劉墨祎,汪香君,汪洺卉,李迎,劉麗梅

(北華大學(xué) 醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院,吉林 吉林,132013)

人參和西洋參均為五加科人參屬的草本植物,其根、莖等部位均可入藥,藥用價(jià)值極高[1-2]。由于人參和西洋參為人參屬近緣物種,兩者形態(tài)和化學(xué)成分較為相似,因此市場(chǎng)上將兩者摻雜混用現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生[3]。但人參與西洋參在藥性和藥效上存在較大差異:人參性溫,補(bǔ)氣助陽,適合體質(zhì)為寒性的人服用;而西洋參性涼,易于補(bǔ)氣養(yǎng)陰,適合陰虛體質(zhì)或者燥熱的人服用[4-6],兩者在臨床上不可混用。目前國內(nèi)外對(duì)人參和西洋參的檢測(cè)方法包括形態(tài)學(xué)、化學(xué)分析法和分子生物法[7-8],但都易受到外部環(huán)境條件、加工過程和人為主觀因素的影響。因此,急需建立一種簡(jiǎn)單高效的人參和西洋參鑒別方法。

G-四鏈體(G-quadruplex)是由富含鳥嘌呤(G)的DNA或RNA序列形成的一類獨(dú)特的核酸結(jié)構(gòu)[9-10]。G-四鏈體有3種不同的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu),分別為平行式、反平式和混合式[11]。CHENG等[12]研究發(fā)現(xiàn),不同的結(jié)構(gòu)下G-四鏈體的穩(wěn)定性不同,且與氯高鐵血紅素結(jié)合能力也不同[13]。穩(wěn)定的G-四鏈體結(jié)構(gòu)可在K+作用下與氯高鐵血紅素(Hemin)結(jié)合,形成具有類似辣根過氧化物酶活性的模擬酶(DNAzyme),在H2O2存在的條件下催化ABTS由無色變?yōu)榫G色[14]。根據(jù)這一原理已實(shí)現(xiàn)對(duì)金屬離子[15-17]、核酸及蛋白等小分子物質(zhì)[18-19]的檢測(cè)。G-四鏈體形成的具有氧化酶活性的模擬酶(DNAzyme)與酶相比,具有熱穩(wěn)定性、高催化效率、易于制備和修飾等特點(diǎn)[20]。本實(shí)驗(yàn)將PCR技術(shù)與G-四鏈體功能特點(diǎn)結(jié)合,以人參與西洋參基因組DNA上的特異性snp位點(diǎn),設(shè)計(jì)了5′端含有G-四鏈體互補(bǔ)序列的上下游引物,通過PCR擴(kuò)增目標(biāo)序列,獲得大量含G-四鏈體的雙鏈DNA,并形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)的DNAzyme,建立了針對(duì)人參和西洋參的PCR與G-四鏈體聯(lián)用的可視化鑒別方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究中的人參和西洋參樣品均由國家參茸檢驗(yàn)檢測(cè)中心提供;引物,生工生物工程(上海)股份有限公司合成;Premix TaqTM,寶生物工程(大連)有限公司;ABTS、氯高鐵血紅素(Hemin),上海源葉生物科技有限公司;植物基因組DNA提取試劑盒,天根生化科技(北京)有限公司;PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒,北京博邁德基因技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LX-100手掌型離心機(jī),江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司;ETC811型基因擴(kuò)增儀,蘇州東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司;梯度電泳分析儀、酶標(biāo)儀,Bio-Rad公司;凝膠成像分析儀,德國耶拿公司;DNA/蛋白質(zhì)分析儀,Quawell公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 基因組DNA的提取

用植物基因組DNA提取試劑盒提取樣品基因組DNA,DNA濃度通過DNA分析儀檢測(cè)獲得。

1.3.2 引物設(shè)計(jì)

