研究表明肉桂精油脂質(zhì)體具有控釋抗菌作用,能提高肉桂精油殺菌效果。本研究以肉桂精油為切入點(diǎn),構(gòu)建了脂質(zhì)體運(yùn)載體系,并對(duì)肉桂精油脂質(zhì)體制備工藝關(guān)鍵參數(shù)及其理化性質(zhì)進(jìn)行研究,成功優(yōu)化并建立了一種穩(wěn)定、高效的制備肉桂精油脂質(zhì)體技術(shù),為肉桂精油脂質(zhì)體在食品中的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供技術(shù)參考。