在NCBI上查找人參和西洋參的基因組序列,利用DNAMAN進(jìn)行多序列比對(duì)。發(fā)現(xiàn)人參和西洋參在18S基因上存在snp位點(diǎn),依據(jù)snp位點(diǎn)設(shè)計(jì)出用于特異性識(shí)別和擴(kuò)增人參基因組序列的上下游引物。上游引物序列為:5′-ATAACAATACCGGGCTGATAC-3′;下游引物序列為:5′-GCCAGTTAAGGACAGGAG-3′,并在引物的5′端加上一段G-四鏈體的反向互補(bǔ)序列,修飾后的上游引物序列為:5′-CCCACCCACCCACCCATAACAATACCGGGCTGATAC-3′;修飾后的下游引物序列為:5′-CCCACCCACCCACCCGCCAGTTAAGGACAGGAG-3′,其中5′-CCCACCCACCCACCC-3′為G-四鏈體序列[(G3T)3G3]的反向互補(bǔ),在K+的存在下可形成平行的G-四鏈體結(jié)構(gòu),且穩(wěn)定性好,可視化反應(yīng)結(jié)果明顯[21]。

1.3.3 PCR反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化

以人參和西洋參的基因組DNA為模版進(jìn)行PCR反應(yīng)體系和條件的優(yōu)化。首先在無模版的體系下進(jìn)行PCR,檢測(cè)1、2、3、4、5、6、8、10 μmol/L引物濃度下引物二聚體的形成對(duì)G-四鏈體顯色反應(yīng)的影響;然后進(jìn)行引物濃度與模版濃度之間的優(yōu)化,引物濃度梯度設(shè)置為2、4、6、10 μmol/L,模版濃度梯度為0.001、0.01、0.1、1、10 ng/μL;最后確定最適的PCR退火溫度,退火溫度梯度設(shè)置為54、58、62、66、70 ℃。

最終對(duì)比PCR和顯色結(jié)果確定反應(yīng)體系:10 μL Premix TaqTMDNA聚合酶,4 μL DNA(10 ng/μL)模版,1 μL上下游引物(10 μmol/L),加雙蒸水至20 μL。PCR擴(kuò)增條件:95 ℃預(yù)變性5 min,95 ℃變性25 s,54 ℃退火25 s,72 ℃延伸25 s,72 ℃延伸5 min,30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳(120V,40 min)進(jìn)行鑒定,利用凝膠成像系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行觀察分析。

1.3.4 可視化反應(yīng)體系的優(yōu)化

將用DNA純化回收試劑盒回收得到的PCR產(chǎn)物加入20 μL結(jié)合緩沖液(25 mmol/L HEPES pH 7.4、20 mmol/L KCl、200 mmol/L NaCl、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.05% Triton X-100、體積分?jǐn)?shù)1%的DMSO與2 μL不同終點(diǎn)濃度Hemin溶液充分混勻,終濃度梯度為0.005、0.01、0.1、0.5、1 mmol/L。95 ℃孵育5 min完成G-四鏈體的折疊。之后4 ℃孵育8 min,使G-四鏈體與Hemin充分結(jié)合。加入20 μL不同終點(diǎn)濃度的ABTS,終濃度梯度為3、10、30、45、60 mmol/L,以及2 μL H2O2(3%)室溫避光反應(yīng)至變色,酶標(biāo)儀測(cè)定420 nm處的吸光度值,選擇最優(yōu)的可視化結(jié)果進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 特異性檢測(cè)

為驗(yàn)證特異性,分別對(duì)4組人參樣品和4組西洋參樣品的基因組DNA進(jìn)行提取。按照優(yōu)化后的反應(yīng)條件和最適體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增與G-四鏈體聯(lián)用可視化檢測(cè),測(cè)定420 nm處的吸光值,驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)方法的特異性。

1.3.6 靈敏度檢測(cè)

將提取的人參基因組DNA進(jìn)行稀釋,濃度梯度為:0.001、0.01、0.1、1、10 ng/μL,根據(jù)已優(yōu)化好的反應(yīng)條件和最適體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增與G-四鏈體聯(lián)用可視化檢測(cè),測(cè)定420 nm處的吸光值,以檢測(cè)本實(shí)驗(yàn)方法的靈敏度。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)處理采用Excel,柱狀圖和折線圖的繪制采用GraphPad Prism8,并采用Adobe Photoshop軟件對(duì)圖片進(jìn)行組合排列。每組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR反應(yīng)體系以及條件的優(yōu)化

2.1.1 無模版情況下引物濃度對(duì)可視化顯色效果的影響

和普通PCR引物不同,本實(shí)驗(yàn)在PCR上下游引物的5′端加入了G-四鏈體反向互補(bǔ)序列進(jìn)行修飾,這樣可能會(huì)導(dǎo)致引物二聚體更易形成,并干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。為了排除這一干擾因素,將引物稀釋為1、2、3、4、5、6、8、10 μmol/L的梯度濃度,對(duì)其進(jìn)行G-四鏈體與PCR聯(lián)用可視化檢測(cè)。由圖1-a可知,在不同引物濃度下,無模版的PCR體系在擴(kuò)增后未產(chǎn)生目的條帶,且引物濃度與引物二聚體的增加成正比;由圖1-b可知,引物濃度對(duì)顯色反應(yīng)無明顯影響,且在420 nm下吸光度值之間無明顯差異。因此,無模版情況下引物濃度對(duì)G-四鏈體與PCR聯(lián)用可視化顯色效果沒有明顯影響。

a-PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖;b-G-四鏈體可視化檢測(cè)顯色效果和420 nm處吸光值圖1 無模版PCR體系里引物濃度對(duì)G-四鏈體顯色反應(yīng)的影響Fig.1 Effect of primer concentrations in a PCR reaction system without templates on the G-quadruplex colorings reaction注:M-Marker DL2000;1～8分別為1、2、3、4、5、6、8、10 μmol/L。

2.1.2 PCR體系中引物濃度對(duì)模版DNA濃度的優(yōu)化

根據(jù)PCR擴(kuò)增的原理,在模版濃度不變時(shí),引物濃度增加會(huì)導(dǎo)致PCR產(chǎn)物的增加,反之亦然。所以找到最適的引物濃度與其相對(duì)應(yīng)的最適模版濃度對(duì)PCR反應(yīng)的優(yōu)化尤為重要。從圖2可以看出,當(dāng)引物濃度為10 μmol/L時(shí),可檢測(cè)出最低濃度為0.1 ng/μL的模版,因此選擇引物濃度為10 μmol/L作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的引物濃度。且在此引物濃度下,模版濃度為10 ng/μL時(shí),電泳圖的目的條帶最為明顯,所以選擇模版濃度為10 ng/μL進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

a-2 μmol/L;b-4 μmol/L;c-6 μmol/L;d-10 μmol/L圖2 PCR反應(yīng)體系中引物濃度與模版濃度之間的優(yōu)化Fig.2 Optimization of the ratio of primer to template in a PCR reaction system注:M-Marker DL2000;1-陰性對(duì)照;2～6為0.001、0.01、0.1、1、10 ng/μL

2.1.3 PCR反應(yīng)退火溫度的優(yōu)化

退火溫度也是PCR反應(yīng)中重要的影響因素,退火溫度的高低會(huì)影響PCR產(chǎn)物的產(chǎn)生,找到最適合反應(yīng)體系的退火溫度至關(guān)重要。在以上優(yōu)化條件的基礎(chǔ)上將退火溫度梯度設(shè)置為54、58、62、66、70 ℃,觀察反應(yīng)結(jié)果。圖3為退火溫度為54、58、62、66、70 ℃下PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖,可見退火溫度為54 ℃時(shí),條帶最明顯,因此選擇退火溫度為54 ℃進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 PCR反應(yīng)退火溫度的優(yōu)化Fig.3 Optimization of PCR reaction annealing temperature注:M-Marker DL2000;1-陰性對(duì)照;2-54 ℃人參PCR產(chǎn)物;3-54 ℃西洋參PCR產(chǎn)物;4-58 ℃人參PCR產(chǎn)物;5-58 ℃西洋參PCR產(chǎn)物;6-62 ℃人參PCR產(chǎn)物;7-62 ℃西洋參PCR產(chǎn)物;8-66 ℃人參PCR產(chǎn)物;9-66 ℃西洋參PCR產(chǎn)物;10-70 ℃人參PCR產(chǎn)物;11-70 ℃西洋參PCR產(chǎn)物

2.2 可視化反應(yīng)體系的優(yōu)化

2.2.1 Hemin終濃度的優(yōu)化

將反應(yīng)體系中的Hemin終濃度設(shè)置為0.005、0.01、0.1、0.5、1 mmol/L進(jìn)行反應(yīng),對(duì)比顯色結(jié)果得到最適的Hemin濃度。如圖4-a可見,在420 nm處隨著Hemin濃度的增高,人參PCR產(chǎn)物吸光度值不斷增加,當(dāng)濃度>0.5 mmol/L時(shí)增加較少,說明G-四鏈體產(chǎn)生的量趨于飽和。且觀察對(duì)比圖4-a中人參組與西洋參組的顯色變化,在Hemin濃度為0.5 mmol/L時(shí)有明顯差異,所以Hemin終濃度定為0.5 mmol/L。

a-Hemin濃度;b-ABTS濃度圖4 Hemin濃度、ABTS濃度的優(yōu)化Fig.4 Optimization of Hemin and ABTS concentration

2.2.2 ABTS終濃度的優(yōu)化

將反應(yīng)體系中的ABTS終濃度設(shè)置為3、10、30、45、60 mmol/L進(jìn)行反應(yīng),對(duì)比顯色結(jié)果得到最適的ABTS濃度。如圖4-b可見隨著ABTS濃度的增加,在420 nm處人參PCR產(chǎn)物的吸光度值先是上升,到達(dá)30 mmol/L濃度時(shí)開始下降,且觀察對(duì)比圖4-b中人參組與西洋參組的顯色變化,在ABTS濃度為30 mmol/L時(shí)顯色有明顯差異,所以ABTS終濃度選擇為30 mmol/L。

2.3 特異性檢測(cè)

按照已優(yōu)化好的反應(yīng)體系,將4組人參樣品和4組西洋參樣品的基因組DNA作為模板,進(jìn)行PCR反應(yīng),再對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行G-四鏈體顯色反應(yīng)。如圖5可見4組含有人參基因組DNA的反應(yīng)體系均有明顯的顏色變化,且4組含有西洋參基因組DNA的反應(yīng)體系無明顯顏色變化;在420 nm處的吸光度值對(duì)比,人參組和西洋參組也有明顯差異。因此表明本實(shí)驗(yàn)的PCR與G-四鏈體聯(lián)用可視化鑒別人參與西洋參的方法具有很高特異性。

圖5 特異性檢測(cè)Fig.5 Detection of specificity注:1～4為人參樣品;5～8為西洋參樣品

2.4 靈敏度檢測(cè)

根據(jù)已優(yōu)化好的體系,分別將濃度為0.1、0.5、1、5、10 ng/μL的人參基因組DNA作為模板,進(jìn)行PCR反應(yīng),對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行G-四鏈體顯色。如圖6可知,含有1、5、10 ng/μL濃度人參基因組DNA的反應(yīng)體系顯色反應(yīng)有變化,且在420 nm處的吸光度值與空白對(duì)照有明顯差異;而含有0.1、0.5 ng/μL人參基因組DNA的反應(yīng)體系顯色反應(yīng)沒有明顯變化,在420 nm處吸光度值與空白對(duì)照無明顯差異。所以當(dāng)樣品中含有1 ng/μL的人參基因組DNA時(shí),即可通過本實(shí)驗(yàn)的G-四鏈體與PCR聯(lián)用可視化方法鑒別檢測(cè)。

圖6 靈敏度的檢測(cè)Fig.6 Sensitivity detection

3 討論

近年來隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,人參與西洋參的鑒別方法也在逐漸進(jìn)步,越來越多的現(xiàn)代生物技術(shù)被應(yīng)用到其中[22],包括DNA條形碼鑒定[23]、DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù)[24]、蛋白質(zhì)指紋圖譜分子鑒定技術(shù)等[25]。但都存在著不同的缺點(diǎn),無法做到簡(jiǎn)便快速地鑒別人參與西洋參。G-四鏈體作為一種具有氧化酶活性的模擬酶,具有熱穩(wěn)定性、催化效率高,易于制備和修飾等優(yōu)勢(shì)[20],已被廣泛用于核酸、蛋白或小分子的檢測(cè)中,且檢測(cè)效率高、特異性強(qiáng),適用于現(xiàn)場(chǎng)的快速檢測(cè)[26-27]。但目前G-四鏈體的研究和應(yīng)用還存在一定的局限性,例如,在金屬離子的檢測(cè)中,所能檢測(cè)的金屬離子種類過少;比色傳感器中,可用顯色底物只有幾種;缺乏對(duì)優(yōu)化傳感系統(tǒng)和消除基質(zhì)效應(yīng)的研究等。在以后研究中如能更好地優(yōu)化和發(fā)揮G-四鏈體的作用,可將其應(yīng)用到更廣泛的領(lǐng)域中去。

PCR作為一種核酸擴(kuò)增技術(shù),可通過變性、退火、延伸組成的多個(gè)循環(huán)反應(yīng)使模版序列以指數(shù)倍擴(kuò)增,在核酸檢測(cè)領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用。傳統(tǒng)的PCR結(jié)果分析一般采用瓊脂凝膠電泳技術(shù),但存在操作復(fù)雜、結(jié)果無法直接觀察等缺點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)將G-四鏈體與PCR技術(shù)的優(yōu)勢(shì)相結(jié)合,設(shè)計(jì)了5′端含有G-四鏈體反向互補(bǔ)序列的PCR引物,通過對(duì)目的序列的擴(kuò)增產(chǎn)生大量的G-四鏈體序列,最后G-四鏈體催化底物顯色使PCR結(jié)果可在肉眼下直接觀察。

綜上所述,通過將G-四鏈體與核酸擴(kuò)增技術(shù)相結(jié)合,我們建立了一種可視化鑒別人參與西洋參的方法,相較于目前已有的人參和西洋參的鑒別方法,耗時(shí)更短、靈敏度更高、成本更加低廉。且PCR的引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單,使該方法更易于普及。但對(duì)于參類產(chǎn)品的鑒定中,相比于實(shí)驗(yàn)樣品DNA的提取效率可能會(huì)更低,顯色結(jié)果顏色更淺,肉眼比色鑒定時(shí)靈敏度可能會(huì)變低;顯色反應(yīng)時(shí)ABTS變色的時(shí)間沒有明確的標(biāo)準(zhǔn),需要時(shí)刻進(jìn)行觀察;G-四鏈體在反應(yīng)中生成的效率也會(huì)受到結(jié)合緩沖液pH、陽離子、溫度等因素的影響,對(duì)實(shí)驗(yàn)的操作環(huán)境要求較高。

4 結(jié)論

目前,利用G-四鏈體與PCR聯(lián)用鑒別人參與西洋參的相關(guān)研究尚未報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)所建立的針對(duì)人參與西洋參的 PCR與G-四鏈體聯(lián)用的可視化鑒別方法,相比于其他生物技術(shù)鑒別方法,無需測(cè)序和電泳,在室溫下便可用肉眼直接觀察結(jié)果。含有人參基因組DNA的樣品,在引物作用下通過PCR擴(kuò)增,獲得大量含G-四鏈體的雙鏈DNA,并形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)的模擬酶,催化ABTS顯色。

在本實(shí)驗(yàn)中G-四鏈體的形成是最后達(dá)到可視化鑒別的關(guān)鍵,所以如何設(shè)計(jì)適合的引物使G-四鏈體更好地形成是本實(shí)驗(yàn)的重點(diǎn)。G-四鏈體具有多種拓?fù)浣Y(jié)構(gòu),包括平行結(jié)構(gòu)、反平行結(jié)構(gòu)和雜合結(jié)構(gòu)等[26]。不同序列的G-四鏈體其結(jié)構(gòu)和DNAzyme活性都不同,根據(jù)現(xiàn)有的對(duì)G-四鏈體結(jié)構(gòu)與DNAzyme活性的研究結(jié)果[21],本實(shí)驗(yàn)選擇的G-四鏈體序列為[(G3T)3G3],可形成平行的G-四鏈體結(jié)構(gòu),且穩(wěn)定性好,具有較高的過氧化物酶活性。

本實(shí)驗(yàn)針對(duì)人參與西洋參基因組DNA,將PCR技術(shù)與G-四鏈體功能特點(diǎn)結(jié)合,建立了鑒別人參和西洋參的PCR與G-四鏈體聯(lián)用的可視化鑒別方法,靈敏度可達(dá)0.1 ng/μL。且該方法具有穩(wěn)定性好、操作簡(jiǎn)便、便于觀察等優(yōu)點(diǎn),為中藥材鑒定提供了新的思路。